TW201623626A - 具有嘌呤體之攝入能力之乳酸菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種具有血清尿酸值之降低作用之乳酸菌之獲取方法。本發明係關於一種乳酸菌之篩選方法、及使用藉此而獲得之乳酸菌之血清尿酸值之降低用之嘌呤體捕捉劑,上述乳酸菌之篩選方法包括測定包含嘌呤體之培養基中之乳酸菌之嘌呤體之攝入量並將其作為指標而挑選具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。
Description
本發明係關於一種具有嘌呤體之攝入能力之乳酸菌及其用途。
於日本國內,近年來隨著飲食生活之變化,痛風患者或高尿酸血症者正逐年增加。高尿酸血症會引起尿酸排泄減少或尿酸產生過剩,因血清尿酸量之增加而頻繁誘發伴有劇痛之急性關節炎發病。於日本國內,目前推斷痛風患者為100萬人,推斷高尿酸血症者為1000萬人。現狀下,高尿酸血症主要係藉由將飲食療法、運動療法、及用藥組合以控制血清尿酸值而進行預防、治療。於飲食療法中,藉由限制攝取卡路里而降低最終被分解為尿酸之飲食性嘌呤體之攝取,但持續進行嚴格之攝取卡路里之限制未必容易。因此,針對痛風或高尿酸血症,期待更有效之治療法。進而,針對痛風或高尿酸血症,亦期待對其預防或症狀之減輕有效之食品之開發。
此外,已報告有對高尿酸血症中之血清尿酸值之降低表現出效果之微生物或醱酵物(專利文獻1~5)。例如,於專利文獻1中示出乳酸菌具有將嘌呤核苷分解為嘌呤鹼之較高分解能力。例如,於專利文獻4及5中示出乳酸菌具有嘌呤體之分解能力。可認為,此種先前之具有血清尿酸值之降低作用之微生物或醱酵物促進腸道內之嘌呤核苷向嘌呤鹼轉變,由容易自腸道吸收之嘌呤核苷轉變成難以自腸道吸收之嘌呤鹼,藉此抑制嘌呤體之吸收或促進排泄。然而,人體試驗之結果之報告較少,且具有血清尿酸值之降低作用之乳酸菌之有效率之獲取
方法亦未知。
[專利文獻1]日本專利特開2008-005834號公報
[專利文獻2]國際公開WO2011/102310號
[專利文獻3]國際公開WO2004/112809號
[專利文獻4]國際公開WO2009/069704號
[專利文獻5]日本專利特開2013-048636號公報
本發明之課題在於提供一種具有血清尿酸值之降低作用之乳酸菌之有效率之獲取方法(挑選方法)。又,本發明之另一課題在於提供一種具有嘌呤體之攝入能力之乳酸菌及其用途。
本發明者等人為了解決上述課題而反覆進行努力研究,結果發現,於以加氏乳桿菌為首之乳酸菌中,存在具有嘌呤體之攝入能力與嘌呤體之存在下之較高增殖能力之菌株,於此種乳酸菌中嘌呤體之攝入能力與嘌呤體之存在下之增殖能力相關,以及藉由投予(攝取)此種乳酸菌可降低血清尿酸值,從而完成了本發明。
即,本發明包含以下內容。
[1]一種乳酸菌之篩選方法,其包括:測定包含嘌呤體之培養基中之乳酸菌之嘌呤體之攝入量,並將其作為指標而挑選具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。
[2]如上述[1]之方法,其中培養基中之嘌呤體為嘌呤鹼。
[3]如上述[1]或[2]之方法,其中培養基中之嘌呤體經放射性同位素標記。
[4]如上述[1]至[3]中任一項之方法,其包括:測定包含嘌呤體之培養基中之上述乳酸菌之增殖量,並將其與上述嘌呤體之攝入量一併作為指標而挑選具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。
[5]如上述[1]至[4]中任一項之方法,其中乳酸菌為加氏乳桿菌。
[6]一種乳酸菌,其係藉由如上述[1]至[5]中任一項之方法而獲得的具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。
[7]一種嘌呤體捕捉劑,其包含藉由如上述[1]至[5]中任一項之方法而獲得的具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌作為有效成分。
[8]如上述[7]之嘌呤體捕捉劑,其係用於降低血清尿酸值。
[9]如上述[7]或[8]之嘌呤體捕捉劑,其中乳酸菌為加氏乳桿菌OLL2959株(寄存編號NITE BP-224)。
[10]一種飲食品或藥品,其包含如上述[7]至[9]中任一項之嘌呤體捕捉劑。
[11]如上述[10]之飲食品或藥品,其係用於減少腸道內之嘌呤體。
[12]如上述[10]或[11]之飲食品或藥品,其將顯示6~8mg/dL之血清尿酸值之人體被試驗體作為投予對象。
[13]如上述[10]至[12]中任一項之飲食品或藥品,其以每1單位劑量1×108~1×1010cfu包含上述乳酸菌。
根據本發明,可有效率地獲取(挑選)具有嘌呤體之捕捉作用及血清尿酸值之降低作用之乳酸菌。若使用本發明之乳酸菌或捕捉劑,則可高效率地捕捉嘌呤體。
圖1係表示加氏乳桿菌OLL2959株之嘌呤體之攝入能力之圖表。
圖2係表示嘌呤體之存在下之加氏乳桿菌OLL2959株之增殖能力
之圖表。
圖3係表示複數株乳酸菌株之腺嘌呤之攝入能力之圖。
圖4係表示腺嘌呤之存在下之複數株乳酸菌株之增殖能力之圖表。
圖5係表示持續地經口投予(經口攝取)加氏乳桿菌OLL2959株之人體被試驗體中的血清尿酸值之經時變化之圖表。
圖6係表示同時投予加氏乳桿菌OLL2959株與嘌呤體之動物中的加氏乳桿菌OLL2959株之嘌呤體之攝入能力之圖表。
圖7係表示根據乳酸菌株之種類對腺嘌呤之攝入能力進行比較的結果之圖表。
圖8係表示根據乳酸菌株之種類對腺嘌呤之存在下之乳酸菌株之增殖能力進行比較第結果之圖表。
圖9係表示加氏乳桿菌OLL2959株中之濁度(OD650)與核酸量之經時變化之圖表。
圖10係表示加氏乳桿菌OLL2959株中之核酸量與核酸中之放射活性之經時變化之圖表。
圖11係表示投予加氏乳桿菌OLL2959株與14C-IMP之動物中的OLL2959株之IMP吸收減少效果之圖表。放射活性(dpm):平均值±SD。*p<0.1。A:投予後15分鐘,B:投予後30分鐘。左起分別表示陰性組(陰性對照組)、IMP組(IMP投予組)、IMP+OLL2959組(IMP+OLL2959株投予組)之結果。
圖12係表示投予加氏乳桿菌OLL2959株與14C-IMP之動物中的OLL2959株之IMP吸收減少效果之圖表。放射活性(dpm):平均值±SD。*p<0.1。A:投予後45分鐘,B:投予後60分鐘。左起分別表示陰性組(陰性對照組)、IMP組(IMP投予組)、IMP+OLL2959組(IMP+OLL2959株投予組)之結果。
圖13係表示投予加氏乳桿菌OLL2959株與14C-次黃嘌呤之動物中的OLL2959株之次黃嘌呤吸收減少效果之圖表。放射活性(dpm):平均值±SD。##p<0.01。A:投予後15分鐘,B:投予後30分鐘。左起分別表示陰性組(陰性對照組)、次黃嘌呤組(次黃嘌呤投予組)、次黃嘌呤+OLL2959組(次黃嘌呤+OLL2959株投予組)之結果。
圖14係表示投予加氏乳桿菌OLL2959株與14C-次黃嘌呤之動物中的OLL2959株之次黃嘌呤吸收減少效果之圖表。放射活性(dpm):平均值±SD。##p<0.01,#p<0.05。A:投予後45分鐘,B:投予後60分鐘。左起分別表示陰性組(陰性對照組)、次黃嘌呤組(次黃嘌呤投予組)、次黃嘌呤+OLL2959組(次黃嘌呤+OLL2959株投予組)之結果。
圖15係表示加氏乳桿菌OLL2959株之次黃嘌呤及肌苷之攝入能力(捕捉作用)之圖表。
圖16係表示加氏乳桿菌OLL2959株於酸乳酪中之存活率之圖表。
以下,對本發明詳細地進行說明。
嘌呤體係具有嘌呤骨架之物質之總稱,被分類成嘌呤鹼、嘌呤核苷、及嘌呤核苷酸。嘌呤體主要於活體之細胞內發揮各種功能,例如作為核酸之構成成分而負責傳遞遺傳資訊。作為主要之嘌呤鹼,有腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤。嘌呤核苷係於嘌呤鹼上結合糖而成之化合物,可列舉:結合核糖而成之腺苷、鳥苷、肌苷及黃苷;結合脫氧核糖而成之脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧肌苷及脫氧黃苷。嘌呤核苷酸係於嘌呤核苷上結合磷酸而成之化合物,可列舉:腺嘌呤核苷酸(AMP)、鳥嘌呤核苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)及黃苷酸(XMP)。
嘌呤體係自食物經由腸道吸收而以飲食性嘌呤體之形式供給至活體內,此外於de novo路徑中由胺基酸等新進行生物合成。又,嘌呤體係經由將因嘌呤核苷酸之分解而生成之嘌呤鹼再次利用以合成嘌
呤核苷酸之回收(salvage)路徑而生物合成。
於人之情形時,嘌呤核苷酸最終被代謝為尿酸。例如,腺嘌呤核苷酸因5'-核苷酸酶(5'-NT)活性而成為腺苷,腺苷經過肌苷而被代謝為次黃嘌呤。次黃嘌呤因黃嘌呤脫氫酶(XDH)及黃嘌呤氧化酶(XO)活性而成為黃嘌呤。鳥嘌呤核苷酸因5'-核苷酸酶活性而成為鳥苷,進而因嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)活性而成為鳥嘌呤。鳥嘌呤因鳥嘌呤去胺酶(GDA)而成為黃嘌呤。黃嘌呤因黃嘌呤脫氫酶(XDH)及黃嘌呤氧化酶(XO)活性而被代謝為尿酸。另一方面,各嘌呤核苷(腺苷、肌苷、黃苷及鳥苷)因嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)活性而轉變成嘌呤鹼(腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及鳥嘌呤)。腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤之大部分因回收酵素活性而分別被再利用於腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、肌苷酸及黃苷酸之生物合成(回收路徑)。
乳酸菌之情形時,亦具有與人體類似之嘌呤體之代謝路徑,但亦有與人體之代謝路徑不同之方面。例如,大部分之乳酸菌將嘌呤核苷最終代謝成鹼。又,於加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)之情形時,嘌呤核苷因嘌呤核苷酶而轉變成嘌呤鹼。
於本發明中,藉由將向菌體內攝入嘌呤體之攝入能力作為指標而挑選(篩選)乳酸菌,可有效率地獲取(挑選)具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。本發明係關於一種乳酸菌之篩選方法,其包括:測定包含嘌呤體之培養基中之乳酸菌之嘌呤體之攝入量,並將其作為指標而獲取(挑選)具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。更具體而言,本發明係關於一種乳酸菌之篩選方法,其包括:於包含嘌呤體之培養基中培養乳酸菌,較佳為經時測定菌體內之嘌呤體之攝入量,並將其作為指標而獲取(挑選)具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。以如上方式獲得之具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌具有血清尿酸值之降低作用之可能性較高。此處,乳酸菌之嘌呤體之攝入量較多、即乳酸菌之菌體具有嘌呤
體捕捉作用,意指活體內、尤其是腸道內之嘌呤體被該乳酸菌大量捕捉而自腸道內之環境中被去除,藉此自腸道之嘌呤體之吸收得以抑制。再者,已知乳酸菌不會自消化道被吸收而是被排泄,故而乳酸菌所捕捉到之嘌呤體不會自腸道吸收,而與乳酸菌一併被排出至體外。因此,本發明亦係關於一種具有血清尿酸值之降低作用之乳酸菌之篩選方法,其包括:於包含嘌呤體之培養基中培養乳酸菌,測定菌體內之嘌呤體之攝入量,將其作為指標而挑選具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌,並獲取(挑選)該所獲得之具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌作為具有血清尿酸值之降低作用之乳酸菌。
於本發明中,具有嘌呤體之攝入能力之乳酸菌以與其嘌呤體之攝入能力之高低相關之方式而表現出嘌呤體之存在下之較高增殖能力。因此,於本發明中,除了以上述嘌呤體之攝入能力作為指標之挑選以外,亦對該經挑選之乳酸菌於嘌呤體之存在下之增殖能力之增強進行確認,藉此亦可更高精度地獲取(挑選)具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。即,本發明亦關於一種乳酸菌之篩選方法,其包括:測定具有嘌呤體之攝入能力之乳酸菌於包含嘌呤體之培養基中之增殖量,並將其與以上述方式測定之嘌呤體之攝入量一併作為指標而獲取(挑選)具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。進而,本發明亦係關於一種具有血清尿酸值之降低作用之乳酸菌之篩選方法,其包括:於包含嘌呤體之培養基中培養乳酸菌,經時測定該菌之增殖量,將其與以上述方式測定之嘌呤體之攝入量一併作為指標而挑選具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌,並獲取(挑選)該所獲得之具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌作為具有血清尿酸值之降低作用之乳酸菌。其中,可進行嘌呤體之存在下之增殖量之測定及將其作為指標之挑選,亦可不進行此種挑選。經乳酸菌大量攝入之嘌呤體(例如嘌呤鹼)被用於增殖所必需之核酸合成,該情況帶來乳酸菌之較高之增殖能力。
供於本發明之篩選方法之乳酸菌並無特別限定,較佳為乳桿菌(Lactobacillus)屬菌。作為乳桿菌屬菌,可列舉:加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.burgalicus)、德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、副乾酪乳桿菌副乾酪亞種(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、瑞士乳桿菌約古特亞種(Lactobacillus helveticus subsp.jugurti)、捲曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、嗜澱粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)、雞乳桿菌(Lactobacillus gallinarum)、口乳桿菌(Lactobacillus oris)、乾酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、醱酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、洛德乳桿菌(Lactobacillus reuteri)等菌株,其中尤佳為加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)。供於本發明之篩選方法之乳酸菌之任意菌株較佳為於適當之培養基(例如MRS培養基)中進行培養而調整濃度後,用於篩選。篩選所使用之培養基只要為加氏乳桿菌可增殖之任意培養基即可,較佳為最低必需培養基或將其作為基質並添加有嘌呤體或將一部分之成分替換為嘌呤體之培養基。再者,於表1中列舉尤佳之最低必需培養基之例。
培養基中所包含之嘌呤體只要為嘌呤鹼、嘌呤核苷、及/或嘌呤核苷酸即可。於較佳之一實施形態中,培養基中所包含之嘌呤體為嘌呤鹼。作為嘌呤鹼之例,並不限定於以下,可列舉腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤,尤佳為腺嘌呤。作為嘌呤核苷之例,並不限定於以下,可列舉腺苷、鳥苷、肌苷及黃苷,尤佳為腺苷。作為嘌呤核苷酸之例,並不限定於以下,可列舉腺嘌呤核苷酸(AMP)、鳥嘌呤核苷
酸(GMP)、肌苷酸(IMP)及黃苷酸(XMP),尤佳為腺嘌呤核苷酸。於另一實施形態中,作為嘌呤鹼、嘌呤核苷、及嘌呤核苷酸之較佳之例,可分別列舉次黃嘌呤、肌苷(IMP)及肌苷酸,尤佳為次黃嘌呤。
乳酸菌之嘌呤體之攝入量之測定時,可較佳地使用如下培養基,該培養基係將經可定量檢測之標記物標記之嘌呤體、例如經放射性同位素或螢光物質標記之嘌呤體用作培養基中所包含之嘌呤體之一部分或全部。作為放射性同位素,例如較佳為14C。乳酸菌之嘌呤體之攝入量例如可藉由以下方式進行測定或判定:於包含嘌呤體之培養基中培養乳酸菌,於培養一定時間後添加TFA(三氟乙酸)等使反應停止,根據標記物之活性檢測對培養後之菌體之標記嘌呤體進行定量,與培養開始時之菌體之該活性進行比較。於乳酸菌之嘌呤體之攝入量與培養開始時(培養開始後0分鐘時間點)相比明顯增加之情形時,可判定該乳酸菌具有將該嘌呤體攝入至菌體內之能力(嘌呤體之攝入能力)。於乳酸菌之嘌呤體之攝入量與培養開始時(培養開始0分鐘時間點)相比顯著增加之情形時,可判定該乳酸菌將該嘌呤體攝入至菌體內之能力(嘌呤體之攝入能力)較高。或者,於乳酸菌之嘌呤體之攝入量與加氏乳桿菌JCM1130株相比明顯增加之情形時,亦可判定該乳酸菌將該嘌呤體攝入至菌體內之能力(嘌呤體之攝入能力)較高。於本發明中,可獲取(挑選)以如上方式被判定為具有嘌呤體之攝入能力之乳酸菌作為具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。而且,可進而獲取(挑選)作為具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌而被挑選之乳酸菌,作為具有血清尿酸值之降低作用之乳酸菌或其候選。再者,乳酸菌之培養時間較佳為直至位於增殖曲線之誘導期或對數增殖期中之任意時間點之時間。例如,可將乳酸菌培養至培養開始之30分鐘後及60分鐘後,測定嘌呤體之攝入能力等。此時,通常只要使用液體閃爍計數器測定經放射性同位素標記之嘌呤體之放射活性即可。
乳酸菌於嘌呤體之存在下之增殖量例如可藉由以下方式進行測定或判定:於包含嘌呤體之培養基中培養乳酸菌,測定培養開始時與培養一定時間後之培養基之濁度(典型而言為650nm下之吸光度),算出該兩者之差。於在嘌呤體之存在下培養之情形時之濁度之增加量與於不存在嘌呤體之情況下培養之情形時相比明顯增加之情形時,可判定該乳酸菌表現出於該嘌呤體之存在下增強之增殖能力。或者於在嘌呤體之存在下培養之情形時之濁度之增加量與加氏乳桿菌JCM1130株相比明顯增強之情形時,亦可判定該乳酸菌表現出於該嘌呤體之存在下顯著增強之增殖能力。於乳酸菌具有嘌呤體之攝入能力且表現出於嘌呤體之存在下增強之增殖能力之情形時,意味著該乳酸菌可將嘌呤體高度合成代謝,即該乳酸菌可高度捕捉嘌呤體,甚至證實具有血清尿酸值之降低作用之可能性。再者,乳酸菌之培養時間較佳為直至位於增殖曲線之對數增殖期中之任意時間點之時間。例如,可將乳酸菌培養至培養開始之4小時後及6小時後,測定嘌呤體之存在下之增殖能力等。
於上述測定中,乳酸菌較佳為相對於培養基之1mL而以1.0×106~1.0×1011cfu、例如0.8×107~3×107cfu植菌並培養。乳酸菌之培養條件並無特別限定,較佳為於30~39℃、較佳為36~38℃下進行厭氧培養。
於本發明中,亦較佳為針對以如上方式挑選之乳酸菌,根據例如後述實施例所記載之方法,對具有血清尿酸值之降低作用之情況進一步進行試驗。例如,藉由將以如上方式挑選之乳酸菌單次或複數次投予至被試驗體,測定血清尿酸值,確認血清尿酸值有無變化(血清尿酸值之降低),可判定以如上方式挑選之乳酸菌是否具有血清尿酸值之降低作用。
以如上方式挑選之乳酸菌具有嘌呤體之攝入能力、及較佳為嘌
呤體之存在下之較高增殖能力,即具有較高之嘌呤體之捕捉作用。典型而言,此種乳酸菌具有血清尿酸值之降低作用。以如上方式挑選之乳酸菌發揮活體內(典型而言為腸道內)之嘌呤體之存在下之嘌呤體之攝入能力及較高之增殖能力(即,較高之嘌呤體之合成代謝能力),結果可大量捕捉活體內(典型而言為腸道內)之嘌呤體而使其減少,減少嘌呤體之吸收量,藉此降低血清尿酸值。經挑選之乳酸菌可攝入、即可捕捉之嘌呤體例如為嘌呤鹼、嘌呤核苷、及/或嘌呤核苷酸。經挑選之乳酸菌可攝入之嘌呤體未必限定於篩選中包含於培養基中之嘌呤體。作為嘌呤鹼之例,並不限定於以下,可列舉腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤。作為嘌呤核苷之例,並不限定於以下,可列舉腺苷、鳥苷、肌苷及黃苷。作為嘌呤核苷酸之例,並不限定於以下,可列舉腺嘌呤核苷酸(AMP)、鳥嘌呤核苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)及黃苷酸(XMP)。於一實施形態中,經挑選之乳酸菌可攝入之嘌呤體包含選自由腺嘌呤、腺苷、腺嘌呤核苷酸、次黃嘌呤、肌苷、及肌苷酸所組成之群中之至少1種,較佳為其全部。
又,本發明亦提供一種利用上述篩選方法所挑選之具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。典型而言,該乳酸菌具有血清尿酸值之降低作用。
又,本發明亦提供一種包含可利用上述篩選方法而獲得的具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌(以下亦稱為本發明之乳酸菌)作為有效成分之嘌呤體捕捉劑、較佳為經口投予用之嘌呤體捕捉劑。本發明之嘌呤體捕捉劑除了本發明之加氏乳桿菌以外,亦可包含經口投予用所容許之載體或添加劑。本發明之嘌呤體捕捉劑可為包含本發明之乳酸菌之菌體之藥劑或組合物,亦可為使用該菌而製造之醱酵物、培養物、或者其等之濃縮物/乾燥物或者包含其之藥劑或組合物。再者,本發明之嘌呤體捕捉劑所包含之本發明之乳酸菌較佳為活菌體。如上所
述,本發明之嘌呤體捕捉劑具有由乳酸菌攝入嘌呤體所得之腸道內之嘌呤體之減少作用,因此可較佳地用於腸道內之嘌呤體之減少用、甚至是血清尿酸值之降低用。又,本發明之乳酸菌或本發明之嘌呤體捕捉劑將作為魚或肉之味道成分之嘌呤體、例如肌苷酸(IMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)等嘌呤核苷酸攝入至菌體內,減少嘌呤核苷酸自腸道向體內之吸收。因此,本發明之乳酸菌或本發明之嘌呤體捕捉劑亦可用於減少此種味道成分之自腸道之吸收。本發明亦提供一種包含本發明之乳酸菌或本發明之嘌呤體捕捉劑的味道成分(此處為肌苷酸等作為魚或肉之味道成分之嘌呤體或嘌呤核苷酸)之吸收減少劑。該味道成分之吸收減少劑亦較佳為用於經口投予。
作為上述般之具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌之較佳例,並不限定於以下,可列舉加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)OLL2959株或加氏乳桿菌P14054ME002株等加氏乳桿菌。加氏乳桿菌OLL2959株為同型乳酸醱酵性,不具有氣體產生能力。加氏乳桿菌OLL2959株係於2006年3月31日(原寄存日)以寄存編號NITE P-224寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心(NPMD)(日本國千葉縣木更津市加津佐鐮足2-5-8 122號室 郵遞區號292-0818)後,於2007年11月21日移交至基於布達佩斯條約之寄存(國際寄存),寄存編號變更為NITE BP-224。或者於另一實施形態中,上述般之具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌亦可為除了加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)OLL2959株以外之乳酸菌或加氏乳桿菌。
本發明亦意圖將本發明之嘌呤體捕捉劑與飲食品或藥品組合而使用。因此,本發明亦提供一種用以與飲食品或藥品組合而使用之本發明之嘌呤體捕捉劑。
本發明亦提供一種包含本發明之嘌呤體捕捉劑之飲食品或藥品。本發明之飲食品或藥品可於投予(攝取)該飲食品或藥品之被試驗
體中將嘌呤體積極地攝入至菌體內進行合成代謝,藉此減少腸道內之嘌呤體,有效地降低血清尿酸值。因此,本發明之飲食品及藥品亦可用於減少腸道內之嘌呤體。再者,本發明中所言之「腸道內之嘌呤體」中,不含腸道內所存在之細菌(乳酸菌等)、真菌、病毒、被試驗體之細胞等所保持之嘌呤體。本發明之飲食品及藥品亦可用於基於腸道內之嘌呤體之減少的血清尿酸值之降低。包含本發明之嘌呤體捕捉劑之飲食品或藥品例如可較佳地用於痛風或高尿酸血症之預防、治療、改善或症狀之減輕等。
於本說明書中,作為「飲食品」,並無特別限定,包含飲料、食品及功能性食品。本發明之飲食品之種類並無特別限定,例如,作為飲料,可列舉:醱酵乳(優酪乳等)、乳酸菌飲料、乳飲料(咖啡牛奶、果奶等)、茶系飲料(綠茶、紅茶、烏龍茶等)、水果/蔬菜系飲料(包含柳橙、蘋果、葡萄等之果汁、蕃茄、胡蘿蔔等之蔬菜汁之飲料)、酒精性飲料(啤酒、發泡酒、葡萄酒等)、碳酸飲料、清涼飲料、水等,作為較佳之飲料,可列舉優酪乳、乳酸菌飲料、乳飲料、水基質之飲料等,作為尤佳之飲料,可列舉優酪乳。關於各種飲料之製造法等,可參考既有之參考書、例如「最新.軟飲料」(2003)(光琳股份有限公司)等。又,例如,作為食品,可列舉:醱酵乳(凝固型酸乳酪、軟質酸乳酪、乳酪等)、乳製品、糕點、即食食品等,作為較佳之食品,可列舉凝固型酸乳酪、軟質酸乳酪、糕點等,作為尤佳之飲料,可列舉凝固型酸乳酪、軟質酸乳酪等。關於各種食品之製造法等,可參考既有之參考書。
包含具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌之酸乳酪等醱酵乳例如亦可藉由以下方式製造:於使用可具有嘌呤體之捕捉作用亦可不具有嘌呤體之捕捉作用的可包含乳酸菌等其他微生物之醱酵劑而製造之乳製品或醱酵乳中,添加具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。再者,使用醱
酵劑之乳製品或醱酵乳可根據一般方法進行製造。例如可於加溫/混合/均質化/殺菌處理後冷卻之乳或乳製品中混合醱酵劑進行醱酵、冷卻,藉此製造酸乳酪。本發明較佳為將具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌用於製造酸乳酪或乳酪等乳製品或醱酵乳(較佳為包括將該乳酸菌添加(調配)至乳製品或醱酵乳或其原料中),尤佳為將該乳酸菌用於製造酸乳酪。進而,本發明亦提供一種使用具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌作為有效成分之酸乳酪或乳酪等醱酵乳或乳製品之製造中的基於乳酸菌之嘌呤體之捕捉作用的嘌呤體之減少方法。本發明之具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌(例如加氏乳桿菌OLL2959株)可於酸乳酪等醱酵乳或乳製品中表現出良好之存活性。
作為本發明之飲食品,尤佳為功能性食品。作為本發明之「功能性食品」,意指對活體具有一定之功能性之食品,例如包含:包括日本之特定保健用食品(包括帶條件之特保[特定保健用食品])及營養功能食品之保健功能食品、功能性顯示食品、及特別用途食品,以及營養輔助食品、健康輔助食品、補充品(例如錠劑、包衣錠劑、糖衣錠、膠囊及液劑等各種劑形者)及美容食品(例如節食食品)等所有所謂健康食品。又,本發明之功能性食品包含應用基於藥典(FAO/WHO合同食品標準委員會)之食品標準之健康聲明(Health claim)的健康食品。
作為本發明之功能性食品,更具體之較佳例中有病人用食品、孕產婦/哺乳婦女用乳粉、嬰兒用調製乳粉、高齡者用食品、護理用食品等特殊用途食品。
本發明之功能性食品於藉由減少腸道內之嘌呤體而降低血清尿酸值之方面尤其有用。本發明之功能性食品可適當地用於降低血清尿酸值、尤其是藉由乳酸菌對嘌呤體之攝入及促進乳酸菌之增殖而減少腸道內之嘌呤體、及作為其結果之伴隨著腸道中之嘌呤體之吸收減少
的血清尿酸值之降低。
本發明之功能性食品(較佳為特定保健用食品或帶條件之特保[特定保健用食品])等飲食品可用於減少腸道內之嘌呤體,亦可用於降低血清尿酸值或者抑制或緩和血清尿酸值之上升,亦可為關於該主旨所記載或表示者。本發明較佳為將具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌用於製造此種功能性食品(較佳為包括將該乳酸菌添加(調配)至功能性食品或其原料中)。
本發明之功能性食品可為錠劑、顆粒劑、散劑、丸劑、膠囊劑等固形製劑、液劑、懸浮劑、糖漿劑等液體製劑、或凝膠劑或糊劑等,亦可為通常之飲食品之形狀(例如飲料、酸乳酪、糕點等)。
本發明之飲食品可包含任意食品成分,並無特別限定。本發明之飲食品可包含水、蛋白質、糖質、脂質、維生素類、礦物質類、有機酸、有機鹼、果汁、香料類等。作為蛋白質,例如可列舉:全脂乳粉、脫脂乳粉、局部脫脂乳粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白質、乳清蛋白質濃縮物、乳清蛋白質分離物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、大豆蛋白質、雞蛋蛋白質、肉蛋白質等動植物性蛋白質;及該等之水解物、黃油、乳清礦物質、乳脂、乳清、非蛋白態氮、唾液酸、磷脂質、乳糖等各種源自乳之成分等。作為糖質,可列舉:一般之糖類、加工澱粉(糊精、可溶性澱粉、英國澱粉、氧化澱粉、澱粉酯、澱粉醚等)、食物纖維等。作為脂質,例如可列舉:豬油、魚油等,該等之分餾油、氫化油、酯交換油等動物性油脂;及棕櫚油、紅花油、玉米油、菜籽油、椰子油、該等之分餾油、氫化油、酯交換油等植物性油脂等。作為維生素類,例如可列舉:維生素A、胡蘿蔔素類、維生素B族、維生素C、維生素D族、維生素E、維生素K族、維生素P、維生素Q、菸酸、菸鹼酸、泛酸、生物素、肌醇、膽鹼、葉酸等,作為礦物質類,例如可列
舉:鈣、鉀、鎂、鈉、銅、鐵、錳、鋅、硒、乳清礦物質等。作為有機酸,例如可列舉:蘋果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸等。該等成分可單獨使用,亦可將2種以上組合使用,亦可使用合成品及/或大量包含該等之食品而添加。
又,包含本發明之乳酸菌或嘌呤體捕捉劑之功能性食品除了本發明之乳酸菌或嘌呤體捕捉劑以外,亦可包含經口用所容許之載體或添加劑。作為載體,例如可列舉:水、經口投予容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基澱粉鈉、果膠、三仙膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、經口投予容許之界面活性劑等。作為添加劑,例如可列舉:結合劑、賦形劑、潤滑劑、崩解劑、濕潤劑、穩定劑、緩衝劑、調味劑、保存劑、著色劑等。該等載體或添加劑可單獨使用,亦可將2種以上組合使用,可根據製劑之劑形適當使用。再者,本發明之功能性食品亦可進而含有其他功能性成分。
又,包含本發明之乳酸菌或嘌呤體捕捉劑之藥品(醫藥組合物)除了本發明之乳酸菌或嘌呤體捕捉劑以外,亦可包含製藥上所容許之載體或添加劑、尤其是經口用所容許之載體或添加劑。作為載體,例如可列舉:水、醫藥上容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基澱粉鈉、果膠、三仙膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、製藥上容許之界面活性劑等,此外,脂質體等人工細胞構造物等。作為添加劑,例如可列舉:結合劑、賦形劑、潤滑劑、崩解劑、濕潤劑、穩定劑、緩衝劑、矯味
劑、保存劑、著色劑等。該等載體或添加劑可單獨使用,亦可將2種以上組合使用,可根據製劑之劑形適當使用。再者,本發明之藥品亦可進而含有其他藥理成分。
本發明之藥品較佳為進行經口投予。本發明之藥品可為錠劑、顆粒劑、散劑、丸劑、膠囊劑等固形製劑、凝膠劑、或液劑、懸浮劑、糖漿劑等液體製劑等任意劑形。
於本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品中,關於其投予量(攝取量),可一面考慮投予(攝取)對象之被試驗體之年齡及體重、投予路徑、投予次數等,一面根據業者之判斷而於廣範圍內進行變更。因此,於本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品中,作為本發明之乳酸菌(加氏乳桿菌等)之投予量,並無特別限定,例如較佳為每1單位劑量成為1×105~1×1011cfu之量,更佳為成為1×108~1×1010cfu之量,進而較佳為成為1×109~1×1010cfu之量,例如尤佳為成為4×109~6×1010cfu之量。本發明之嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品較佳為以每1單位劑量成為1×105~1×1011cfu之量含有本發明之乳酸菌,更佳為以成為1×108~1×1010cfu之量含有本發明之乳酸菌,進而較佳為以成為1×109~1×1010cfu之量含有本發明之乳酸菌,例如尤佳為以成為4×109~6×1010cfu之量含有本發明之乳酸菌。
於本發明之一實施形態中,本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品係以1日1次以上、較佳為1日2次以上、更佳為1日2次而投予至被試驗體(或消費者攝取)。本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品可持續地投予至被試驗體,例如可每日進行投予。於此情形時,本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品係歷時至少1週、較佳為2週以上、更佳為4週以上而投予至被試驗體。於本發明之嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品係持續投予至被試驗體之情形時,作為本發明之乳酸菌之投予量,較佳為每1單位劑量成為1×105~1×1011
cfu之量,更佳為成為1×108~1×1010cfu之量,進而較佳為成為1×109~1×1010cfu之量,例如尤佳為成為4×109~6×1010cfu之量。
於本發明之另一實施形態中,本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品亦可單次投予。於本發明之嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品係單次投予至被試驗體之情形時,作為本發明之乳酸菌之投予量,較佳為每1單位劑量成為1×105~1×1011cfu之量,更佳為成為1×108~1×1010cfu之量,進而較佳為成為1×109~1×1010cfu之量,例如尤佳為成為4×109~6×1010cfu之量。本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品較佳為經口投予(經口攝取)。
於本發明中,所謂「投予」,包含通常對飲食品所使用之「攝取」與對藥品所使用之「投予」兩者。於本發明中,「經口投予」係除了自嘴投予或攝取以外,亦包含經由鼻管或胃瘺管等之經管營養法之投予。因此,本發明亦提供一種可用於此種經口投予之經口劑。因此,於本發明之較佳實施形態中,亦提供一種包含本發明之乳酸菌或嘌呤體捕捉劑、用以減少腸道內之嘌呤體從而降低血清尿酸值之經口劑。
成為本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品之投予對象之被試驗體為包含人、家畜、寵物、實驗(試驗)動物等之哺乳動物,較佳為人體被試驗體,更佳為痛風及/或高尿酸血症之人體被試驗體,進而較佳為顯示6mg/dL以上、例如6~10mg/dL之血清尿酸值之人體被試驗體。於一實施形態中,進而較佳為將顯示6~8mg/dL之血清尿酸值的輕度~邊界區域之高尿酸血症之人體被試驗體作為投予對象。又,本發明亦提供一種藉由將本發明之乳酸菌、或以有效量包含本發明之乳酸菌之本發明之嘌呤體捕捉劑、飲食品或者藥品以上述方式投予至上述被試驗體(使其攝取)而將嘌呤體捕捉至乳酸菌之菌體內,藉此減少腸道內之嘌呤體,從而降低血清尿酸值之方法。又,本
發明亦提供一種藉由使本發明之乳酸菌或嘌呤體捕捉劑與嘌呤體接觸而將嘌呤體捕捉至乳酸菌之菌體內之方法。又,本發明亦提供一種用以對飲食品、藥品或其他藥劑賦予嘌呤體捕捉作用的本發明之乳酸菌或嘌呤體捕捉劑之用途。又,本發明亦提供一種用以降低痛風發病之風險或高尿酸血症發病之風險的本發明之乳酸菌、嘌呤體捕捉劑、飲食品或藥品之用途。
[實施例]
以下,使用實施例對本發明進而具體地進行說明。但是,本發明之技術範圍並不限定於該等實施例。
[實施例1]嘌呤體之攝入能力之評價試驗
於本實施例中,使用經放射性同位素(RI)標記之嘌呤體對加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri;加氏菌)OLL2959株之嘌呤體之攝入能力進行評價。
加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri;加氏菌)OLL2959株係於2006年3月31日(原寄存日)以寄存編號NITE P-224寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心(NPMD)(日本國千葉縣木更津市加津佐鐮足2-5-8 122號室 郵遞區號292-0818)後,於2007年11月21日移交至基於布達佩斯條約之寄存(國際寄存),且寄存編號變更為NITE BP-224。以下使用將加氏乳桿菌OLL2959株接種至MRS培養基(Lactobacilli MRS Broth,Difco公司)中並以37℃、16~20小時進行培養之培養物(4~7×108cfu/ml)。
以最終濃度成為:20μM之方式向最低必需培養基(DM培養基;表1):0.1mL中添加經放射性同位素14C標記之腺嘌呤核苷酸(AMP)、腺苷、或腺嘌呤(分別為14C-AMP、14C-腺苷、14C-腺嘌呤),繼而以2重量%(0.002mL:0.8~1.4×106cfu)對上述製備之加氏乳桿菌OLL2959株之培養液進行植菌,以37℃、30分鐘進行厭氧培養。
其後,向該等培養基中添加TFA溶液(三氟乙酸,5%),繼而利用生理鹽水將菌體洗淨,然後利用液體閃爍計數器(Aloka製造,LSC-6100)測定放射活性。作為對照(0分),於剛製備樣本後添加TFA溶液(5%),繼而利用生理鹽水將菌體洗淨,然後以與上述相同之方式測定放射活性。將其結果示於圖1。圖1中,表示菌體中之14C標記嘌呤體之量的放射活性(縱軸)之單位為放射性物質每分鐘衰變之數即disintegrations per minute(dpm,每分鐘衰變數)。再者,於使用DM培養基之60分鐘之培養中,確認到試驗開始時與試驗結束時之活菌數並無明顯之變化。
該結果表示:加氏乳桿菌OLL2959株具有將作為嘌呤體之腺嘌呤核苷酸(AMP)、腺苷、及腺嘌呤攝入至菌體內之能力(嘌呤體之攝入能力),尤其是將腺嘌呤攝入至菌體內之能力(嘌呤體之攝入能力)較高(圖1)。
[實施例2]嘌呤體之存在下之增殖能力之評價試驗
於本實施例中,於嘌呤體之存在下培養加氏乳桿菌OLL2959株,對嘌呤體之存在下之增殖能力進行評價。
以最終濃度成為400μM之方式向DM培養基(表1):1mL中添加腺嘌呤核苷酸(AMP)、腺苷、或腺嘌呤作為嘌呤體,繼而以4重量%(0.04mL:1.6~2.8×107cfu)對實施例1中所製備之加氏乳桿菌OLL2959株之培養液進行植菌,於37℃下進行厭氧培養。繼而,於自該培養開始0小時、4小時及6小時後測定培養基之濁度(650nm下之吸光度)。作為對照,不向最低必需培養基中添加嘌呤體,除此以外,藉由相同之方法培養加氏乳桿菌OLL2959株,並測定培養基之濁度。將其結果示於圖2。
該結果表示加氏乳桿菌OLL2959株於腺嘌呤核苷酸(AMP)、腺苷、或腺嘌呤之存在下增殖能力增強,尤其是於腺嘌呤存在下增殖能力進一步增強(圖2)。
[實施例3]腺嘌呤之攝入能力及腺嘌呤之存在下之增殖能力之比較試驗
於本實施例中,於腺嘌呤存在下培養加氏乳桿菌OLL2959株及其他加氏乳桿菌株,並對各自之腺嘌呤之攝入能力及腺嘌呤之存在下之增殖能力進行比較。
作為其他加氏乳桿菌株,使用加氏乳桿菌P14054ME001株及P14054ME002株。再者,關於加氏乳桿菌P14054ME001株及P14054ME002株,於在未添加嘌呤體之MRS培養基(Lactobacilli MRS Broth,Difco公司)中培養20小時之情形時,各自之增殖能力與加氏乳桿菌OLL2959株同等(表2)。
於腺嘌呤之攝入能力之評價中,僅使用腺嘌呤(14C-腺嘌呤)作為經放射性同位素14C標記之嘌呤體,除此以外,以與實施例1相同之方式進行試驗。將其結果示於圖3。雖不及加氏乳桿菌OLL2959株高,但亦可確認到加氏乳桿菌P14054ME002株之腺嘌呤之攝入能力較高(圖3)。若與加氏乳桿菌OLL2959株及P14054ME002株進行比較,則可確認到加氏乳桿菌P14054ME001株之腺嘌呤之攝入能力較低(圖3)。
於腺嘌呤之存在下之增殖能力之評價中,以最終濃度成為400μM之方式向DM培養基(表1):1mL中添加腺嘌呤,繼而以4重量%(0.04mL:1.6~2.8×107cfu)對實施例1中所製備之加氏乳桿菌OLL2959株之培養液、以與實施例1所記載之方法相同之方式製備之P14054ME001株及P14054ME002株之培養液之任一者進行植菌,並於37℃下進行厭氧培養。繼而,於自該培養開始0小時、4小時及6小時後測定培養基之濁度(650nm下之吸光度)。將其結果示於圖4。與加氏乳桿菌OLL2959株同樣地,加氏乳桿菌P14054ME001株及P14054ME002株亦於腺嘌呤之存在下顯示出增殖能力之增強。又,與加氏乳桿菌P14054ME001株及P14054ME002株相比,加氏乳桿菌OLL2959株之增殖能力之增強程度極強。再者,與加氏乳桿菌P14054ME001株相比,加氏乳桿菌P14054ME002株之增殖能力之增強程度較強。
根據該等結果表示,於加氏乳桿菌中,腺嘌呤之存在下之增殖能力之增強與腺嘌呤之攝入能力之高低相關。而且顯示一部分乳酸菌具有較高之腺嘌呤之合成代謝能力。
[實施例4]加氏乳桿菌OLL2959株之血清尿酸值之降低效果之評價試驗
使疑似為輕度~邊界區域之高尿酸血症之人體被試驗者持續攝取加氏乳桿菌OLL2959株,藉由安慰劑對照雙盲測試比較試驗來研究對尿酸值之影響(人體試驗)。
將於試驗開始前之檢查中尿酸值為6~8mg/dL之35歲以上之成人男性14名(平均年齡44.3歲)以尿酸值與年齡並無明顯差之方式分配成安慰劑組與試驗組兩個組。使安慰劑組以2個(85g/個)/日攝取不含加氏乳桿菌OLL2959株之酸乳酪4週。使試驗組以2個(85g/個)/日攝取於給予安慰劑組之酸乳酪中以1×108cfu/g含有加氏乳桿菌OLL2959株者4週。再者,酸乳酪2個/日係以早餐、午餐、晚餐之任一餐後之2次攝取。
對於各被試驗者,於試驗開始時(試驗食攝取前)、2週後及4週後(試驗食攝取期間)進行血液檢查,根據一般方法測定血清尿酸值。算出與試驗開始時之血清尿酸值相比的各時間點之血清尿酸值之變化量,對於試驗期間之血清尿酸值之變化量之推移,利用反覆測定二元配置分散分析法進行統計解析。將結果示於圖5。
如圖5所示,試驗組與安慰劑組相比,血清尿酸值明顯較低(p=0.042)。即,表示加氏乳桿菌OLL2959株具有降低血清尿酸值之效果。
[實施例5]加氏乳桿菌之單次投予試驗(動物試驗)
大鼠與人不同,具有作為尿酸分解酵素之尿酸酶,因此為了使血清尿酸值上升而必須投予作為尿酸酶抑制劑之氧酸鉀。因此,對斷食16小時之Wistar大鼠(雄)強行經口投予氧酸鉀0.5g/kg。對於對乳酸菌組,於投予氧酸鉀之60分鐘後因嘌呤體負荷而強行經口投予乾燥酵母(於注射用水中懸浮)與加氏乳桿菌OLL2959株(於生理鹽水中
懸浮)。對於陰性組,投予注射用水代替乾燥酵母,且投予生理鹽水代替加氏乳桿菌。對於對照組,與乾燥酵母一併投予生理鹽水代替加氏乳桿菌。
於強行經口投予後,經時(30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、及150分鐘後)採血,對各血液試樣按照一般方法測定血中尿酸值,研究血中尿酸值之推移。若乳酸菌組與對照組相比血中尿酸值推移為較低,則表示單次投予亦因加氏乳桿菌OLL2959株之嘌呤體攝入之效果而自腸道之嘌呤體吸收量減少。
[實施例6]加氏乳桿菌之嘌呤體之攝入能力(動物試驗)
可認為於乳酸菌之嘌呤體之攝入能力較高之情形時,若對動物被試驗體同時投予(使其攝取)乳酸菌與嘌呤體,則與使動物被試驗體單獨攝取嘌呤體時相比,被試驗體中之嘌呤體之吸收得到抑制。因此,為了對加氏乳桿菌之嘌呤體之攝入能力進行試驗,按照以下順序進行動物實驗。
首先,購買14匹8週齡之Wistar大鼠(雄,190~210g)後歷時一週進行馴化。對於該等大鼠,自試驗之前一天起使其等斷食約16小時,於該斷食後測定體重。根據該斷食後之體重,使用分組程式藉由隨機抽選法將大鼠分配成陰性組(生理鹽水投予組)、AMP(放射性同位素14C-AMP)投予組、AMP+OLL2959株(放射性同位素14C-AMP及OLL2959株)投予組共計3組(僅陰性組設為4匹,其他組各設為5匹)。將該等所有大鼠於無麻醉之情況下放入至保持器中,使用解剖刀割破尾靜脈,使用血溶管採集該等湧出之血液60μL。將其設為被試驗物質之投予前之0分鐘時間點之採血。向該等所採集之血液中添加等量之2mg/mL EDTA-2Na溶液(將EDTA-2Na溶解於生理鹽水中)。
繼而,強行經口投予被試驗物質。此處,關於該等被試驗物質,陰性組使用生理鹽水,AMP投予組使用經放射性同位素14C標記
之腺嘌呤核苷酸(14C-AMP:57.6mCi/mmol、0.1mCi/ml),AMP+OLL2959株投予組使用14C-AMP及加氏乳桿菌OLL2959株(1×1010cfu/body)。又,14C-AMP及OLL2959株係使用經生理鹽水(大塚製藥)稀釋而成者。於AMP組及AMP+OLL2959組中,以10μCi/body投予14C-AMP。再者,於所有例(所有組)中,將投予容量設為2mL/body。
於自投予被試驗物質開始15、30、45、60、90、120及180分鐘後,將該等所有大鼠於無麻醉之情況下放入至保持器中,使用解剖刀割破尾靜脈,使用血溶管採集該等湧出之血液60μL。向該等所採集之血液中添加等量之2mg/mL EDTA-2Na溶液(將EDTA-2Na溶解於生理鹽水中)。於該等試驗結束後,立刻藉由吸入二氧化碳對大鼠進行殺滅處理。
使用液體閃爍計數器(Aloka製造,LSC-6100)測定該等所採集之血液之放射活性。將其結果示於圖6。
如圖6所示,於血中濃度達到峰值之自投予開始30、45及60分鐘後,嘌呤體之吸收量可見明顯差(*p<0.05,**p<0.01,t-test)。由該結果表示,藉由攝取加氏乳桿菌OLL2959株,可抑制自腸道之嘌呤體之吸收量。
[實施例7]加氏乳桿菌之單次投予試驗(人體試驗)
使20歲以上之健康男性攝取1次嘌呤體製備物(5'-腺嘌呤核苷酸、5'-肌苷酸二鈉及5'-鳥嘌呤酸二鈉之混合物)498mg,於攝取30分鐘、60分鐘、120分鐘、150分鐘後採血,研究血中尿酸值之推移。選定顯示出相同之推移之被試驗者10名作為本試驗之對象者。於本試驗中,使所選定之被試驗者攝取112mL之含加氏乳桿菌OLL2959株之酸乳酪(試驗組;含有8.5×107cfu/mL之加氏乳桿菌OLL2959株)或不含該菌之酸乳酪(安慰劑組),於攝取30分鐘、60分鐘、120分鐘、150分鐘後採血,根據一般方法對各血液試樣測定血中尿酸值,研究血中尿酸值之
推移並進行交叉試驗。若試驗組與安慰劑組相比尿酸值之上升得以抑制,則表示單次投予亦因加氏乳桿菌OLL2959株之嘌呤體攝入之效果而自腸道之嘌呤體吸收量減少。
[實施例8]乳酸菌株之種類之比較試驗
(1)腺嘌呤之攝入能力之比較試驗
於包含經放射性同位素(RI)標記之腺嘌呤(14C-腺嘌呤)之培養基中培養加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株,並且關於腺嘌呤之攝入能力,對乳酸菌株之種類之影響進行比較。再者,加氏乳桿菌JCM1130株可自理化學研究所生物資源中心微生物材料開發室(RIKEN BRC JCM;茨城縣築波市,日本)作為JCM1130而獲取。
此處,使用MRS培養基分別培養加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株,預先對該等之增殖能力進行評價。即,使用MRS培養基分別以37℃、20小時對加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株進行厭氧培養。此時,於歷時20小時進行厭氧培養後,與加氏乳桿菌OLL2959株進行比較,加氏乳桿菌JCM1130株之菌數高至2.5倍以上。該情況表示於在相同之培養基中培養加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株之情形時,基本上加氏乳桿菌JCM1130株之增殖能力較高(表3)。
於腺嘌呤之攝入能力之比較試驗中,首先,以最終濃度成為20μM之方式向最低必需培養基(表1)中添加14C-腺嘌呤,製備本試驗之培養基。繼而,使用MRS培養基分別培養加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株後,以2重量%將該等培養液植菌至本試驗之培
養基中,於37℃下進行厭氧培養。於該等培養液中,使用MRS培養基以分別成為同等菌數之方式進行調整。
於該等之培養開始時(0分鐘)與自培養開始30或60分鐘後添加5%濃度之TFA溶液,使培養停止,繼而利用生理鹽水將菌體洗淨,然後使用液體閃爍計數器(Aloka製造,LSC-6100)測定該等之放射活性。將其結果示於圖7。此處,圖7之放射活性(縱軸)係以放射性物質每分鐘衰變之數(disintegrations per minute;dpm)表示。
如圖7所示,加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株均發揮出腺嘌呤之攝入能力,但於自該等之培養開始30及60分鐘後,加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株相比更多地攝入腺嘌呤,腺嘌呤之攝入量可見有明顯差(p<0.05,t-test)。
由該結果表明,與MRS培養基中之增殖能力較高之加氏乳桿菌JCM1130株相比,加氏乳桿菌OLL2959株中明顯更多攝入嘌呤體。
(2)腺嘌呤之存在下之增殖能力之比較試驗
於腺嘌呤之存在下培養加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株,並且關於菌體之增殖能力,對乳酸菌株之種類之影響進行比較。
以最終濃度成為400μM之方式向最低必需培養基(表1)中添加腺嘌呤,製備本試驗之培養基。繼而,使用MRS培養基分別培養加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株後,以4重量%將該等培養液植菌至本試驗之培養基中,於37℃下進行厭氧培養。於該等之培養開始(0小時)與自培養開始4及6小時後測定濁度(650nm下之吸光度)。將其結果示於圖8。
如圖8所示,表明加氏乳桿菌OLL2959株與加氏乳桿菌JCM1130株均是腺嘌呤之存在下之增殖能力增強,但與MRS培養基中之增殖能力較高之加氏乳桿菌JCM1130株相比,加氏乳桿菌OLL2959株之增殖
能力之增強程度明顯較高(p<0.05,t-test)。因此,表示加氏乳桿菌OLL2959株於嘌呤體存在下之增殖能力尤其明顯地增強。
[實施例9]嘌呤體於核酸合成中之利用
進行對加氏乳桿菌OLL2959株於攝入腺嘌呤後增殖之過程中如何利用腺嘌呤進行查證之試驗。
將培養中之加氏乳桿菌OLL2959株之菌體回收,以6%量植菌至包含以成為1.0×1010(1.0E+10)cfu/ml之方式製備且最終濃度400μM之腺嘌呤之最低必需培養基中。其後添加14C-腺嘌呤,於0、1、2、3、及4小時後回收培養基並進行濁度測定(650nm下之OD)。進而以3,000rpm且10分鐘、4℃對培養基進行離心,藉此回收菌體,利用蒸餾水洗淨2次後,使用DNA萃取套組ISOPLANT II(Nippon Gene)自菌體進行核酸萃取。對於所萃取之核酸,使用分光光度計測定濃度。其後,將萃取核酸全部添加至帶液體閃爍液之小玻璃瓶中,利用液體閃爍計數器測定放射活性。
其結果為,濁度依賴於培養時間而增加(OLL2959株增殖),又,核酸量(DNA濃度)亦依賴於培養時間而增加(圖9)。進而核酸中之放射活性亦隨著核酸量之增加而增加(圖10),由此表示OLL2959株攝入腺嘌呤,並將其利用於合成細胞增殖所必需之核酸。
[實施例10]加氏乳桿菌之次黃嘌呤及IMP(肌苷酸)之攝入能力之評價(動物試驗)
對於28匹Wistar雄性大鼠(8週齡),於購買後進行一週左右之馴化。自試驗前一天起使大鼠斷食約16小時,於斷食後進行體重測定。根據斷食後之體重將大鼠分成陰性對照(生理鹽水)組、IMP(放射性同位素14C-IMP)投予組、及IMP+OLL2959株(放射性同位素14C-IMP及OLL2959株)投予組共計3組(僅陰性對照組為8匹,其他組各10匹)。
於所有例中於無麻醉之情況下自大鼠之尾靜脈採血60μL。將其
作為投予被試驗物質前之0分鐘時採血。向所採集之血液中添加等量之2mg/mL EDTA-2Na溶液(將EDTA-2Na溶解於生理鹽水中而成之溶液)並進行冰浴冷卻。
繼而對大鼠強行經口投予被試驗物質。對於IMP投予組,利用生理鹽水將14C-IMP稀釋並投予2mL/body。對於IMP+OLL2959株投予組,投予在投予前混合14C-IMP及OLL2959株而製備之混合液2mL/body。於該等組中,14C-IMP係以10μCi/body投予。對陰性對照組以2mL/body投予生理鹽水。
於所有例中,於投予被試驗物質後15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘及180分鐘之時間點,於無麻醉之情況下自大鼠之尾靜脈採血60μL。向所採集之血液中添加等量之2mg/mL EDTA-2Na溶液並進行冰浴冷卻。
對於所採集之血液,利用液體閃爍計數器測定放射活性。
進而使用14C-次黃嘌呤代替14C-IMP,進行相同之動物試驗。於該使用14C-次黃嘌呤之試驗中,使用陰性對照(生理鹽水投予)組、次黃嘌呤投予組、次黃嘌呤+OLL2959株投予組共計3組(僅陰性對照組為4匹,其他組各5匹)。
將結果示於圖11~圖14。如圖11及12所示,於被試驗物質之血中濃度達到峰值之時間點前後,經單次投予加氏乳桿菌OLL2959株之大鼠之IMP吸收量明顯降低(*p<0.1,次黃嘌呤投予組對次黃嘌呤+OLL2959株投予組,Student T檢驗)。同樣地,如圖13及14所示,經單次投予加氏乳桿菌OLL2959株之大鼠之次黃嘌呤吸收量明顯降低(##p<0.01,#p<0.05,次黃嘌呤投予組對次黃嘌呤+OLL2959株投予組,Student T檢驗)。由該等結果進而顯示出由單次投予加氏乳桿菌OLL2959株所得之嘌呤體吸收減少效果。IMP亦為魚或肉之味道成分,故可確認對IMP或其鹼次黃嘌呤之吸收減少效果之意義較大。
[實施例11]體外(in vitro)之嘌呤體攝入能力之評價
向以成為1.0×108cfu/ml左右之方式利用PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸鹽緩衝液)製備之加氏乳桿菌OLL2959株中以1μCi/ml添加14C-次黃嘌呤及14C-肌苷,於37℃下保溫15分鐘或30分鐘。回收保溫後之菌體,使用液體閃爍計數器測定放射活性。
將其結果示於圖15。顯示出加氏乳桿菌OLL2959株於in vitro將肌苷及次黃嘌呤均攝入(捕捉)至其菌體內(圖15)。關於攝入量,相較於作為核苷之肌苷,作為嘌呤鹼之次黃嘌呤更多。該結果與腺苷和腺嘌呤之關係之結果相同。
[實施例12]酸乳酪中之OLL2959株之存活性之評價
向優酪乳或生理鹽水中以成為2.5×108±0.1×108cfu/ml之濃度之方式添加加氏乳桿菌OLL2959株,於(第0天)、第7天、第21天及第28天測定活菌數。以相對於第0天之活菌數之活菌數之比率(%)表示各時間點之存活率。
其結果為,添加至優酪乳中之加氏乳桿菌OLL2959株之存活率於第7天為72.6%,第21天為58.5%,第28天為61.0%(圖16)。相對於此,添加至生理鹽水中之加氏乳桿菌OLL2959株之存活率於第7天為10.6%,第21天與第28天為0.0%(圖16)。
由該等結果顯示,與生理鹽水相比,加氏乳桿菌OLL2959株於酸乳酪中之存活性增高。
根據本發明,可有效率地獲取嘌呤體之攝入能力及嘌呤體存在下之增殖能力較高、具有嘌呤體捕捉作用之乳酸菌。此種乳酸菌可減少所投予之腸道內之嘌呤體量,藉此可減少腸道內之嘌呤體之吸收量,結果可降低血清尿酸值。因此,本發明於開發用以減少腸道內之嘌呤體從而降低血清尿酸值之經口劑之方面亦有用。
日本;獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心;2006年3月31日;NITE BP-224
Claims (13)
- 一種乳酸菌之篩選方法,其包括:測定包含嘌呤體之培養基中之乳酸菌之嘌呤體之攝入量,並將其作為指標而挑選具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。
- 如請求項1之方法,其中培養基中之嘌呤體為嘌呤鹼。
- 如請求項1或2之方法,其中培養基中之嘌呤體經放射性同位素標記。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其包括:測定包含嘌呤體之培養基中之上述乳酸菌之增殖量,並將其與上述嘌呤體之攝入量一併作為指標而挑選具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。
- 如請求項1至4中任一項之方法,其中乳酸菌為加氏乳桿菌。
- 一種乳酸菌,其係藉由如請求項1至5中任一項之方法而獲得的具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌。
- 一種嘌呤體捕捉劑,其包含藉由如請求項1至5中任一項之方法而獲得的具有嘌呤體之捕捉作用之乳酸菌作為有效成分。
- 如請求項7之嘌呤體捕捉劑,其係用於降低血清尿酸值。
- 如請求項7或8之嘌呤體捕捉劑,其中乳酸菌為加氏乳桿菌OLL2959株(寄存編號NITE BP-224)。
- 一種飲食品或藥品,其包含如請求項7至9中任一項之嘌呤體捕捉劑。
- 如請求項9之飲食品或藥品,其係用於減少腸道內之嘌呤體。
- 如請求項10或11之飲食品或藥品,其將顯示出6~8mg/dL之血清尿酸值之人體被試驗體作為投予對象。
- 如請求項10至12中任一項之飲食品或藥品,其以每1單位劑量以1×108~1×1010cfu包含上述乳酸菌。
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