CN104254326A - 4-氧代-2-戊烯酸和心血管健康 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及具有健康益处的组合物。特别地是，本发明涉及心血管病症的领域，例如动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗死、心绞痛、中风和心力衰竭。本发明的主题是用于治疗或预防心血管病症的包含4-氧代-2-戊烯酸的组合物。
Description
描述
本发明一般涉及具有健康益处的组合物。特别地是，本发明涉及心血管病症的领域，例如动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗死、心绞痛、中风和心力衰竭。本发明的主题是用于治疗或预防心血管病症的包含4-氧代-2-戊烯酸的组合物。
心血管病症占全球每年死亡人数的约20％，并且仍为发达国家和发展中国家的死亡首要原因(S.K.Wattanapitayakul等人,Pharmacology andTherapeutics,89,187-206(2001))。心血管病症还是晚年生活能力障碍的首要原因。心血管病症影响心脏或血管。主要心血管病症是动脉粥样硬化(也称为动脉硬化性血管疾病)，它是一种其中脂肪物质(粉瘤或动脉粥样硬化斑块)的片状沉积物在中等大小和大动脉的壁中形成从而导致血流减少或阻断的疾患。动脉粥样硬化是一种动脉硬化形式，其意指动脉的硬化。动脉硬化干扰体内血压的控制，增加高血压风险。动脉的刚度防止扩张，不然扩张将使血压回到正常。具有高血压的人处于较高的中风、心脏病发作和肾功能衰竭的风险。
当动脉粥样硬化影响动脉供血到心脏(冠状动脉疾病)时，这可导致胸痛(心绞痛)或心脏肌肉区域被破坏的心脏病发作(心肌梗死)。富氧血液到心脏肌肉的流动的减少可导致心力衰竭，在这种病症中心脏泵送血液不充分，导致血流减少，血液在静脉和肺中堵塞(充塞)，以及还可以削弱心脏的其它变化。冠状循环不能将充足循环供应至心脏肌肉和周围组织的称为冠心病。
影响动脉至脑通路的动脉粥样硬化导致中风。当动脉至脑通路变为堵塞或破裂时中风发生，导致脑组织区域的死亡(脑梗死)。
尽管就死亡率而言主要心血管病症为中风和心脏病发作，但是心血管病症还涵盖如主动脉瘤和外周血管疾病的疾患，并且有助于临床疾患，包括肾血管疾病、血管性痴呆和视网膜疾病。预防心血管病症不仅有关于降低死亡率，而且关于预防能力障碍和改善生活质量。
心血管病症的初始治疗集中于饮食和生活方式干预，例如增加运动、吃低脂肪饮食和停止吸烟。
已建议大量用于治疗或预防心血管病症的化合物。这些化合物包括：水杨酸类(WO2009/006583)、他汀类药物(J.K.Liao,International Journalof Cardiology,86,5-18(2002))、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(US5684016)、血管紧张素II受体阻断剂(EP1604664)和钙通道阻断剂(EP0089167)。
不幸的是，目前可用的治疗不总是完全令人满意，特别是在可能与治疗相关的副作用方面。因此，具有可用于治疗或预防心血管病症且没有现有技术中所述组合物的缺点的另外组合物将是高度可取的。特别而言，发现其活性成分可由天然来源获得的有效组合物将是高度可取的。
因此，本发明的目的是改良技术状态，特别而言是提供可用于治疗或预防心血管病症的替代组合物。
发明人惊讶地看到，可由独立权利要求的主题实现本发明的目的。从属权利要求进一步开发本发明的理念。
因此，本发明提供用于治疗或预防心血管病症的包含4-氧代-2-戊烯酸的组合物。组合物可以不用作药剂。
本发明还提供4-氧代-2-戊烯酸在制备用于治疗或预防心血管病症的组合物中的用途。
在本发明的范围内的“治疗”是指减少、抑制、减轻或改善。
4-氧代-2-戊烯酸具有CAS号4743-82-2和下列式
数种研究已显示氧化应激在不同形式的心血管病症、包括动脉粥样硬化、心力衰竭和心肌梗死中起关键作用(B.Molavi等人,Current Opinionin Cardiology 19,488-493(2004))。核因子(红细胞源性2)-样2，也称为Nrf2，是抗氧化反应的主要调控因子。转录因子Nrf2存在于细胞溶质中且结合于抑制剂Keap1。当结合于Keap1时，Nrf2还被蛋白酶体快速降解，因此其基底浓度低。在被应激源(例如一氧化氮、生长因子或重金属)活化时，从Keap1释放Nrf2。Nrf2浓度增加且其易位到细胞核中。Nrf2然后结合于存在于编码很多抗氧化剂酶的基因的启动子区中的抗氧化剂-响应元件(ARE)(Kensler TW等人,Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007；47:89-116)。
Nrf2是经由遏抑氧化应激的心血管内稳态的关键调控因子(J.Li等人,Expert Opinion on Therapeutic Targets,13,785-794(2009))。已描述许多化合物对Nrf2的活化。已报道多元酚如姜黄素(US2009/0042980)、白藜芦醇(Chen CY等人,Biochem Biophys Res Commun 2005年6月17日；331(4):993-1000)、莱服硫烷(F.Elbarbry等人,Journal Medical PlantsResearch,5,473-484,(2011))和槲皮素(Tanigawa S等人,Free Radic BiolMed 2007年6月1日；42(11):1690-703)激活Nrf2。发明人惊讶地发现4-氧代-2-戊烯酸还激活Nrf2。姜黄素、白藜芦醇、莱服硫烷和槲皮素的非常低的水溶解度影响其生物利用度。相比之下，4-氧代-2-戊烯酸具有良好的水溶解度。
核转录因子κB(NF-κB)的激活与血管炎症有关(V.R.Baichwal等人,Current Biology,7,R94-R96(1997))。NF-κB是慢性免疫响应和炎症性疾病中的关键转录因子(P.J.Barnes等人,The New England Journal ofMedicine,336,1066-1078(1997))。NF-κB被许多刺激物激活，包括细胞因子、蛋白激酶C活化剂、病毒、免疫刺激物和尤其是反应性氧种类(F.Luft,Current Hypertension Reports,3,61-67(2001))。NF-κB由Rel蛋白的同二聚体和异二聚体组成。NF-κB的主要反式激活形式由p65和p50异二聚体组成。NF-kB的激活涉及通过特异性IκB激酶使抑制性蛋白IκB磷酸化和随后蛋白质降解。游离NF-κB传入细胞核，在那里它结合于在炎症中涉及的许多基因的启动子区中的κB位点。很多这些基因编码细胞因子、趋化因子、酶、凝血中涉及的蛋白质、受体、蛋白酶和粘结分子。这些分子有助于负责重塑高血压阻力动脉的结构和机械性质的改变(H.D.Intengan等人,Hypertension,36,312-318(2000))。
已鉴定NF-κB抑制剂，如糖皮质激素(Adcock等人,American JournalPhysiology-Cell Physiology,268,C331-C338(1995))，但是当全身给予时糖皮质激素具有内分泌和代谢副作用。也已报道肝素抑制NF-κB(WO200119376)，但是其具有潜在副作用，导致肝素诱导的血小板减少。
发明人调查了4-氧代-2-戊烯酸是否抑制NF-κB激活。使用人结肠细胞和人单核细胞/巨噬细胞，他们发现4-氧代-2-戊烯酸在促炎症性应激(LPS和rhTNF-α)下抑制NF-κB激活。
发明人惊讶地发现：4-氧代-2-戊烯酸可由天然来源获得，例如获自一些经过热处理的细菌株。例如，当在90℃加热6小时时短双岐杆菌CNCMI-3865和短双岐杆菌ATCC 15700TM的细菌制品均产生4-氧代-2-戊烯酸。发现在离心并过滤经过热处理的细菌制品后4-氧代-2-戊烯酸存在于可溶性部分中。
短双岐杆菌CNCM I-3865于2007年11月15日保藏于COLLECTIONNATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM),INSTITUT PASTEUR,25rue du Docteur Roux,F-75724PARIS Cedex 15,France。
短双岐杆菌ATCC 15700TM可商业获得，例如以ATCC 15700的商标获自美国典型培养物保藏中心(American type Culture Collection)(ATCC),Manassas,Virginia,USA。
因此，本发明部分涉及用于治疗或预防心血管病症的包含4-氧代-2-戊烯酸的组合物，其中组合物不用作药剂。药剂是在药房中制备或分发且在医学治疗中使用的药物或药品(<URL：www.thefreedictionary.com/pharmaceutical/>[于2012年07月17检索])。本发明可以是用于治疗或预防心血管病症的包含4-氧代-2-戊烯酸的食品组合物。心血管病症可选自动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗死、心绞痛、中风和/或心力衰竭。如上所述，中风和心肌梗死(心脏病发作)是就死亡率而言的主要心血管病症。冠心病和心力衰竭也是死亡和衰弱性不健康的主要病因。动脉粥样硬化是很多其它心血管病症的潜在病因。很多人忍受高血压和定期发作的心绞痛，但是生活质量常受影响并且人们经常担忧这些病状可以是中风、心力衰竭或心脏病发作的前奏。因此，治疗或预防动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗死、心绞痛、中风和/或心力衰竭将是有利的。
在本发明中，4-氧代-2-戊烯酸是可获得的，例如获自天然来源。很多人关心在工业上由化工原料合成的材料的安全性，尤其在将摄入这些材料的情况下，并且优选获自天然来源的材料。
发明人已发现4-氧代-2-戊烯酸可获自短双岐杆菌CNCM I-3865和/或短双岐杆菌ATCC 15700TM(短双岐杆菌的模式株)。将细菌用作4-氧代-2-戊烯酸的来源是尤其有利的，因为例如通过使用生物反应器可以生产大量4-氧代-2-戊烯酸。因此，在本发明中4-氧代-2-戊烯酸可以获得，例如获自短双岐杆菌CNCM I-3865或短双岐杆菌ATCC 15700TM。
该细菌可以在商业生产过程中在约60-180℃、优选在约80-160℃热处理，例如在约110-150℃进行热处理。发明人发现，在这些温度的热处理在可接受的时间内提供令人满意的4-氧代-2-戊烯酸收率。不希望受理论束缚，应理解，热处理的温度越高4-氧代-2-戊烯酸形成速率增加，而且使其降解速率增加。因此，这些温度在4-氧代-2-戊烯酸的形成速率与其降解之间给出良好平衡。
包含4-氧代-2-戊烯酸的典型组合物可以包含至少1mg/kg组合物的量的4-氧代-2-戊烯酸。一般而言，如果组合物包含至少10mg/kg组合物的量的4-氧代-2-戊烯酸，则是优选的，更优选在50mg至50g/kg组合物之间。
待施用的最佳量的4-氧代-2-戊烯酸可以由熟练技术人员容易地确定。
在治疗性应用中，以足以至少部分治愈或阻止病症和/或其并发症的症状的量施用组合物。足以完成此的量被定义为“治疗性有效剂量”。对于此目的有效的量将取决于本领域技术人员已知的许多因素，如病症的严重性以及患者的重量和一般状况。在预防性应用中，向易受特定病症影响或另外处于特定病症风险的患者施用足以至少部分减少发展病症的风险的量的根据本发明的组合物。此类量被定义为“预防性有效剂量”。而且，精确量取决于许多患者特异性因素如患者的健康状况和重量。4-氧代-2-戊烯酸可以以治疗有效剂量和/或预防有效剂量按照本发明的框架施用。
本发明的组合物可以以对应于2μg至20mg 4-氧代-2-戊烯酸/kg体重、优选20μg至2mg 4-氧代-2-戊烯酸/kg体重、例如40μg至1mg 4-氧代-2-戊烯酸/kg体重的日剂量施用。
心血管病症可影响动物以及人。超过10％的由兽医检查的所有家畜具有一些心血管疾病的形式。不像很多其它器官系统的疾病，心血管疾病一般不解决但几乎总是变得更多限制，且可能导致死亡(The MerckVeterinary Manual，第9版)。因此，提供向人或动物施用的组合物是有利方面。在伴侣动物的情况下，此类治疗改良动物的整体生活质量和改良主人满意度。本发明提供向人、宠物或家畜施用的组合物。
本发明中所述的4-氧代-2-戊烯酸和组合物可以向成年人、特别是吸烟者、过重和/或肥胖人或另外处于患上心血管病症的人施用。如果对象具有相对的成熟年龄，则认为他们是成年人。当对象性成熟且能够生育时，则通常认为他们是成年人。根据世界心脏联盟，烟草使用增加心血管病症的风险。这种风险对于年轻时开始吸烟、烟瘾重的人或女性尤其高。被动吸烟也是心血管病症的风险因子。体能活动不足使心脏疾病和中风的风险增加50％。
肥胖症是心血管疾病的主要风险因子并且使人易于患糖尿病，糖尿病也是心血管病症的风险因子。过重或肥胖是熟知的病症，目前在我们社会中是个很大的负担。“过重”对于成年人被定义为具有体重指数(BMI)介于25至30之间。“体重指数”被计算为重量(以kg计)除以身高(以米计)的平方的比率。“肥胖症”是一种其中在贮存于动物、特别是人和其它哺乳动物脂肪组织中的自然能量储备增加至与某些健康状况或增加的死亡率相关的点的疾患。“肥胖”对于成年人被定义为具有大于30的BMI。
患上心血管病症的另一风险因子是异常血脂水平。高总胆固醇、高三甘油酯水平、高低密度脂蛋白水平或低高密度脂蛋白胆固醇水平均增加心脏疾病和中风的风险。
尽管有关此类可修正的风险因子如吸烟和过重的最好办法是使生活方式改变，但是具有适用于治疗或预防心血管病症的组合物是有利的。的确，患上心血管病症的一些风险因子是不可修正的，例如：衰老、具有心血管病症的家族史、男性或具有非洲或亚洲血统均被世界心脏联盟列为风险因子(心血管疾病风险因子，于2011年12月12日查看，http://www.world-heart-federation.org/cardiovascular-health/cardiovascular-disease-risk-factors)。
组合物的性质并不特别受限。其可以是用于口服或肠道施用的组合物。组合物可以是例如选自下组：食品组合物、食品添加剂、营养品(nutraceutical)、饮料、营养配方、管饲配方、在乳或水中重构的粉状组合物、和宠物食品组合物。在本发明的范围内，术语营养品是指提供健康益处的食品，作为强化食品、口服补充剂或饮食补充剂。
根据本发明的食品组合物具有不同特征，例如：乳、酸奶、奶酪、发酵乳、乳基发酵产品、冰淇淋、基于谷物的产品或发酵的基于谷物的产品、乳基粉末、冷冻的或耐贮藏的饮料、糖果、动物饲料，特别对于家畜。
食品组合物还可以进一步包含蛋白源、碳水化合物源、脂质源、矿物源和/或维生素源。蛋白质、碳水化合物、脂质、矿物和/或维生素的存在可具有数种优势。这些化合物通常促成最终产品的味道和口感。它们还允许将本发明的组合物配制成完整营养配方，以使无需另外的营养。
溶于水中的化合物具有以多种方式、包括以溶液形式口服方便施用的优势。包含4-氧代-2-戊烯酸的组合物可以是水基的，例如组合物可以包含溶解于水中的4-氧代-2-戊烯酸。
本领域技术人员应理解，他们可自由地组合本文公开的本发明的所有特征。特别而言，可以组合对于本发明的不同实施方案所述的特征。本发明的另外的优势和特征根据下列附图和非限制性实例是明显的。
图1示出短双岐杆菌ATCC 15700TM的粗制品(OD 50，在90℃加热6小时)的标准化荧光素酶活性。结果在y-轴上被表示成技术上一式三份的平均±SD。x-轴值为样品的最终稀释度。
图2示出短双岐杆菌CNCM I-3865的粗制品(OD 50，在90℃加热6小时)的标准化荧光素酶活性。结果在y-轴上被表示成技术上一式三份的平均±SD。x-轴值为样品的最终稀释度。
图3示出用0至200μM的剂量范围的4-氧代-2-戊烯酸温育的AREc32细胞的Nrf2诱导倍数(棒)和细胞活力百分比(线)。Nrf2倍数诱导为在4-氧代-2-戊烯酸存在下AREc32细胞的荧光素酶活性(RLU)与未暴露细胞的基底荧光素酶活性之间的比率。通过ATP定量测量的细胞活力表示为对照(未治疗)细胞的相对百分比。结果被表示为技术上一式三份的平均±SD并且代表四个独立实验。
图4示出用2.5至50％v/v的剂量范围的短双岐杆菌CNCM I-3865的“纯制品”温育的AREc32细胞的Nrf2诱导倍数(棒)和细胞活力百分比(线)。其它细节如图3所示。
图5示出用LPS刺激的HT-29克隆34细胞的上清液中测量的通过SEAP(实心棒)和IL-8(条纹棒)产生而估算的NF-κB活性。细胞活力用线示出。将细胞暴露于一定剂量范围的4-氧代-2-戊烯酸。结果被表示为两个以技术上一式三份执行的独立实验的平均±SD。
图6示出在一定剂量范围的4-氧代-2-戊烯酸存在下LPS刺激24h的(0.5μg/ml)THP-1蓝细胞的NF-κB活性(棒)和细胞活力(线)。结果被表示为两个以技术上一式三份执行的独立实验的平均±SD。
图7示出溶解于水中的4-氧代-2-戊烯酸标准品的典型色谱图。较高的SRM与m/z 113→69的跃迁反应相关联，而较低的SRM对应于m/z113→41的跃迁反应。保留时间以分钟(x-轴)表示。信号强度(y-轴)以Cps表示。
图8示出使用HPLC-ESI-MS/MS、在90℃(以圆形○表示)、120℃(以三角形△表示)和140℃(以正方形□表示)加热2、15、30和60分钟的短双岐杆菌CNCM I-3865(OD 40)的粗制品的4-氧代-2-戊烯酸定量。
实施例1：通过4-氧代-2-戊烯酸和细菌部分的Nrf2激活
Nrf2报告基因测定：
使用Nrf2报告基因测定测量Nrf2的激活。该测定基于来自CRX生物科学(Dundee,Scotland)的AREc32细胞系，一种在ARE控制下含有荧光素酶基因构建体的稳定转染MCF7(乳腺癌)的细胞系。荧光素酶是消化荧光素并且产生荧光的酶。抗氧化分子如叔丁基氢醌(TBHQ)经由结合于ARE的Nrf2激活而诱导荧光素酶转录。荧光素酶活性使用荧光素酶试剂盒形式Promega(Madison,WI)来确定。荧光素酶活性与Nrf2激活成比例。
通过细菌部分的Nrf2激活：
使用三种细菌株来调查通过微生物的Nrf2激活：短双岐杆菌CNCMI-3865(NCC2950)、短双岐杆菌CNCM I-3914(NCC466)和短双岐杆菌ATCC 15700TM(NCC2791)。短双岐杆菌CNCM I-3914于2008年2月5日保藏于COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DEMICROORGANISMES(CNCM),INSTITUT PASTEUR,25rue duDocteur Roux,F-75724PARIS Cedex 15,France。
对于各株，将10ml含有0.05％半胱氨酸的MRS琼脂用20μl甘油储液接种并在37℃在厌氧条件中温育过夜以形成预培养物。然后通过用预培养物接种10ml含有0.05％半胱氨酸的MRS制备另外的培养物(最终OD600调节为0.1)。将培养物在37℃在厌氧条件中温育16小时以形成P2培养物。将200ml含有0.05％半胱氨酸的MRS用P2培养物接种(最终OD600调节为0.1)且将瓶在37℃在厌氧条件中温育16小时。
测量OD600，将培养物以3300g离心10min且将细菌沉淀物用冷1XPBS(磷酸盐缓冲液盐水)洗涤两次且用1X PBS标准化至OD 50。
对于各细菌株，用两种方法获得细菌部分；“粗制品”和“纯制品”。
如下获得细菌“粗制品”。将5ml OD 50细菌制品在90℃于加热块(来自Techne,Staffordshire,United Kingdom的Dri-Block DB-3加热块)中加热6小时。将经过加热的细菌制品在+4℃以3300g离心10min，将上清液使用0.22μm注射器滤器过滤且在+4℃贮藏直至进一步分析。
如下获得细菌“纯制品”。将5ml OD 50细菌制品在+4℃以3300g离心10min且将细菌沉淀物用5ml水重悬浮。在冷藏室中使用迷你珠敲打(MBB)装置破坏细菌细胞(6个循环，以最大速度各90秒，每个循环之间停顿10min)。将经破坏的细胞在+4℃以3300g离心1h，将沉淀物用5ml 1XPBS重悬浮并且于加热块中在90℃加热6小时。将经过加热的制品在+4℃以3300g离心10min。将上清液使用0.22μm注射器滤器过滤并在+4℃储存直至进一步分析。
通过使用斑点法铺板来确定“OD 50悬液”的活菌计数，并使用具有下列设置的卤素水分分析仪(Metler-Toledo,Greifensee,Switzerland)确定干重：干燥温度为160℃且激活步阶干燥。
为了确定Nrf2激活，将样品在AREc32细胞(于96孔板中接种)中使用10个独立稀释(1/2、1/4、1/6、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/40和1/50)测试且于5％CO2/空气孵育箱中在37℃温育24小时。使用荧光素酶和来自Promega的Cell Titer-Glo试剂盒确定荧光素酶活性和细胞活力(ATP测量)。
对于每次运行，用所有板中仅细胞的荧光素酶活性的平均值将所有孔的以相对光单位(RLU)测量的荧光素酶活性标准化。在测试的所有样品中，发现标准化程序不影响数据，这种观察允许不同运行中测量的样品的比较。
对于每个样品，如下计算Nrf2激活：
1)Nrf2倍数诱导：
Nrf2倍数诱导对于筛选目的是非常有用的。然而，Nrf2倍数诱导仅仅是定性测量，因为该计算不考虑样品稀释。
2)每个样品的荧光素酶含量：
“每个样品的荧光素酶含量”还反映Nrf2激活，但可区分两个以类似Nrf2倍数诱导激活Nrf2的样品，因为该计算考虑样品稀释。
每个样品的荧光素酶含量通过反映Nrf2激活分子的量而允许Nrf2激活的半定量。
表A：标准化荧光素酶活性和短双岐杆菌ATCC 15700TM的粗制品(OD50，在90℃加热6小时)的“每个样品的荧光素酶含量”的计算
每个样品的荧光素酶含量＝9.37E5x 2＝1.87E6
(科学符号9.4E5等于9.4x 105)
表B：标准化荧光素酶活性和短双岐杆菌CNCM I-3865的粗制品(OD50，在90℃加热6小时)的“每个样品的荧光素酶含量”的计算
每个样品的荧光素酶含量＝1.04E+06x 25＝2.60E+07
如表A和B中图示，两个粗制品短双岐杆菌ATCC 15700TM和短双岐杆菌CNCM I-3865具有类似的最大Nrf2诱导，但是具有不同荧光素酶含量/样品值。每个样品的荧光素酶含量值的差异反映它们相应的Nrf2激活模式(参见图1和2)。
相比之下，短双岐杆菌CNCM I-3914并未显著地激活Nrf2，参见比较表C。
表C：来自三种不同短双岐杆菌株–粗制品的比较结果
表D：来自三种不同短双岐杆菌株–纯制品的比较结果
通过4-氧代-2-戊烯酸的Nrf2激活
将4-氧代-2-戊烯酸(Alfa Aesar-参考号L02185)在Nrf2报告基因测定中测试。将不同剂量的4-氧代-2-戊烯酸应用于AREc32细胞上24小时，然后如上所述定量荧光素酶活性。还使用细胞Titer-Glo试剂盒(ATP定量)测量细胞活力。
如图3中所示，发现4-氧代-2-戊烯酸分子以剂量依赖性方式强烈激活Nrf2。AREc32细胞的活力不受低于70μM剂量的4-氧代-2-戊烯酸影响。Nrf2激活的最佳剂量为约40-50μM。为了比较，图4示出，短双岐杆菌CNCM I-3865的细菌部分以类似方式激活Nrf2。
实施例2：通过4-氧代-2-戊烯酸抑制NF-κB激活(抗炎症效应)
发明人评价了4-氧代-2-戊烯酸在促炎症性应激(LPS和rhTNF-α)下抑制NF-κB激活的能力。使用两个体外系统：人结肠细胞(HT-29克隆34)和人单核细胞/巨噬细胞(THP-1蓝细胞)。
HT-29克隆34
人结肠腺癌HT-29克隆34细胞系(第42-50代)为用NF-κB/SEAP报告基因质粒稳定转染的粘附细胞。将它们在37℃于5％CO2/空气孵育箱中、在含有1％稳定的L-谷氨酰胺且补充有10％热灭活的(在56℃，1小时)胎牛血清(FCS)(Bioconcept,Allschwil,Switzerland)、1％青霉素/链霉素(Sigma)和500μg/ml遗传霉素(PAA,Pasching,Austria)的DMEM高葡萄糖(4.5g/L)(Invitrogen)中培养。每两天更换培养基直至细胞单层达到～90％汇合。使用1X胰蛋白酶/EDTA(Sigma)对细胞继代培养。
在平底白边96孔板(Greiner Bio One,Kremsmuenster,Austria)中将10000个细胞/孔于200μl培养基中接种。3-4天培养后(即细胞达到～70-80％汇合)，去除培养基，将180μl含有(或不含)剂量范围的4-氧代-2-戊烯酸(3至400μM)的实验培养基(补充有50mM HEPES和5％人乳(HM)的DMEM高葡萄糖，作为CD14和LPS结合蛋白(LBP)的来源，仅用于LPS刺激)加至细胞中，并将板在37℃于5％CO2/空气孵育箱中预温育4小时。加入20μl含有(或不含)LPS 055:B5或rhTNF-α(最终分别为100和10ng/ml)的实验培养基，并将板在37℃于5％CO2/空气孵育箱中温育24小时。
然后，收集细胞培养物上清液用于测量NF-κB活性(确定分泌的碱性磷酸酶和IL-8产生)，分别使用Phosphalight(Applied Biosystems)和IL-8singleplex(Meso Scale,Gaithersburg,Maryland)试剂盒。
细胞活力通过使用细胞Titer-Glo试剂盒(Promega)测量ATP来确定。简言之，在室温在水平振摇(250rpm)下将剩余的附着HT-29克隆34细胞与120μl Cell Titer-Glo试剂(于1X PBS中预稀释两次)温育10min，使用增益值设定为3500的Polarstar微板读数器(BMG,Offenburg,Germany)测量发光1000ms。
在缺少LPS下，以所测试剂量的4-氧代-2-戊烯酸温育的HT-29克隆34细胞的细胞培养物上清液中，观察到无NF-κB活性(基于SEAP或IL-8检测)。
HT-29克隆34细胞的细胞活力的测量结果显示，在高于～50μM的4-氧代-2-戊烯酸剂量下细胞活力下降(图5)。
当炎症响应由LPS触发，4-氧代-2-戊烯酸以剂量依赖性方式抑制NF-κB活性(图5)。4-氧代-2-戊烯酸对SEAP和IL-8分泌两者产生影响，最好的抑制为使用50μM 4-氧代-2-戊烯酸)。尽管不太明显，在用rhTNF-α刺激的细胞下观察到类似的结果。
THP-1蓝
在37℃于5％CO2/空气孵育箱中将人单核细胞/巨噬细胞THP-1蓝细胞(第16-20代)(Invivogen,Toulouse,France)在含有1mM丙酮酸钠、2mML-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖和10mM HEPES且补充有10％热灭活的FCS(Bioconcept)、1％青霉素/链霉素(Sigma)和500μg/ml博来霉素(Invivogen)的改性RPMI培养基(ATCC,Manassas,VA)中培养。
在96孔平底透明板中将200000个细胞/孔接种于100μl培养基中。在37℃于5％CO2/空气孵育箱中温育24小时后，将80μl含有(或不含)剂量范围的4-氧代-2-戊烯酸(5至200μM)的培养基加至细胞并在37℃预温育5小时。加入20μl含有(或不含)LPS 055:B5(Sigma)(最终为100ng/ml)的培养基并将板在37℃于5％CO2/空气孵育箱中温育16小时。
将细胞培养物上清液小心转移至96孔板用于NF-κB活性测量，其与分泌的碱性磷酸酶的水平成比例。简言之，将100μl上清液与150μlQuantiBlue(Invivogen)在37℃温育3h的96孔板中混合，然后用Sunrise微板读数器(Tecan,Mannedorf,Switzerland)在620nm进行OD测量。细胞活力使用如上所述的Cell Titer-Glo试剂盒来确定。
当用LPS刺激时，响应于约40至75μM剂量的4-氧代-2-戊烯酸，获得强NF-κB抑制。4-氧代-2-戊烯酸在高于75μM的剂量下对细胞有毒性(图6)。
用HT-29克隆34细胞和THP-1蓝细胞产生的数据指示，4-氧代-2-戊烯酸在促炎症性应激下抑制NF-κB激活。
实施例3：HPLC-MS/MS对4-氧代-2-戊烯酸的定量
为了定量4-氧代-2-戊烯酸，开发了涉及将高性能液相色谱与电喷雾离子化串联质谱法耦合(HPLC-ESI-MS/MS)的高通量分析法。
4-氧代-2-戊烯酸标准品购自Alfa Aesar(Ward Hill,USA)。发现4-氧代-2-戊烯酸可溶于水中以达到至少20mg/ml。将4-氧代-2-戊烯酸标准品化合物溶解于水中以达到10mg/ml的最终储备溶液，并进一步稀释于水中以建立校准曲线。
在与3200Q TRAP质谱仪(Applied Biosystems)耦合的湍流色谱(TFC)系统(Thermo Fisher,Waltham,MA)上进行HPLC-ESI-MS/MS分析。使用的分析柱为购自Thermo Fisher(Waltham,MA)的Hypersil Gold AQ(3x50mm,5μm)，其在室温和恒定流速600μl/min下运行。流动相由溶剂A-含有0.05％乙酸的水和B-含有0.05％乙酸的甲醇构成。梯度程序为：0min0％B，以0％B保持40秒(0-0.67min)，在180秒内升至50％B(0.67-3.67min)，在10秒内从50％B升至90％B(3.67-3.83min)，以90％B保持120秒(5.83min)，之后回到0％B且保持另外的300秒(5.83-10.83min)。注射体积为5μl。
以电喷雾负电离模式实现MS数据采集。使用T型接头，以流速10μl/min注入与由溶剂A和B的HPLC流(80/20,v:v；0.6ml/min)混合的4-氧代-2-戊烯酸标准品(5μg/ml于水中)的溶液来执行MS调节。氮气用于喷雾器和气帘气体。激活接口加热器且用设定在-4.5kV的毛细管电压将块源温度保持在700℃。氮气还用作在中压选择下的碰撞气体。使用选择的反应监测(SRM)采集模式实现MS/MS检测。使用恒定停留时间50ms(总扫描时间110ms)，通过扫描m/z 113→69(碰撞能量11eV)和m/z 113→41(碰撞能量26eV)选择两个最强片段离子。去簇电压设定为-29V。使用最强SRM信号执行定量分析，而基于由标准溶液计算的适当面积比，第二跃迁用于分析物确认。使用Analyst 1.5.1软件(Applied Biosystems)执行数据处理。
通过HPLC-MS/MS检测PBS和水中的4-氧代-2-戊烯酸
将4-氧代-2-戊烯酸溶解于1X PBS或水中，如前述章节中所述，执行HPLC-MS/MS的检测。与跃迁反应m/z 113→69相关的SRM揭示，其与保留时间1.25min处的跃迁m/z 113→41相关联的SRM相比，信号更强。观察到两种转变的保留时间类似，确认分析的正确性(图7)。在1X PBS(数据未示出)和水(图7)中成功地检测到分子4-氧代-2-戊烯酸。
建立4-氧代-2-戊烯酸标准曲线：
为了准确定量细菌部分中4-氧代-2-戊烯酸的量，在简单基质如1X PBS或HPLC级水中建立4-氧代-2-戊烯酸的标准曲线。将商购4-氧代-2-戊烯酸以不同剂量悬浮于1X PBS和水中。然后将HPLC-ESI-MS/MS方法用于定量所估计剂量的4-氧代-2-戊烯酸。在1X PBS和HPLC级水中，均观察到4-氧代-2-戊烯酸的量(从0.1至25μg/ml)和所得强度(以cps表示)之间存在良好线性。
定量细菌部分中的4-氧代-2-戊烯酸：
在来自实施例1的经过热处理的细菌制品中定量4-氧代-2-戊烯酸。在HPLC-ESI-MS/MS分析之前将所有样品在HPLC级水(3次稀释/样品)中稀释。结果概述于表E中。
表E：来自实施例1的经过加热的粗和纯细菌制品(OD 50)(在90℃加热6小时)中4-氧代-2-戊烯酸的浓度(μg/ml)。N.D表示“不可检测的”，低于方法的检测限。
实施例4：加热温度和时间对4-氧代-2-戊烯酸从短双岐杆菌CNCM
I-3865的产生的影响
为了表征在热处理后4-氧代-2-戊烯酸从短双岐杆菌CNCM I-3865的产生，使用不同温度执行动力学实验。在厌氧和pH控制条件下，用于该实验的生物质的“主原料(master stock)”在生物反应器中在37℃用MRS培养基产生。在生长培养(16h)后，去除培养基且将细胞用1X PBS洗涤两次，于含有10％甘油的1X PBS中浓缩至OD 134(1.5E+10cfu/ml)，然后在-80℃以50ml等分试样储存。
然后如下由生物质主原料制备短双岐杆菌CNCM I-3865的“工作生物质”：将生物质用1X PBS洗涤两次且于1X PBS中调节至OD 40。
使用温度加热装置(THA)来调查不同加热时间和温度的作用。该系统为在生产环境中发现的典型装置的小规模形式。使用蒸汽加热含有生物质套筒的保持管。将90℃、120℃和140℃的样品温度应用多达60分钟的时间。然后将5ml各经热处理的生物质以5000g离心10min且过滤上清液(0.2μm)，通过HPLC-ESI-MS/MS定量4-氧代-2-戊烯酸含量。产生的4-氧代-2-戊烯酸的量示于图8中。
Claims (11)
1.用于治疗或预防心血管病症的包含4-氧代-2-戊烯酸的组合物，其中所述组合物不用作药剂。
2.根据权利要求1使用的组合物，其中所述心血管病症选自动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗死、心绞痛、中风和/或心力衰竭。
3.根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中4-氧代-2-戊烯酸获自天然来源。
4.根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中4-氧代-2-戊烯酸可获自短双岐杆菌CNCM I-3865或短双岐杆菌ATCC 15700。
5.根据权利要求4使用的组合物，其中所述短双岐杆菌CNCM I-3865或短双岐杆菌ATCC 15700在约60-180℃、优选在约80-160℃进行热处理。
6.根据前述权利要求中一项使用的组合物，其包含至少1mg/kg组合物、优选至少10mg/kg组合物、更优选50mg至50g/kg组合物的量的4-氧代-2-戊烯酸。
7.根据前述权利要求中一项使用的组合物，其以对应于2μg至20mg4-氧代-2-戊烯酸/kg体重、优选20μg至2mg 4-氧代-2-戊烯酸/kg体重、例如40μg至1mg 4-氧代-2-戊烯酸/kg体重的日剂量施用。
8.根据前述权利要求中一项使用的组合物，其口服或肠内施用。
9.根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向人、宠物或家畜施用。
10.根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向成年人、特别是吸烟者、过重和/或肥胖人或另外处危患心血管病症的人施用。
11.根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中所述组合物选自下组：食品组合物、食品添加剂、营养品、饮料、营养配方、管饲配方、在乳或水中重构的粉状组合物、和宠物食品组合物。
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