CN1432428A - 反应液的搅拌方法 - Google Patents

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Abstract

提供能有效地搅拌微小容器内反应液的方法，其为对存在与前述反应液中的磁粒从前述反应容器外部给予磁场变化，以此来搅拌反应液的方法。

Description

反应液的搅拌方法
技术领域
本发明涉及搅拌微小反应容器内反应液的方法。
背景技术
由于近年来有不少人致力于DNA芯片或DNA微合金事业，所以人们期待着可以比较容易地得到DNA芯片或DNA微合金、并可在基因诊断等领域广泛使用。DNA芯片或DNA微合金是在玻璃片(スライドガラス)或硅等基板上高密度地配置几千至几万个作为标记的DNA(探针DNA)而成，将它们浸渍或撒向需检测DNA(靶DNA)溶液中，使其杂交。对于杂交，虽然有一部分自动化装置出现，但是从稳定性、高价等方面考虑手动杂交依然被广泛使用着。
发明概述
为了使靶DNA杂交到DNA芯片或DNA微合金上，必须将含有靶DNA的几～几十μL样品滴到DNA芯片或DNA微合金上、玻璃罩盖着放置几个小时。为了得到可信的杂交结果，靶DNA必须能够以可能杂交的状态接近DNA芯片或DNA微合金上的探针DNA。可是由于液体量是微量的，所以液体的搅拌并不容易，在不搅拌的情况下，完成杂交需要18～24小时，即使是使用具有搅拌功能的市售的杂交仪器，完成杂交也需要4小时左右。此外，市售的具有搅拌功能的杂交仪器必须要求100～400μL的样品液体量。而且市售的具有搅拌功能的杂交仪器具有结构复杂、高价的缺点。
此外，在手动杂交时，有时会由于杂交不良而得不到重现性好的数据，此外由于操作者不同，也会引起结果分散。随着DNA芯片或DNA微合金的日益普及，希望开发出诸如在使靶DNA在DNA芯片或DNA微合金上杂交时可以有效地搅拌微小容器内反应液的方法。
因此，本发明的目的在于，提供可以有效搅拌微小容器内反应液的方法。
解决上述课题的本发明如下所述。
1.搅拌微小反应容器内反应液的方法，其中从反应容器外部对所述反应液中所含的磁粒实施磁场变化，以此来搅拌反应液。
2.根据前述的方法，其中磁场变化是通过将放置在反应容器外部的多个的电磁石顺次励磁或通过永久磁石的移动来进行的。
3.根据前述1或2的方法，其中微小反应容器为DNA芯片或DNA微合金的杂交容器。
4.根据前述1～3中任意一项的方法，其中微小反应容器内部的厚度为0.1mm～1mm的范围，磁粒的直径为前述厚度的0.1～20％范围。
5.根据前述1～4中任意一项的方法，其中微小反应容器的容量为10～1000μL的范围。
6.根据前述1～5中任意一项的方法，其中使用的磁粒为反应液量的0.1～10容量％范围。
发明详述
本发明是搅拌微小反应容器内反应液的方法，其特征在于从反应容器外部对所述反应液中所含的磁粒实施磁场变化，以此来搅拌反应液。
本发明中的微小反应容器可以是例如DNA芯片或DNA微合金的杂交容器。不过微小反应容器并不限于杂交容器。
微小反应容器，例如容量可以为10～1000μL的范围，优选100～300μL的范围。此外杂交容器等的情况下，微小反应容器可以由在相对的2个片(例如玻璃片)之间形成间隔、且在片之间可封入反应液的间隔构件(例如，O环(○リング))构成。此时，微小反应容器内部的厚度(即，相当于间隔构件的厚度)可以为例如0.1mm～1mm的范围。
构成上述微小反应容器的2个片的至少一方可以为在其表面固定了DNA的DNA芯片或DNA微合金。此外，反应液可以为含有靶DNA的杂交溶液。
本发明的方法中，将反应液和磁粒封入上述微小反应容器中，从反应容器外部给予磁场变化，以此搅拌反应液。从使磁粒容易流动且使反应液的搅拌能有效进行的观点考虑，磁粒的直径为上述微小反应容器厚度的0.1～20％的范围是适当，优选为1～10％的范围。具体地，磁粒的直径可以为0.001～0.1mm的范围。此外，磁粒可以使用直径一致的，也可以根据需要使用直径不一致的磁粒。使用磁粒的种类可以根据反应种类适当选择。
不过，为了避免与反应液所合成分或固定在片上的成分发生不希望的反应，磁粒优选为表面用难以与这些成分反应的树脂(例如聚丙烯)等处理过的磁粒。
此外，从使磁粒容易流动且有效进行反应液搅拌的方面考虑，磁粒的量为反应液量的0.1～20容量％的范围是适当的，优选为1～10容量％的范围。
为了使磁粒流动的磁场变化可以通过顺次励磁置于反应容器外部的几个电磁石或移动永久磁石来进行。
根据图1说明通过从反应容器外部实施磁场变化使磁粒在反应液内移动从而搅拌反应液的情况。
图1为实施本发明方法的杂交工作站的概图。上图为平面图、下图为侧面图。杂交工作站10由玻璃片11(例如DNA被阵列化的玻璃片)、与玻璃片11相对着放置的、埋置了至少一个电磁石13的盖片12、使玻璃片11与盖片12之间保持间隔的间隔构件O环14、向反应容器15的注入口16、排出口17、热电微型组件(サ一モモジユル)18构成。反应容器15由玻璃片11、盖片12和O环14构成，其范围为约20mm×60mm、厚度为约0.2mm、容量为约250μL。
含有磁粒20的一定量(250μL)反应液由注入口16注入到反应容器15中。如图1所示，多个的电磁石13在盖片中被围绕地配置(埋置)在玻璃片11上方。反应液注入完成后，顺次励磁多个的电磁石13，与此相伴，磁粒沿着围绕放置的电磁石13移动。随着反应液中磁石的移动(流动)反应液也进行旋转和搅拌。
此状态如2所示。图2中电磁石13被从左向右顺次励磁，磁粒20被经励磁的电磁石所吸引，随着经励磁的电磁石的移动，磁粒20也从左向右顺次移动。
图1中，将多个的电磁石13围绕着玻璃片11地在其上配置(埋置)于盖片12中，除了围绕地配置以外，例如还可以使从玻璃片11的长方向的一端向另一端成直线地配置在盖片12中，或者呈折形配置。此外上例中用电磁石来使磁粒移动，还可以使用除了电磁石以外的方法例如永久磁石。
由磁粒的移动(流动)进行的反应液的搅拌过程中，反应液的温度可以使用热电微型组件18调整为适于反应的温度。对于反应液的温度，杂交的情况下例如可以为常温～90℃。此外，反应时间可以根据反应种类做相应的决定。不过本发明方法由于即使对微小量的反应液也可以更有效地搅拌，因此可以缩短反应时间。
反应完成后，反应液由排出口17排出，对反应容器内进行洗净和干燥。当玻璃片11为DNA芯片和DNA微合金时，回收玻璃片11，接着进行杂交的检出操作(例如为了检出已杂交的DNA的荧光分析等)。此外，与反应液一起被回收的磁粒，被从反应液中分离、洗净和干燥后，可以再次使用。
虽然上述图1中显示了一个反应容器，但本发明方法所使用的装置也可以为具备多个反应容器和向反应容器供给反应液、洗净液的设备(反应液容器、洗净液容器、送液管以及泵等)以及回收废液和磁粒的设备(废液容器、磁粒回收容器、送液管以及泵等)的复合装置。参见图3。图3所示的装置具备10个反应容器15。
[实施例]
下面用实施例对本发明进行详细的说明。
方案
1.将压印(スタンプ)了下述探针的玻璃片(DNA微合金)如图1所示地放置在杂交箱中在65℃加热。对于玻璃片上的DNA的压印，一个点的直径约为100～150μm、且在一个玻璃片上形成441个点。
2.加热后，向玻璃片上注入下述靶溶液(350μL)。
3.然后加热(杂交)16小时。在实施例(有搅拌)中，在加热过程中在杂交箱上部通过使永久磁石来回运动来使溶液中的磁粒移动，从而搅拌溶液。搅拌速度为5mm/s。比较例(无搅拌)中除了不实施永久磁石的来回运动外，其他与实施例同样操作。
4.16小时后，依次使用2×SSC、1×SSC、0.2×SSC洗净玻璃片。
5.用公知的方法进行扫描分析(数值化)。结果示于图4。
探针、靶的成分和浓度
1.探针(压印浓度)
Cy3-gapdh  in 1×PBS浓度    308ng/μl
表1
2.靶
                浓度      有搅拌      无搅拌      最终浓度
Cy5-dUTP-gapdh  254ng/μl  1.93        1.93       1.4ng/μ1
20×SSC                    42.5        52.5       3×SSC
yeast tRNA      10μg/l    35          35         1μg/μl
10×blocking solution      35          35         1×b.s.
10％SDS                    7           7          0.2％SDS
在20×SSC中的磁粒          10          ------
DW                         218.57      218.57
合计                       350μl      350μl
*在20×SSC中的磁粒：磁粒 0.05g+20×SSC 1000μl
杂交时对靶溶液进行粒搅拌和未进行粒搅拌的情况下已杂交的靶强度与探针强度之比如图4所示。未进行粒搅拌的情况其为0.052(比)，而进行了粒搅拌的则为0.111(比)。即，cDNA微合金中由于使用磁粒搅拌法(反应液的搅拌方法)(实施例)，与未搅拌(比较例)地进行杂交的情况相比，尽管靶DNA溶液浓度相同，但由于有促进杂交的效果(搅拌效果)故可得到高灵敏度、均一的杂交信号。
根据本发明方法，在诸如使靶DNA在DNA芯片或DNA微合金上杂交的情况，可以有效地搅拌微小容器内的反应液。特别是，使靶DNA在DNA芯片或DNA微合金上杂交的情况，可以在较短的时间得到稳定的杂交结果。
附图简单说明
图1为实施本发明方法的杂交工作站的概图。
图2为本发明中由磁粒搅拌的想象图。
图3为实施本发明的设置了多个微小容器的杂交工作站。
图4为实施例中杂交实验的结果。
符号说明
10    杂交工作站
11    玻璃片11
12    盖片
13    电磁石
14    O环
15    反应容器
16    注入口
17    排出口
18    热电微型组件
20    磁粒

Claims (6)

1.搅拌反应液的方法，其为搅拌微小反应容器内反应液的方法，其中从反应容器外部对所述反应液中所含的磁粒进行磁场变化，以此来搅拌反应液。
2.根据权利要求1的方法，其中磁场变化是通过将放置在反应容器外部的多个的电磁石顺次励磁或通过永久磁石的移动来进行的。
3.根据权利要求1或2的方法，其中微小反应容器为DNA芯片或DNA微合金的杂交容器。
4.根据权利要求1～3中任意一项的方法，其中微小反应容器内部的厚度为0.1mm～1mm的范围，磁粒的直径为前述厚度的0.1～20％范围。
5.根据权利要求1～4中任意一项的方法，其中微小反应容器的容量为10～1000μL的范围。
6.根据权利要求1～5中任意一项的方法，其中使用的磁粒为反应液量的0.1～10容量％范围。
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