CN104288123A - 一种负载干扰素微胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载干扰素微胶囊的制备方法，步骤如下：A)将Na₂CO₃和Ca(NO₃)₂·4H₂O分别配制成溶液；取Ca(NO₃)₂溶液加入α型干扰素；B)往溶液中Na₂CO₃溶液，超声后用离心法收集，洗涤干燥得到微胶囊模板；C)取微粒水洗三次，每次洗涤后离心去上清；将牛血清白蛋白加入到CaCO₃模板中，形成牛血清白蛋白层；D)向步骤C)中CaCO₃模板粒子表面的牛血清白蛋白层加入交联剂交联后离心去上清，水洗三次；E)将此核壳结构的胶体微粒用pH为7、0.02M的EDTA去核，彻底除去碳酸钙；F)往微胶囊中加入NaBH₄溶液，室温下反应后离心去上清，水洗三次，得到负载干扰素的牛血清白蛋微胶囊。本发明根据细胞内外环境不同，设计构建出一种在细胞外保持稳定，在细胞内响应刺激作用下可以降解的微胶囊。

Description

一种负载干扰素微胶囊的制备方法

技术领域

 本发明涉及生物医用领域，尤其是一种负载干扰素智能可降解的微胶囊的制备方法。

背景技术

乙型肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的一种严重传染性疾病，也是导致肝癌的一种重要致病因素。全世界有3.5-4亿的乙肝病毒患者，其中约有三分之一为中国患者，每年，大约有三十万人死于HBV感染相关的疾病，其中十八万人死于肝癌。当前，针对治疗HBV感染的药物主要分为两类：抗病毒类药物（核苷类似物）和免疫调节药物（干扰素）。其中干扰素（IFN）是一种具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，在同种细胞上具有广谱的抗病毒，影响细胞生长分化以及调节免疫功能等多种生物活性。该药物一方面通过抗病素蛋白（AVP）导致mRNA裂解，组织HBV复制与繁殖；另一方面可以诱导受感染肝细胞膜I类MHC抗原表达，促进Tc（细胞毒性T细胞）细胞的识别和杀伤效应，在人类HBV感染的治疗中表现出良好的疗效。但是普通干扰素具有分子量小，半衰期短，系统分布广以及肾脏清除率高等缺点，从而容易产生抗药性和其他毒副作用。因此，如何增加干扰素的半衰期，对其药物组分进行保护进而增加其在细胞内的驻留时间，改变药物代谢动力学特点，缩小体内血药峰谷浓度差，减少不良反应等问题需要解决。

传统的微胶囊制备方法主要可分为物理法，化学法与物理化学法三大类。其中物理法利用机械或其他物理作用形成囊壁；化学法主要利用单体发生聚合反应，形成高分子材料来将芯材包裹；物理化学法则是通过改变条件使得溶解状态的成膜物质从溶液中凝聚出来，并包埋芯材形成微胶囊结构。目前，有关细胞内可降解微胶囊的技术探究很少，主要侧重于胶囊材料的选择，构建和包埋物的释放等。因此，如何制备一种具有可降解的，且负载干扰素智能可降解的微胶囊对生物医用领域很有意义。 

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种负载干扰素智能可降解的微胶囊的制备方法，该层层组装法制备微胶囊，具有尺寸和形状可控，壁厚和组成可调以及表面易修饰和功能化等优点。

本发明所采用的技术方案是：一种负载干扰素微胶囊的制备方法，其特征在于采取以下步骤：

A)将Na₂CO₃和Ca(NO₃)₂·4H₂O分别配制成浓度为0.05 mol/L的溶液；取200-400mL Ca(NO₃)₂溶液，倒入烧杯中；再往烧杯中加入100mL的α型干扰素，搅拌均匀后静置15 min；

B)往步骤A)所得的溶液中迅速加入200-400mL Na₂CO₃溶液，超声10s，静置15min，即得到内含干扰素的碳酸钙胶体微粒；将所得碳酸钙胶体微粒用离心法或膜过滤法快速收集，无水乙醇洗涤三次，在50℃烘箱中干燥，贮存备用,即得到微胶囊CaCO₃模板；

C)取300mg的碳酸钙胶体微粒置于15mL离心管中，期间轻微振荡离心管使碳酸钙微粒分散，用去离子水洗涤三次，每次洗涤后以3000 r/min的速度离心1 min，除去上清液；将8-10g牛血清白蛋白中滴加4-5滴无水乙醇降低其溶解度,加入到CaCO₃模板中，使其析出并自发沉积到CaCO₃模板粒子表面，形成牛血清白蛋白层；

D)向步骤C)中CaCO₃模板粒子表面的牛血清白蛋白层加入0.01-0.02g二硫代二丙酸交联剂，使微粒重新分散，在轻微振荡的条件下交联15min，然后3000 r/min下离心1min，去上清，水洗三次；在负载干扰素的碳酸钙胶体微粒的微粒表面进行交联，最后得到核壳结构的胶体微粒；

E)将此核壳结构的胶体微粒用pH为7、0.02M的EDTA去核，反应30 min，然后在 5000 r/min离心3min，除去上清；重复此步骤5次,彻底除去碳酸钙；

F)往微胶囊中加入10mL的0.1mg/mL的NaBH₄溶液，室温下反应4 h，然后在3000 r/min下离心1 min，弃去上清，水洗三次，得到负载干扰素的牛血清白蛋微胶囊。

本发明根据细胞内外环境不同，致力于设计构建一种在细胞外保持稳定，在细胞内响应刺激作用下可以降解的微胶囊。研究该胶囊对抗乙肝病毒干扰素的负载和控制释放，为微胶囊在乙型肝炎诊疗中的应用提供理论依据。本发明与现有技术相比，具有有益的效果是：1）该层层组装法制备微胶囊，具有尺寸和形状可控；2）壁厚和组成可调；3）表面易修饰和功能化；4）建立一种负载干扰素，兼具靶向识别，可生物降解的微胶囊智能载药体系。

具体实施方式

下面结合实施本发明作进一步说明：

实施例1：采取以下步骤：

A)将Na₂CO₃和Ca(NO₃)₂·4H₂O分别配制成浓度为0.05 mol/L的溶液；取400mL Ca(NO₃)₂溶液，倒入烧杯中；再往烧杯中加入100mL的α型干扰素，搅拌均匀后静置15 min；

B)往步骤A)所得的溶液中迅速加入400mL Na₂CO₃溶液，超声10s，静置15min，即得到内含干扰素的碳酸钙胶体微粒；将所得碳酸钙胶体微粒用离心法或膜过滤法快速收集，无水乙醇洗涤三次，在50℃烘箱中干燥，贮存备用,即得到微胶囊CaCO₃模板；

C)取300mg的碳酸钙胶体微粒置于15mL离心管中，期间轻微振荡离心管使碳酸钙微粒分散，用去离子水洗涤三次，每次洗涤后以3000 r/min的速度离心1 min，除去上清液；将10g牛血清白蛋白中滴加5滴无水乙醇降低其溶解度,加入到CaCO₃模板中，使其析出并自发沉积到CaCO₃模板粒子表面，形成牛血清白蛋白层；

D) 向步骤C)中CaCO₃模板粒子表面的牛血清白蛋白层加入0.02g二硫代二丙酸交联剂，使微粒重新分散，在轻微振荡的条件下交联15min，然后3000 r/min下离心1min，去上清，水洗三次；在负载干扰素的碳酸钙胶体微粒的微粒表面进行交联，最后得到核壳结构的胶体微粒；

E)将此核壳结构的胶体微粒用pH为7、0.02M的EDTA去核，反应30 min，然后在 5000 r/min离心3min，除去上清；重复此步骤5次,彻底除去碳酸钙；

F)往微胶囊中加入10mL的0.1mg/mL的NaBH₄溶液，室温下反应4 h，然后在3000 r/min下离心1 min，弃去上清，水洗三次，得到负载干扰素的牛血清白蛋微胶囊。

实施例2: 采取以下步骤：

A)将Na₂CO₃和Ca(NO₃)₂·4H₂O分别配制成浓度为0.05 mol/L的溶液；取300mL Ca(NO₃)₂溶液，倒入烧杯中；再往烧杯中加入100mL的α型干扰素，搅拌均匀后静置15 min；

B)往步骤A)所得的溶液中迅速加入300mL Na₂CO₃溶液，超声10s，静置15min，即得到内含干扰素的碳酸钙胶体微粒；将所得碳酸钙胶体微粒用离心法或膜过滤法快速收集，无水乙醇洗涤三次，在50℃烘箱中干燥，贮存备用,即得到微胶囊CaCO₃模板；

C)取300mg的碳酸钙胶体微粒置于15mL离心管中，期间轻微振荡离心管使碳酸钙微粒分散，用去离子水洗涤三次，每次洗涤后以3000 r/min的速度离心1 min，除去上清液；将9g牛血清白蛋白中滴加5滴无水乙醇降低其溶解度,加入到CaCO₃模板中，使其析出并自发沉积到CaCO₃模板粒子表面，形成牛血清白蛋白层；

D)向步骤C)中CaCO₃模板粒子表面的牛血清白蛋白层加入0.01g二硫代二丙酸交联剂，使微粒重新分散，在轻微振荡的条件下交联15min，然后3000 r/min下离心1min，去上清，水洗三次；在负载干扰素的碳酸钙胶体微粒的微粒表面进行交联，最后得到核壳结构的胶体微粒；

E)将此核壳结构的胶体微粒用pH为7、0.02M的EDTA去核，反应30 min，然后在 5000 r/min离心3min，除去上清；重复此步骤5次,彻底除去碳酸钙；

F)往微胶囊中加入10mL的0.1mg/mL的NaBH₄溶液，室温下反应4 h，然后在3000 r/min下离心1 min，弃去上清，水洗三次，得到负载干扰素的牛血清白蛋微胶囊。

实施例3: 采取以下步骤：

A)将Na₂CO₃和Ca(NO₃)₂·4H₂O分别配制成浓度为0.05 mol/L的溶液；取200mL Ca(NO₃)₂溶液，倒入烧杯中；再往烧杯中加入100mL的α型干扰素，搅拌均匀后静置15 min；

B)往步骤A)所得的溶液中迅速加入200mL Na₂CO₃溶液，超声10s，静置15min，即得到内含干扰素的碳酸钙胶体微粒；将所得碳酸钙胶体微粒用离心法或膜过滤法快速收集，无水乙醇洗涤三次，在50℃烘箱中干燥，贮存备用,即得到微胶囊CaCO₃模板；

C)取300mg的碳酸钙胶体微粒置于15mL离心管中，期间轻微振荡离心管使碳酸钙微粒分散，用去离子水洗涤三次，每次洗涤后以3000 r/min的速度离心1 min，除去上清液；将8g牛血清白蛋白中滴加4滴无水乙醇降低其溶解度,加入到CaCO₃模板中，使其析出并自发沉积到CaCO₃模板粒子表面，形成牛血清白蛋白层；

D)向步骤C)中CaCO₃模板粒子表面的牛血清白蛋白层加入0.01g二硫代二丙酸交联剂，使微粒重新分散，在轻微振荡的条件下交联15min，然后3000 r/min下离心1min，去上清，水洗三次；在负载干扰素的碳酸钙胶体微粒的微粒表面进行交联，最后得到核壳结构的胶体微粒；

E)将此核壳结构的胶体微粒用pH为7、0.02M的EDTA去核，反应30 min，然后在 5000 r/min离心3min，除去上清；重复此步骤5次,彻底除去碳酸钙；

F)往微胶囊中加入10mL的0.1mg/mL的NaBH₄溶液，室温下反应4 h，然后在3000 r/min下离心1 min，弃去上清，水洗三次，得到负载干扰素的牛血清白蛋微胶囊。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种负载干扰素微胶囊的制备方法，其特征在于采取以下步骤：

A)将Na₂CO₃和Ca(NO₃)₂·4H₂O分别配制成浓度为0.05 mol/L的溶液；取200-400mL Ca(NO₃)₂溶液，倒入烧杯中；再往烧杯中加入100mL的α型干扰素，搅拌均匀后静置15 min；

B)往步骤A)所得的溶液中迅速加入200-400mL Na₂CO₃溶液，超声10s，静置15min，即得到内含干扰素的碳酸钙胶体微粒；将所得碳酸钙胶体微粒用离心法或膜过滤法快速收集，无水乙醇洗涤三次，在50℃烘箱中干燥，贮存备用,即得到微胶囊CaCO₃模板；

C)取300mg的碳酸钙胶体微粒置于15mL离心管中，期间轻微振荡离心管使碳酸钙微粒分散，用去离子水洗涤三次，每次洗涤后以3000 r/min的速度离心1 min，除去上清液；将8-10g牛血清白蛋白中滴加4-5滴无水乙醇降低其溶解度,加入到CaCO₃模板中，使其析出并自发沉积到CaCO₃模板粒子表面，形成牛血清白蛋白层；

D)向步骤C)中CaCO₃模板粒子表面的牛血清白蛋白层加入0.01-0.02g二硫代二丙酸交联剂，使微粒重新分散，在轻微振荡的条件下交联15min，然后3000 r/min下离心1min，去上清，水洗三次；在负载干扰素的碳酸钙胶体微粒的微粒表面进行交联，最后得到核壳结构的胶体微粒；

E)将此核壳结构的胶体微粒用pH为7、0.02M的EDTA去核，反应30 min，然后在 5000 r/min离心3min，除去上清；重复此步骤5次,彻底除去碳酸钙；

F)往微胶囊中加入10mL的0.1mg/mL的NaBH₄溶液，室温下反应4 h，然后在3000 r/min下离心1 min，弃去上清，水洗三次，得到负载干扰素的牛血清白蛋微胶囊。