CN107208029A - 具有嘌呤摄取能力的乳酸菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了获得具有降低血清尿酸水平的作用的乳酸菌的方法。本发明涉及筛选乳酸菌的方法,包括测量乳酸菌在含有嘌呤的培养基中的嘌呤摄取量,和利用嘌呤摄取量作为指标筛选具有嘌呤捕获作用的乳酸菌;和涉及用于降低血清尿酸水平的捕获嘌呤的剂,所述剂包含通过该方法可获得的乳酸菌。
Description
技术领域
本发明涉及具有嘌呤摄取能力的乳酸菌及其用途。
背景技术
最近几年在日本,随着饮食的改变,患有痛风的患者或高尿酸血症个体的数目每年增加。高尿酸血症包括尿酸的减少的排泄或过量尿酸的产生,并且血清尿酸水平的增加经常诱发痛风,其发展成伴随剧痛的急性关节炎。当前在日本,估计患有痛风的患者的数目是一百万,并且估计高尿酸血症个体的数目是一千万。现在,主要借助通过饮食疗法、运动疗法和药物治疗的组合控制血清尿酸水平来预防或治疗高尿酸血症。饮食疗法中,通过限制卡路里的摄取减少最终降解形成尿酸的膳食嘌呤的摄取。然而,继续严格限制卡路里的摄取不一定容易。因此,需要用于痛风或高尿酸血症的更加有效的治疗方法。对于痛风或高尿酸血症,还需要对其预防或其症状的缓解有效的食品产品的开发。
已经报道了在减少高尿酸血症中的血清尿酸水平中示出疗效的微生物和发酵产品(专利文献1至5)。专利文献1,例如,公开了,乳酸菌具有将嘌呤核苷降解成嘌呤碱的高的能力。专利文献4和5,例如,公开了,乳酸菌具有降解嘌呤的能力。已经相信这些具有减少血清尿酸水平作用的常规的微生物和发酵产品,通过促进肠道中的嘌呤核苷转化成嘌呤碱,即将易于从肠道吸收的嘌呤核苷转化成从肠道吸收不良的嘌呤碱,抑制嘌呤吸收或促进嘌呤排泄。然而,对人类测试结果几乎没有可得的报道,并且获得具有减少血清尿酸水平作用的乳酸菌的有效的方法是未知的。
引用列表
专利文献
专利文献1:日本专利公布号2008-005834A
专利文献2:国际公布号WO 2011/102310
专利文献3:国际公布号WO 2004/112809
专利文献4:国际公布号WO 2009/069704
专利文献5:日本专利公布号2013-048636 A
发明概述
技术问题
本发明的目的是提供获得(或选择)具有降低血清尿酸水平的作用的乳酸菌的有效方法。本发明的另一目的是提供具有嘌呤摄取能力的乳酸菌及其用途。
问题解决方案
作为解决上述问题的深入研究的结果,本发明人发现,存在具有嘌呤摄取能力和在嘌呤的存在下的高增殖能力的乳酸菌菌株诸如加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)细菌,并且这样的乳酸菌具有嘌呤摄取能力和在嘌呤的存在下的增殖能力之间的相关性,并且还发现,这种乳酸菌的施用(摄取)可降低血清尿酸水平,从而完成了本发明。
即,本发明包括以下。
[1]一种筛选乳酸菌的方法,包括测量乳酸菌在含有嘌呤的培养基中的嘌呤摄取量,和利用所述嘌呤摄取量作为指标选择具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。
[2]根据以上[1]所述的方法,其中所述培养基中的嘌呤是嘌呤碱。
[3]根据以上[1]或[2]所述的方法,其中所述培养基中的嘌呤用放射性同位素标记。
[4]根据以上[1]至[3]中任一项所述的方法,包括在所述包含嘌呤的培养基中测量所述乳酸菌的增殖量,和使用所述增殖量与所述嘌呤摄取量一起作为指标选择具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。
[5]根据以上[1]至[4]中任一项所述的方法,其中所述乳酸菌是加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)细菌。
[6]具有嘌呤捕获作用的乳酸菌,其是通过根据以上[1]至[5]中任一项所述的方法可获得的。
[7]一种用于捕获嘌呤的剂,所述剂包含通过根据以上[1]至[5]中任一项所述的方法可获得的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌作为活性组分。
[8]根据以上[7]所述的用于捕获嘌呤的剂,所述剂用于在降低血清尿酸水平中使用。
[9]根据以上[7]或[8]所述的用于捕获嘌呤的剂,其中所述乳酸菌是加氏乳杆菌OLL2959菌株(登录号:NITE BP-224)。
[10]一种食品或饮料产品或药物制剂,所述食品或饮料产品或药物制剂包含根据以上[7]至[9]中任一项所述的用于捕获嘌呤的剂。
[11]根据以上[10]所述的食品或饮料产品或药物制剂,其用于在减少肠道中的嘌呤中使用。
[12]根据以上[10]或[11]所述的食品或饮料产品或药物制剂,其用于在向具有6至8mg/dL血清尿酸水平的人类受试者施用中使用。
[13]根据以上[10]至[12]中任一项所述的食品或饮料产品或药物制剂,包含每剂量1x 108至1x 1010cfu的以上描述的乳酸菌。
发明的有益效果
根据本发明,可以有效地获得(选择)具有嘌呤捕获作用和降低血清尿酸水平的作用的乳酸菌。通过使用根据本发明的乳酸菌或捕获剂,可有效地捕获嘌呤。
本说明书包括日本专利申请第2014-234050号和第2015-064201号的内容,本申请从其要求优先权。
附图简述
[图1]图1是示出加氏乳杆菌OLL2959菌株的嘌呤摄取能力的图。
[图2]图2是示出在嘌呤的存在下加氏乳杆菌OLL2959菌株的增殖能力的图。
[图3]图3示出多个乳酸菌菌株的腺嘌呤摄取能力。
[图4]图4是示出在腺嘌呤的存在下多个乳酸菌菌株的增殖能力的图。
[图5]图5是示出连续口服施用(口服摄取)加氏乳杆菌OLL2959菌株的人类受试者中血清尿酸水平随着时间变化的图。
[图6]图6是示出在向其同时施用加氏乳杆菌OLL2959菌株和嘌呤的动物中加氏乳杆菌OLL2959菌株的嘌呤摄取能力的图。
[图7]图7是示出比较乳酸菌菌株间的腺嘌呤摄取能力的结果的图。
[图8]图8是示出比较乳酸菌菌株间在腺嘌呤的存在下乳酸菌菌株的增殖能力的结果的图。
[图9]图9是示出浊度(OD650)和加氏乳杆菌OLL2959菌株中核酸的量随着时间变化的图。
[图10]图10是示出来自加氏乳杆菌OLL2959菌株的核酸的量和该核酸中的放射性随着时间变化的图。
[图11]图11表示各自显示在施用加氏乳杆菌OLL2959菌株和14C-IMP的动物中OLL2959菌株降低IMP吸收的作用的图。放射性(dpm):平均值±SD。*p<0.1。A:施用后15分钟,B:施用后30分钟。从左开始,每个柱显示阴性组(阴性对照组)、IMP组(IMP处理组)和IMP+OLL2959组(IMP+OLL2959菌株处理组)的结果。
[图12]图12表示各自显示在施用加氏乳杆菌OLL2959菌株和14C-IMP的动物中OLL2959菌株降低IMP吸收的作用的图。放射性(dpm):平均值±SD。*p<0.1。A:施用后45分钟,B:施用后60分钟。从左开始,每个柱显示阴性组(阴性对照组)、IMP组(IMP处理组)和IMP+OLL2959组(IMP+OLL2959菌株处理组)的结果。
[图13]图13表示各自显示在施用加氏乳杆菌OLL2959菌株和14C-次黄嘌呤的动物中OLL2959菌株降低次黄嘌呤吸收的作用的图。放射性(dpm):平均值±SD。##p<0.01。A:施用后15分钟,B:施用后30分钟。从左开始,每个柱显示阴性组(阴性对照组)、次黄嘌呤组(次黄嘌呤处理组)和次黄嘌呤+OLL2959组(次黄嘌呤+OLL2959菌株处理组)的结果。
[图14]图14表示各自显示在施用加氏乳杆菌OLL2959菌株和14C-次黄嘌呤的动物中OLL2959菌株降低次黄嘌呤吸收的作用的图。放射性(dpm):平均值±SD。##p<0.01,#p<0.05。A:施用后45分钟,B:施用后60分钟。从左开始,每个柱显示阴性组(阴性对照组)、次黄嘌呤组(次黄嘌呤处理组)和次黄嘌呤+OLL2959组(次黄嘌呤+OLL2959菌株处理组)的结果。
[图15]图15是显示加氏乳杆菌OLL2959菌株的次黄嘌呤摄取能力(捕获作用)和肌苷摄取能力(捕获作用)的图。
[图16]图16是示出加氏乳杆菌OLL2959菌株在酸奶中的存活率的图。
实施方案的描述
本发明将在下文中详细描述。
“嘌呤”共同地指具有嘌呤骨架的物质并且被分类为嘌呤碱、嘌呤核苷和嘌呤核苷酸。嘌呤主要在活体细胞中起着多种功能,并且发挥例如作为核酸的成分传递遗传信息的作用。主要的嘌呤碱的实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤。嘌呤核苷是其中糖与嘌呤碱基结合的化合物,并且其实例包括其中核糖与嘌呤碱基结合的腺苷、鸟苷、肌苷和黄苷;和其中脱氧核糖与嘌呤碱基结合的脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧肌苷和脱氧黄苷。嘌呤核苷酸是其中磷酸与嘌呤核苷结合的化合物,并且其实例包括腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)和黄苷酸(XMP)。
嘌呤从食品通过肠道吸收供给身体作为饮食嘌呤,或是从氨基酸等经由从头途径从头生物合成。嘌呤还经由补救途径生物合成,通过其由嘌呤核苷酸的降解产生的嘌呤碱被循环利用以合成嘌呤核苷酸。
在人类的情况中,嘌呤核苷酸最终代谢成尿酸。例如,腺苷酸通过5’-核苷酸酶(5’-NT)活性代谢成腺苷,且腺苷经过肌苷代谢成次黄嘌呤。次黄嘌呤通过黄嘌呤脱氢酶(XDH)和黄嘌呤氧化酶(XO)活性转化成黄嘌呤。鸟苷酸通过5’-核苷酸酶活性转化成鸟苷,并且通过嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)活性进一步转化成鸟嘌呤。鸟嘌呤通过鸟嘌呤脱氨酶(GDA)转化成黄嘌呤。黄嘌呤通过黄嘌呤脱氢酶(XDH)和黄嘌呤氧化酶(XO)活性代谢成尿酸。在另一方面,嘌呤核苷(腺苷、肌苷、黄苷和鸟苷)通过嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)活性分别转化成嘌呤碱(腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和鸟嘌呤)。腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤通过补救酶活性(补救途径)主要被再循环分别用于腺苷酸、鸟苷酸、肌苷酸和黄苷酸的生物合成。
乳酸菌具有与人类类似的嘌呤代谢途径;然而,所述嘌呤代谢途径与人类的代谢途径有些不同。例如,大多数乳酸菌将嘌呤核苷最终代谢成碱。此外,在加氏乳杆菌的情况中,嘌呤核苷被嘌呤核苷酶转化成嘌呤碱。
本发明通过使用摄取嘌呤进入细胞的能力作为指标选择(筛选)乳酸菌,使得能够有效地获得(选择)具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。本发明涉及筛选乳酸菌的方法,包括测量含有嘌呤的培养基中乳酸菌嘌呤摄取量,和使用嘌呤摄取量作为指标,获得(选择)具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。更具体地,本发明涉及筛选乳酸菌的方法,包括在含有嘌呤的培养基中培养乳酸菌,优选地随着时间,测量进入细胞的嘌呤摄取量,和使用嘌呤摄取量作为指标,获得(选择)具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。如此获得的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌很可能具有降低血清尿酸水平的作用。在本文,乳酸菌具有大的嘌呤摄取量,即,乳酸菌的细胞具有嘌呤捕获作用的事实,意味着,活体中特别是肠道中的嘌呤被乳酸菌大量捕获,并且从肠道中的环境移除,因此导致抑制肠道的嘌呤吸收。已知乳酸菌被排泄而不从胃肠道被吸收,并且因此,被乳酸菌捕获的嘌呤从肠道吸收逃脱并将与乳酸菌一起被排出身体。因此,本发明还涉及筛选具有降低血清尿酸水平的作用的乳酸菌的方法,包括在含有嘌呤的培养基中培养乳酸菌,测量进入细胞的嘌呤摄取量,使用嘌呤摄取量作为指标选择具有嘌呤捕获作用的乳酸菌,和获得(选择)所得的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌作为具有降低血清尿酸水平的作用的乳酸菌。
本发明中,具有嘌呤摄取能力的乳酸菌示出在嘌呤存在下的高度增殖能力,该能力与高的嘌呤摄取能力相关联。因此,在本发明中,除了使用嘌呤摄取能力作为指标的上述选择之外,还可通过检查在嘌呤存在下所选择的乳酸菌的增殖能力的增强来更准确地获得(选择)具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。即,本发明还涉及筛选乳酸菌的方法,包括在含有嘌呤的培养基中测量具有嘌呤摄取能力的乳酸菌的增殖量,和使用增殖量与如以上描述测量的嘌呤摄取量一起作为指标,获得(选择)具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。此外,本发明还涉及筛选具有降低血清尿酸水平的作用的乳酸菌的方法,包括在含有嘌呤的培养基中培养乳酸菌,测量细菌细胞随着时间的增殖量,使用增殖量与如以上描述测量的嘌呤摄取量一起作为指标选择具有嘌呤捕获作用的乳酸菌,和获得(选择)所得的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌作为具有降低血清尿酸水平的作用的乳酸菌。然而,在本发明中,可以进行或可以不进行在嘌呤的存在下增殖量的测量和使用增殖量作为指标的选择。由乳酸菌大量吸收的嘌呤(例如,嘌呤碱)用于增殖所需的核酸合成,这提供了乳酸菌的高增殖能力。
要经历本发明的筛选方法的乳酸菌是但不特定地限于乳杆菌属(Lactobacillus)细菌。乳杆菌属细菌包括加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.burgalicus)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.lactis)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、瑞士乳杆菌约古特亚种(Lactobacillus helveticussubsp.jugurti)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)、鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)等;并且特别优选的是加氏乳杆菌。要经历本发明的筛选方法的乳酸菌的任何菌株优选地于在合适的培养基(例如,MRS培养基)中培养并且调整其浓度之后在筛选中使用。尽管筛选中使用的培养基是允许加氏乳杆菌细菌增殖的任何培养基,其优选地是已用嘌呤补充的或其中的一些组分已用嘌呤替换的基本培养基或基于基本培养基的培养基。表1示出了特别优选的基本培养基的实例。
要掺入培养基的嘌呤可以是嘌呤碱、嘌呤核苷、和/或嘌呤核苷酸。在一个优选的实施方案中,要掺入培养基中的嘌呤是嘌呤碱。嘌呤碱的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤,并且腺嘌呤是特别优选的。嘌呤核苷的实例包括但不限于腺苷、鸟苷、肌苷和黄苷,并且腺苷是特别优选的。嘌呤核苷酸的实例包括但不限于腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)和黄苷酸(XMP),并且腺苷酸是特别优选的。在另一个实施方案中,嘌呤碱、嘌呤核苷和嘌呤核苷酸的优选实例分别是次黄嘌呤、肌苷(IMP)和肌苷酸,并且次黄嘌呤是特别优选的。
为了测量乳酸菌的嘌呤摄取量,可以优选地使用其中被可定量检测的标记物质标记的嘌呤,例如,用放射性同位素或荧光物质标记的嘌呤作为培养基中含有的嘌呤的一些或全部的培养基。优选的放射性同位素是例如14C。乳酸菌的嘌呤摄取量可被通过以下测量或确定:例如,在含有嘌呤的培养基中培养乳酸菌,培养一段时间之后通过添加TFA(三氟乙酸)或类似物终止反应,基于标记物质的活性的检测定量培养的细胞中标记的嘌呤,和将其与细胞在培养起始时的活性比较。如果乳酸菌的嘌呤摄取量相比于在培养起始时(在培养起始后0分钟的时间点)显著地增加,可以确定乳酸菌具有摄取嘌呤进入细胞的能力(嘌呤摄取能力)。如果乳酸菌的嘌呤的摄取量相比于在培养起始时(在培养起始后0分钟的时间点)非常显著地增加,可确定乳酸菌具有摄取嘌呤进入细胞的高能力(高嘌呤摄取能力)。可选地,如果乳酸菌的嘌呤摄取量相比于加氏乳杆菌JCM1130菌株显著地增加,可进一步确定乳酸菌具有摄取嘌呤进入细胞的高能力(高嘌呤摄取能力)。本发明中,可获得(选择)如此确定的具有嘌呤摄取能力的乳酸菌作为具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。选作具有嘌呤捕获作用的乳酸菌的乳酸菌然后可被获得(选择)作为具有降低血清尿酸水平的作用的乳酸菌,或其候选物。乳酸菌的培养时期优选地持续直到生长曲线的延滞期或对数期中的任何时间点。例如,可以培养乳酸菌直到从培养起始之后的30分钟和60分钟,然后可以测量嘌呤摄取能力等。在该测量中,通常,可以使用液体闪烁计数器测量放射性同位素标记的嘌呤的放射性。
通过以下可以测量或确定在嘌呤的存在下乳酸菌的增殖量:例如,在含有嘌呤的培养基中培养乳酸菌,测量在培养起始和培养持续一段时间之后的培养基的浊度(通常在650nm的吸光度),以及计算它们之间的差别。如果在嘌呤的存在下培养的培养基的浊度增加水平相比于在不存在嘌呤下培养的培养基的浊度增加水平显示显著增加的水平,可以确定培养中使用的乳酸菌在嘌呤的存在下示出增强的增殖能力。可选地,如果在嘌呤的存在下培养的培养基的浊度增加水平相比于加氏乳杆菌JCM1130菌株显示显著增加的水平,可进一步确定乳酸菌在嘌呤的存在下示出显著增强的增殖能力。乳酸菌具有嘌呤摄取能力并且在嘌呤的存在下示出增强的增殖能力的事实意味着,乳酸菌能够高度同化嘌呤。即,这支持乳酸菌能够高度捕获嘌呤,并且因此支持乳酸菌具有降低血清尿酸水平的作用的可能性。乳酸菌的培养时期优选地持续直到生长曲线的对数期中的任何时间点。例如,可培养乳酸菌直到从培养起始之后的4小时和6小时,并且可以测量其在嘌呤的存在下的增殖能力等。
在以上描述的测量中,优选地,以1.0x 106至1.0x 1011cfu,例如0.8x 107至3x107cfu每1mL培养基接种和培养乳酸菌。尽管乳酸菌的培养条件不特别限定,优选地在30至39℃、优选地36至38℃厌氧地培养乳酸菌。°°
本发明中,还优选对如以上描述选择的乳酸菌进一步测试其是否具有降低血清尿酸水平的作用,例如,根据在下面描述的实施例中描述的方法。例如,可通过以下确定如以上描述选择的乳酸菌是否具有降低血清尿酸水平的作用:向受试者以单剂量或多剂量施用以上选择的乳酸菌,测量血清尿酸水平,和检查血清尿酸水平中存在或不存在变化(血清尿酸水平的降低)。
如以上描述选择的乳酸菌具有嘌呤摄取能力,并且优选地在嘌呤的存在下的高增殖能力,和,即,具有高的嘌呤捕获作用。此类乳酸菌通常具有降低血清尿酸水平的作用。如以上描述选择的乳酸菌可以发挥在活体中(通常在肠道中)的嘌呤摄取能力和在嘌呤的存在下的高增殖能力(即,高的同化嘌呤的能力),并因此捕获和降低活体中(通常在肠道中)的大量的嘌呤,以及减少嘌呤吸收的量,从而降低血清尿酸水平。可被选择的乳酸菌获取即捕获的嘌呤的实例包括嘌呤碱、嘌呤核苷、和/或嘌呤核苷酸。可被选择的乳酸菌获取的嘌呤不必限于被掺入筛选中的培养基中的嘌呤。嘌呤碱的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤。嘌呤核苷的实例包括但不限于腺苷、鸟苷、肌苷和黄苷。嘌呤核苷酸的实例包括但不限于腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)和黄苷酸(XMP)。在一个实施方案中,可由选择的乳酸菌获取的嘌呤包含选自由腺嘌呤、腺苷、腺苷酸、次黄嘌呤、肌苷和肌苷酸组成的组中的至少一种,优选全部。
本发明还提供通过上述筛选方法选择的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。此类乳酸菌通常具有降低血清尿酸水平的作用。
此外,本发明还提供一种用于捕获嘌呤的剂,优选用于口服施用的用于捕获嘌呤的剂,其包含通过上述筛选方法可获得的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌(以下也称为本发明的乳酸菌)作为活性成分。本发明的嘌呤捕获剂除了本发明的加氏乳杆菌以外,还可含有口服施用可接受的载体或添加剂。本发明的用于捕获嘌呤的剂可以是含有本发明的乳酸菌的细胞的药物或组合物,或用于捕获嘌呤的剂可以是使用该细菌的发酵产品或产生的培养物,或其浓缩物或干燥产品,或含有以上任一种的药物或组合物。本发明的用于捕获嘌呤的剂中含有的根据本发明的乳酸菌优选地是活细胞。如以上描述的,本发明的用于捕获嘌呤的剂通过乳酸菌对嘌呤的摄取,具有减少肠道中的嘌呤的作用,并且因此可优选地用于减少肠道中的嘌呤,并且因此用于降低血清尿酸水平。此外,本发明的乳酸菌或本发明的用于捕获嘌呤的剂摄入作为鱼或肉中可口成分的嘌呤,例如嘌呤核苷酸如肌苷酸(IMP)和腺苷酸(AMP),进入细胞,并减少这种嘌呤从肠道吸收到身体中。因此,本发明的乳酸菌或本发明的用于捕获嘌呤的剂也可用于减少这种可口成分从肠道的吸收。本发明还提供一种用于减少可口成分(本文中,作为鱼或肉中的可口组分的嘌呤或嘌呤核苷酸例如肌苷酸)的吸收的剂,包含本发明的乳酸菌或者本发明的用于捕获嘌呤的剂。这一用于减少可口成分的吸收的剂还优选地用于在口服施用中使用。
如以上描述的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌的优选的实例,包括但不限于,加氏乳杆菌细菌诸如加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌P14054ME002菌株。加氏乳杆菌OLL2959菌株是同型乳酸发酵的,并且缺少产气能力。加氏乳杆菌OLL2959菌株于2006年3月31日(原始保藏日期)以登录号NITE P-224保藏在国家技术评估学会,专利微生物保藏中心(NPMD)(#122,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba 292-0818,日本),并且随后以原始的登录号改变而成的登录号NITE BP-224于2007年11月21日被转移为布达佩斯条约规定的保藏(国际保藏)。可选地,在另一实施方案中,如以上描述的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌可以是除了加氏乳杆菌OLL2959菌株以外的乳酸菌或加氏乳杆菌细菌。
本发明中,根据本发明的用于捕获嘌呤的剂还意图与食品或饮料产品或药物制剂组合使用。因此,本发明还提供了根据本发明的用于捕获嘌呤的剂,用于与食品或饮料产品或药物制剂组合使用。
本发明还提供了包含根据本发明的用于捕获嘌呤的剂的食品或饮料产品或药物制剂。本发明的食品或饮料产品或药物制剂可通过在施用其的(或摄取其的)受试者中使嘌呤主动摄取进入细胞及使其同化,提供肠道中嘌呤的减少和血清尿酸水平的有效减少。因此,本发明的食品或饮料产品或药物制剂可用于在减少肠道中的嘌呤中使用。本发明的“肠道中的嘌呤”不包括被存在于肠道中的细菌(例如,乳酸菌)、真菌、病毒、受试者的细胞等等携带的嘌呤。本发明的食品和饮料产品和药物制剂还可以基于肠道中的嘌呤的减少,用于在降低血清尿酸水平中使用。本发明的含有用于捕获嘌呤的剂的食品或饮料产品或药物制剂可以优选地用于,例如,预防、治疗、改善或缓解痛风或高尿酸血症的症状。
本文的“食品或饮料产品”包括但不特别地限于饮料、食品产品和功能性食品。根据本发明的食品或饮料产品的类型不特别限定,并且饮料的实例包括发酵牛奶(酸奶饮料等)、乳酸菌饮料、牛奶饮料(咖啡口味的牛奶、水果口味的牛奶等)、基于茶的饮料(绿茶、红茶、乌龙茶等)、基于水果/蔬菜的饮料(含有水果汁诸如桔子汁、苹果汁、或葡萄汁,或蔬菜汁诸如西红柿汁或胡萝卜汁的饮料)、酒精饮料(啤酒、发泡酒精饮料、葡萄酒等)、碳酸饮料、软饮料和水。优选的饮料的实例包括酸奶饮料、乳酸菌饮料、牛奶饮料和基于水的饮料,并且特别优选的饮料的实例包括酸奶饮料。对于多种饮料的生产方法等,现有的手册诸如“Latest Soft Drinks”(2003)(Korin Corporation)例如可以提供参考。食品产品的实例包括发酵牛奶(凝固型酸奶、软酸奶、奶酪等)、乳制品、糕点糖果和即食食品。优选的食品产品的实例包括凝固型酸奶或软酸奶和糕点糖果,并且特别优选的食品产品的实例包括凝固型酸奶或软酸奶。对于多种食品产品的生产方法等,现有的手册可以提供参考。
含有具有嘌呤捕获作用的乳酸菌的发酵牛奶诸如酸奶,可通过例如添加具有嘌呤捕获作用的乳酸菌到使用发酵剂产生的乳制品或发酵牛奶中生产,所述发酵剂可含有可能具有或可能不具有嘌呤捕获作用的其他微生物诸如乳酸菌。可根据常规方法生产使用发酵剂的乳制品或发酵牛奶。例如,可通过将发酵剂混合进入在加热、混合、均化和巴氏消毒法处理后冷却的牛奶或乳制品,以及随后的发酵和将其冷却生产酸奶。本发明优选地提供具有嘌呤捕获作用的乳酸菌在生产乳制品或发酵牛奶诸如酸奶或奶酪中的用途(其优选地包括添加(混合)乳酸菌到乳制品或发酵牛奶、或其原材料),并且特别优选地提供乳酸菌在酸奶生产中的用途。此外,本发明还提供了在发酵牛奶或乳制品诸如酸奶或奶酪的生产中基于乳酸菌的嘌呤捕获作用降低嘌呤的方法,该方法使用具有嘌呤捕获作用的乳酸菌作为活性组分。根据本发明的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌(例如,加氏乳杆菌OLL2959菌株)可在发酵牛奶或乳制品例如酸奶中表现出良好的存活性。
功能性食品作为根据本发明的食品或饮料产品是特别优选的。本发明的“功能性食品”指对身体具有某些功能的食品并且涵盖通常所谓的健康食品,例如,具有健康要求的食品包括在日本用于指定的健康用途的食品(包括用于指定的健康用途的合格的食品)和具有营养功能要求的食品、具有功能要求的食品、用于指定膳食用途的食品、营养补充品、健康补充品、补充品(例如,呈多种剂型诸如片剂、包衣片剂、糖衣片剂、胶囊和液体)和用于美容的食品(例如,减肥食品)。本发明的功能性食品还涵盖适用基于Codex(FAO/WHO联合食品法规委员会)的食品标准的健康要求的健康食品。
作为本发明的功能性食品的更具体地优选的实例包括用于指定的膳食用途的食品,诸如用于病人的食品、用于孕妇和泌乳母亲的奶粉、用于婴儿的改良的奶粉、用于老年人的食品和护理食品。
本发明的该功能性食品通过减少肠道中的嘌呤对于降低血清尿酸水平特别有用。本发明的功能性食品可以优选地用于降低血清尿酸水平,特别是随着肠道中嘌呤的减少(通过乳酸菌摄取嘌呤和乳酸菌的促进的增殖)以及导致的肠道中的嘌呤吸收的降低用于降低血清尿酸水平。
本发明的食品或饮料产品诸如功能性食品(优选地用于指定的健康用途的食品或用于指定的健康用途的合格食品)可用于在减少肠道中的嘌呤中使用或在降低血清尿酸水平或抑制或缓解血清尿酸水平的增加中使用,并且可包括说明书或其指示。本发明优选地提供了具有嘌呤捕获作用的乳酸菌在生产此类功能性食品中的用途(其优选地包括添加(混合)乳酸菌到功能性食品或其原材料)。
本发明的功能性食品可以是固体制剂诸如片剂、颗粒剂、粉末、药丸和胶囊;液体制剂诸如液体、悬浮液和糖浆;凝胶或糊剂;或可以呈通常的食品或饮料产品的形式(例如,饮料、酸奶和糕点糖果)。
本发明的食品或饮料产品可含有不特别限定的任何食品组分。本发明的食品或饮料产品可含有水、蛋白质、糖类、脂类、维生素、矿物质、有机酸、有机碱、果汁、香料等。蛋白质的实例包括动物和植物性蛋白质诸如全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白质和肉类蛋白质,以及其水解产物;和多种牛奶来源的组分诸如黄油、乳清矿物质(whey mineral)、奶油、乳清、非蛋白氮、唾液酸、磷脂和乳糖。糖类的实例包括一般的糖类、改性淀粉(糊精、可溶性淀粉、英国淀粉、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)和膳食纤维。脂类的实例包括动物脂肪和油如猪油和鱼油、以及其分馏油、氢化油、和交酯化油(interesterified oil);植物性脂肪和油诸如棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、和椰子油、以及其分馏油、氢化油、和交酯化油。维生素的实例包括维生素A、胡萝卜素、维生素B族、维生素C、维生素D族、维生素E、维生素K族、维生素P、维生素Q、尼克酸(niacin)、烟酸(nicotinic acid)、泛酸、生物素、肌醇、胆碱和叶酸;和矿物质的实例包括钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒、和乳清矿物质。有机酸的实例包括苹果酸、柠檬酸、乳酸和酒石酸。这些组分可以单独或以两种或更多种的组合使用,并且可使用含有大量的这些组分的合成的产品和/或食品被添加。
以上描述的含有本发明的乳酸菌或用于捕获嘌呤的剂的功能性食品除了本发明的乳酸菌或用于捕获嘌呤的剂之外,还可含有口服施用可接受的载体或添加剂。载体的实例包括水、口服施用可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、精氨酸钠、水溶性右旋糖酐、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖、和口服施用可接受的表面活性剂。添加剂的实例包括粘结剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、稳定剂、缓冲剂、调味剂、防腐剂和着色剂。这些载体或添加剂可单独或以两种或更多种的组合使用,并且可根据制剂的剂型适当地使用。本发明的功能性食品可另外含有其他功能组分。
此外,含有本发明的乳酸菌或用于捕获嘌呤的剂的药物制剂(或药物组合物),除了本发明的乳酸菌或用于捕获嘌呤的剂之外,可含有药学上可接受的载体或添加剂,特别是口服施用可接受的载体或添加剂。载体的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、精氨酸钠、水溶性右旋糖酐、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂和人工细胞结构诸如脂质体。添加剂的实例包括粘结剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、稳定剂、缓冲剂、调味剂、防腐剂和着色剂。这些载体或添加剂可单独或以两种或更多种的组合使用,并且可根据制剂的剂型适当地使用。本发明的这种药物制剂可另外含有其他药物组分。
本发明的上述药物制剂优选地口服施用。本发明的药物制剂可采取任何剂型,例如,固体制剂诸如片剂、颗粒剂、粉末、丸剂、或胶囊、凝胶,或液体制剂诸如液体、悬浮液或糖浆。
本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂的剂量(摄取量)可以在熟练的技术人员的自由裁量的宽的范围上改变,考虑到用于施用(喂食)的受试者的年龄和体重、施用途径、剂量数等等。关于本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂的剂量,剂量是使得以每剂量以下量施用本发明的乳酸菌(例如加氏乳杆菌细菌)的量:例如,优选地以1x 105至1x 1011cfu的量,更优选地以1x 108至1x1010cfu的量,还更优选地以1x 109至1x 1010cfu的量,及特别优选地以4x 109至6x 1010cfu的量,尽管剂量不特别限于此。本发明的用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂优选地以每剂量1x 105至1x 1011cfu的量,更优选地以1x 108至1x 1010cfu的量,还更优选地以1x 109至1x 1010cfu的量,及特别优选地以例如,4x 109至6x 1010cfu的量含有本发明的乳酸菌。
在本发明的一个实施方案中,本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂被一天一次或更多次,优选地一天两次或更多次,及更优选地一天两次向受试者施用(或被消费者摄取)。本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂可持续地向受试者施用,并且例如可每天施用。在该情况中,本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂被向受试者施用持续至少一周,优选地2周或更多,及更优选地4周或更多。当持续地向受试者施用本发明的用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂时,其优选地以每剂量1x 105至1x 1011cfu的量,更优选地以1x108至1x 1010cfu的量,还更优选地以1x 109至1x 1010cfu的量,及特别优选地以例如,4x109至6x 1010cfu的量施用本发明的乳酸菌。
在本发明的另一个实施方案中,本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂可以以单剂量施用。当本发明的用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂以单剂量向受试者施用时,其优选地以每剂量1x 105至1x 1011cfu的量,更优选地以1x 108至1x 1010cfu的量,还更优选地以1x 109至1x 1010cfu的量,及特别优选地以例如,4x109至6x 1010cfu的量施用本发明的乳酸菌。本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂、或食品或饮料产品或药物制剂优选地口服施用(口服摄取)。
本文“施用”包括通常用于食品和饮料产品的“摄取”和用于药物制剂的“施用”二者。本发明中的“口服施用”除了通过口的施用或摄取之外,还包括通过鼻管、胃管等经由管饲的施用。因此,本发明还提供了可用于此类口服施用的口服制剂。在本发明的优选的实施方案中,因此,还提供了包含本发明的乳酸菌或用于捕获嘌呤的剂的口服制剂,用于在减少肠道中的嘌呤及降低血清尿酸水平中使用。
向其施用本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂或食品或饮料产品或药物制剂的受试者是哺乳动物,包括人类、家畜、宠物和实验室(实验)动物。受试者优选地是人类受试者,更优选地是患有痛风和/或高尿酸血症的人类受试者,和还更优选地,具有6mg/dL或更多,例如6至10mg/dL的血清尿酸水平的人类受试者。在一个实施方案中,施用的受试者甚至更优选地是具有6至8mg/dL的血清尿酸水平的患有轻微到边缘高尿酸血症的人类受试者。本发明还提供了一种用于减少肠道中的嘌呤并降低血清尿酸水平的方法,包括向上述受试者施用(对受试者喂食)本发明的乳酸菌或如上所述的包含有效量的本发明的乳酸菌的本发明的用于捕获嘌呤的剂或本发明的食品或饮料产品或药物制剂,由此使得嘌呤被捕获到乳酸菌的细胞中。本发明还提供了一种将嘌呤捕获到乳酸菌细胞中的方法,包括使本发明的乳酸菌或用于捕获嘌呤的剂与嘌呤接触。本发明还提供了本发明的乳酸菌或用于捕获嘌呤的剂用于对食品或饮料产品、药物制剂或其它药物赋予嘌呤捕获作用的用途。本发明还提供了本发明的乳酸菌、用于捕获嘌呤的剂、食品或饮料产品或药物制剂用于降低痛风或高尿酸血症发病风险的用途。
实施例
在下文中,将更具体地参考实施例描述本发明。然而,本发明的技术范围并不应局限于这些实施例。
[实施例1]评价嘌呤摄取能力的测试
在本实施例中,使用用放射性同位素(RI)标记的嘌呤,评价加氏乳杆菌OLL2959菌株的嘌呤摄取能力。
加氏乳杆菌OLL2959菌株于2006年3月31日(原始保藏日期)以登录号NITE P-224保藏在国家技术评估学会,专利微生物保藏中心(NPMD)(#122,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba 292-0818,日本),并且随后以原始登录号改变而成的登录号NITEBP-224于2007年11月21日被转移为布达佩斯条约规定的保藏(国际保藏)。将加氏乳杆菌OLL2959菌株接种到MRS培养基中(乳杆菌MRS肉汤,Difco Co.,Ltd.),并且在37℃培养持续16至20小时,得到的培养物(4至7x 108cfu/ml)在下面使用。
向0.1mL的基本培养基(DM培养基;表1)添加用放射性同位素14C标记的腺苷酸(AMP)、腺苷、或腺嘌呤(分别是14C-AMP、14C-腺苷、或14C-腺嘌呤)到20μM的终浓度,然后以2wt%(0.002mL:0.8至1.4x 106cfu)接种以上制备的加氏乳杆菌OLL2959菌株的培养物,并在37℃厌氧培养持续30分钟。°
随后将TFA溶液(5%的三氟乙酸)添加到这些培养基,然后用生理盐水洗涤细胞,之后使用液体闪烁计数器(由Aloka Co.,Ltd.制造,LSC-6100)测量放射性。作为对照(0分钟),在样品的制备之后立即添加TFA溶液(5%),然后用生理盐水洗涤细胞,之后如以上描述的测量放射性。结果示于图1中。图1中,表示细胞中14C标记的嘌呤量的放射性单位(纵轴)是每分钟衰变数(dpm),其代表放射性物质每分钟衰变的数目。证实,在使用DM培养基持续60分钟的培养中,活细胞计数在测试起始和测试结束间未显著地改变。
结果示出,加氏乳杆菌OLL2959菌株具有摄取腺苷酸(AMP)、腺苷和腺嘌呤(其是嘌呤)进入细胞的能力(嘌呤摄取能力),并且特别具有高的摄取腺嘌呤进入细胞的能力(嘌呤摄取能力)(图1)。
[表1]
基本培养基组成
[实施例2]评价在嘌呤的存在下的增殖能力的测试
在本实施例中,在嘌呤的存在下培养加氏杆菌OLL2959菌株,并且评价其在嘌呤的存在下的增殖能力。
向1mL的DM培养基(表1)添加腺苷酸(AMP)、腺苷、或腺嘌呤作为嘌呤到400μM的终浓度,然后将在实施例1中制备的加氏乳杆菌OLL2959菌株的培养物以4wt%(0.04mL:1.6至2.8x 107cfu)接种,并在37℃厌氧培养。在从这一培养起始0小时、4小时和6小时后,测量培养基的浊度(在650nm的吸光度)。作为对照,除了不将嘌呤添加到基本培养基之外,以相同的方式培养加氏乳杆菌OLL2959菌株,并测量培养基的浊度。结果示于图2中。
结果示出,在腺苷酸(AMP)、腺苷或腺嘌呤的存在下,加氏乳杆菌OLL2959菌株的增殖能力增强,并且特别是在腺嘌呤的存在下,增殖能力被进一步增强(图2)。
[实施例3]腺嘌呤摄取能力和在腺嘌呤的存在下的增殖能力的比较测试
在本实施例中,在腺嘌呤的存在下培养加氏乳杆菌OLL2959菌株和其他加氏乳杆菌菌株,并且比较各自菌株的腺嘌呤摄取能力和在腺嘌呤的存在下的增殖能力。
使用加氏乳杆菌P14054ME001菌株和P14054ME002菌株作为其他的加氏乳杆菌菌株。当在不含有嘌呤的MRS培养基(乳杆菌MRS肉汤,Difco,Co.,Ltd.)中培养加氏乳杆菌P14054ME001菌株和P14054ME002菌株持续20小时时,每种菌株的增殖能力与加氏乳杆菌OLL2959菌株相当(表2)。
[表2]
腺嘌呤摄取能力的评价测试如实施例1中描述的进行,除了仅使用腺嘌呤(14C-腺嘌呤)作为用放射性同位素14C标记的嘌呤。结果示于图3中。发现,加氏乳杆菌P14054ME002菌株也具有高的腺嘌呤摄取能力(图3),但是加氏乳杆菌P14054ME002菌株不具有与加氏乳杆菌OLL2959菌株一样高的腺嘌呤摄取能力。发现,加氏乳杆菌P14054ME001菌株具有低于加氏乳杆菌OLL2959菌株和P14054ME002菌株的腺嘌呤摄取能力(图3)。
为了评价在腺嘌呤的存在下的增殖能力,将腺嘌呤添加到1mL的DM培养基(表1)中到400μM的终浓度,然后将在实施例1中制备的加氏乳杆菌OLL2959菌株的培养物和以与实施例1中描述的相同的方式制备的P14054ME001菌株的培养物和P14054ME002菌株的培养物中的任一个以4wt%(0.04mL:1.6至2.8x 107cfu)接种,并在37℃厌氧培养。在从这一培养起始0小时、4小时和6小时后,测量培养基的浊度(在650nm的吸光度)。结果示于图4中。如同加氏乳杆菌OLL2959菌株,加氏乳杆菌P14054ME001菌株和P14054ME002菌株在腺嘌呤的存在下也示出增强的增殖能力。此外,加氏乳杆菌OLL2959菌株示出远远高于加氏乳杆菌P14054ME001菌株和P14054ME002菌株的增殖能力的增强程度。加氏乳杆菌P14054ME002菌株具有高于加氏乳杆菌P14054ME001菌株的增殖能力的增强程度。
这些结果示出,加氏乳杆菌细菌中,在腺嘌呤的存在下的增殖能力的增强与腺嘌呤摄取能力的程度相关联。此外,乳酸菌的一些物种示出具有高的同化腺嘌呤的能力。
[实施例4]加氏乳杆菌OLL2959菌株降低血清尿酸水平的作用的评价测试
怀疑具有轻微到边缘高尿酸血症的人类受试者被持续喂食加氏乳杆菌OLL2959菌株,使用安慰剂对照双盲比较研究分析其对尿酸水平的影响(使用人类受试者的测试)。
将在测试起始之前的检查中具有6至8mg/dL的尿酸水平的14名35岁及以上的成年男性(平均年龄:44.3岁)分配成两组:即,安慰剂组和活性组,以在尿酸水平和年龄方面不产生显著差异。安慰剂组每天摄取两杯(85g/杯)不含有加氏乳杆菌OLL2959菌株的酸奶,持续4周。活性组每天摄取两杯(85g/杯)酸奶,持续4周,其中将1x 108cfu/g的加氏乳杆菌OLL2959菌株添加到与对安慰剂组提供的相同的酸奶中。在早餐、午餐和晚餐中的任何两餐后喂食每天两杯的酸奶。
对每个受试者测试其在测试起始(摄取测试食品之前)、及2周和4周之后(测试食品摄取时期)的血液,并且使用常规方法测量血清尿酸水平。计算相比于在测试起始的血清尿酸水平,在每个时间点血清尿酸水平中变化的量,并且使用双因子重复量度ANOVA统计分析测试时期期间血清尿酸水平中变化的量的时间过程。结果示于图5中。
如图5中示出的,相比于安慰剂组,活性组具有显著低的血清尿酸水平(p=0.042)。即,示出加氏乳杆菌OLL2959菌株具有降低血清尿酸水平的作用。
[实施例5]利用加氏乳杆菌细菌的单剂量测试(动物测试)
与人类不同,大鼠具有尿酸酶,其是降解尿酸的酶,因此,为了提高血清尿酸水平,必须给予它们为尿酸酶抑制剂的氧嗪酸钾(potassium oxonate)。因此,在禁食16小时后,对Wistar大鼠(雄性)强制口服施用0.5g/kg的氧嗪酸钾。给予氧嗪酸钾后60分钟,向乳酸菌组强制施用用于嘌呤负荷的口服干燥酵母(悬浮在注射用水中)和加氏乳杆菌OLL2959菌株(悬浮在生理盐水中)。向阴性组施用注射用水代替干燥的酵母,并用生理盐水代替加氏乳杆菌细菌。向对照组施用生理盐水代替加氏乳杆菌细菌、以及干燥的酵母。
在强制口服施用后,随着时间(30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和150分钟后)收集血液,使用常规方法测量每个血液样品中的血液尿酸水平,和检查血液尿酸水平的时间过程。如果乳酸菌组的血液尿酸水平的时间过程比对照组中的低,证明,从肠道的嘌呤吸收量一般地由于加氏乳杆菌OLL2959菌株的嘌呤摄取作用而降低,甚至在单剂量。
[实施例6]加氏乳杆菌细菌的嘌呤摄取能力(动物测试)
认为,如果乳酸菌的嘌呤摄取能力高,相比于仅用嘌呤喂食受试者的情况,进入(通过)动物受试者的乳酸菌和嘌呤同时施用(摄取)抑制受试者中的嘌呤吸收。因此,为了测试加氏乳杆菌细菌的嘌呤摄取能力,使用下面的程序进行动物实验。
最初,购买14只8周龄Wistar大鼠(雄性,190g至210g)并且使其适应环境持续一周。从测试前一天使这些大鼠禁食持续约16小时,并测量禁食后的体重。基于禁食后的体重,通过随机取样,使用分组程序将大鼠总计分成三组,即,阴性组(生理盐水处理组)、AMP(放射性同位素14C-AMP)处理组和AMP+OLL2959菌株(放射性同位素14C-AMP和OLL2959菌株)处理组(阴性组仅包括四只大鼠,且其他组的每个包括五只大鼠)。将在非麻醉状态的所有这些大鼠放在固定器上,用手术刀割破尾静脉,用红细胞压积管收集60μL的从尾静脉渗出的血液。该血液用作施用测试物质之前在0分钟时间点收集的血液样品。将等量的2mg/mLEDTA-2Na溶液(EDTA-2Na溶于生理盐水中)添加到这些收集的血液样品中。
然后强制口服施用测试物质。作为此处的测试物质,对阴性组使用生理盐水,对AMP处理组使用用放射性同位素14C标记的腺苷酸(14C-AMP:57.6mCi/mmol,0.1mCi/ml),和对AMP+OLL2959菌株处理组使用14C-AMP和加氏乳杆菌OLL2959菌株(1x 1010cfu/个体)。用生理盐水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.)稀释14C-AMP和OLL2959菌株并使用。对AMP组和AMP+OLL2959组,施用10μCi/个体的14C-AMP。所有个体(所有组)中的剂量体积是2mL/个体。
在施用测试物质15、30、45、60、90、120和180分钟后,将在非麻醉状态的所有这些大鼠放在固定器上,用手术刀割破尾静脉,用红细胞压积管收集60μL的从尾静脉渗出的血液。将等量的2mg/mL EDTA-2Na溶液(EDTA-2Na溶于生理盐水中)添加到这些收集的血液样品中。完成这些测试之后,立即通过吸入二氧化碳将这些大鼠处死。
使用液体闪烁计数器(由Aloka Co.,Ltd.制造,LSC-6100)测量这些收集的血液样品中的放射性。结果示于图6中。
如图6中示出的,在施用30、45和60分钟后,即,当达到血液浓度的峰时,观察到嘌呤吸收量中的显著差异(*p<0.05,**p<0.01;t-检验)。这些结果示出,嘌呤从肠道吸收的量可通过摄取加氏乳杆菌OLL2959菌株被抑制。
[实施例7]利用加氏乳杆菌细菌的单剂量测试(使用人类受试者的测试)
20岁以上的健康男性摄取498mg嘌呤制品(5'-腺苷酸、5'-肌苷酸二钠和5'-鸟苷酸二钠的混合物)一次,摄取后30分钟、60分钟、120分钟和150分钟后收集血液,并检查血液尿酸水平的时间过程。选择显示相似时间过程的十个受试者作为本实施例中待测试的受试者。在该测试中,所选受试者摄取112mL含有加氏乳杆菌OLL2959菌株的酸奶(活性组;含有8.5x 107cfu/mL的加氏乳杆菌OLL2959菌株)或不含该细菌的酸奶(安慰剂组)。在摄取后30分钟、60分钟、120分钟和150分钟收集血液,使用常规方法测量每个血液样品中的血液尿酸水平,检查血液尿酸水平的时间过程,和进行交叉测试。如果尿酸水平的增加在活性组中比在安慰剂组中受到更大阻遏,证明从肠道的嘌呤吸收量被单剂量的加氏乳杆菌OLL2959菌株的嘌呤摄取作用降低。
[实施例8]乳酸菌菌株间的比较测试
(1)腺嘌呤摄取能力的比较测试
在含有用放射性同位素(RI)标记的腺嘌呤(14C-腺嘌呤)的培养基中培养加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株,并且比较乳酸菌菌株对腺嘌呤摄取能力的影响。加氏乳杆菌JCM1130菌株以JCM1130从日本微生物保藏中心(Japan Collection ofMicroorganisms),RIKEN生物资源中心(RIKEN BRC JCM;Tsukuba City,IbaragiPrefecture,Japan)可得。
使用MRS培养基培养加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株中的每种,并且提前评价其增殖能力。即,在37℃使用MRS培养基厌氧培养加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株中的每种持续20小时。厌氧培养20小时之后,加氏乳杆菌JCM1130菌株的细菌数比加氏乳杆菌OLL2959菌株的高不少于2.5倍。这揭示,当在相同的培养基中培养加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株时,加氏乳杆菌JCM1130菌株相比于另一个基本上具有更高的增殖能力(表3)。
[表3]
在腺嘌呤摄取能力的比较测试中,最初,通过添加14C-腺嘌呤到基本培养基(表1)到20μM的终浓度制备用于该测试的培养基。然后,使用MRS培养基培养加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株中的每种,并且将这些培养物以2wt%接种到用于该测试的培养基中,并且在37℃厌氧培养。使用MRS培养基调整这些培养物中的每种以给出相等的细菌数。
在培养起始(0分钟)、和从培养起始30或60分钟后,添加5%TFA溶液以终止培养,并且随后用生理盐水洗涤细胞,之后使用液体闪烁计数器(由Aloka Co.,Ltd.制造,LSC-6100)测量其放射性。结果示于图7中。图7中的放射性(纵轴)表示为放射性物质每分钟衰变的数目(每分钟衰变数;dpm)。
如图7中示出的,加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株二者都发挥腺嘌呤摄取能力,但从培养起始30和60分钟后,加氏乳杆菌OLL2959菌株相比于加氏乳杆菌JCM1130菌株,摄取更高量的腺嘌呤并且在腺嘌呤摄取的量中示出显著差异(p<0.05,t-检验)。
结果示出,加氏乳杆菌OLL2959菌株相比于在MRS培养基中具有高的增殖能力的加氏乳杆菌JCM1130菌株,能够摄取显著更高量的嘌呤。
(2)在腺嘌呤的存在下增殖能力的比较测试
在腺嘌呤的存在下培养加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株,并且比较乳酸菌菌株对细胞的增殖能力的影响。
将腺嘌呤添加到基本培养基(表1)到400μM的终浓度,且制备用于该测试的培养基。然后,使用MRS培养基培养加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株中的每种,并且将这些培养物以4wt%接种到用于该测试的培养基中,并且在37℃厌氧培养。在培养起始(0小时)和从培养起始4小时和6小时后,测量浊度(在650nm的吸光度)。结果示于图8中。
如图8中示出的,揭示,加氏乳杆菌OLL2959菌株和加氏乳杆菌JCM1130菌株二者在腺嘌呤的存在下都具有增强的增殖能力,但加氏乳杆菌OLL2959菌株的增殖能力的增强的程度显著高于在MRS培养基中具有高的增殖能力的加氏乳杆菌JCM1130菌株(p<0.05,t-检验)。因此揭示,在加氏乳杆菌OLL2959菌株中,在嘌呤存在下的增殖能力被大大地增强。
[实施例9]嘌呤用于核酸合成的利用
进行测试以验证加氏乳杆菌OLL2959菌株在摄取腺嘌呤后的增殖过程中如何利用腺嘌呤。
收集培养中的加氏乳杆菌OLL2959菌株的细胞,调整至1.0x 1010(1.0E+10)cfu/ml,并以6%接种到包含终浓度为400μM的腺嘌呤的基本培养基中。然后,加入14C-腺嘌呤,在0、1、2、3和4小时后收集培养基,并测量浊度(在650nm处的OD)。此外,通过在4℃以3,000rpm离心培养基10分钟收集细胞,并用蒸馏水洗涤两次,随后使用DNA提取试剂盒ISOPLANT II(Nippon Gene)从细胞提取核酸。使用分光光度计测量提取的核酸的浓度。然后,将提取的核酸全部加入到含有液体闪烁混合物的小瓶中,并使用液体闪烁计数器测量放射性。
结果,浊度以培养时间依赖性方式增加(OLL2959菌株增殖),并且核酸的量(DNA浓度)也以培养时间依赖性方式增加(图9)。此外,因为来自核酸的放射性也随着核酸的量增加而增加(图10),证明,OLL2959菌株获取腺嘌呤并利用腺嘌呤合成细胞增殖所需的核酸。
[实施例10]加氏乳杆菌细菌的次黄嘌呤和IMP(肌苷酸)摄取能力的评价(动物测试)
购买二十八只Wistar大鼠(8周龄),并适应大约一周。从测试前一天使这些大鼠禁食持续约16小时,测量禁食后的体重。基于禁食后的体重,将大鼠总计分成三组,即,阴性对照(生理盐水)组、IMP(放射性同位素14C-IMP)处理组和IMP+OLL2959菌株(放射性同位素14C-IMP和OLL2959菌株)处理组(阴性对照组仅包括八只大鼠,且其他组的每个包括十只大鼠)。
在所有情况下,通过非麻醉状态的大鼠的尾静脉收集60μL血液。该血液用作施用测试物质之前在0分钟时间点收集的血液样品。将这些收集的血液样品与等量的2mg/mLEDTA-2Na溶液(EDTA-2Na溶于生理盐水中)混合并在冰上冷却。
然后将测试物质强制口服施用于大鼠。向IMP处理组施用2mL/个体的用生理盐水稀释的14C-IMP。向IMP+OLL2959菌株处理组施用2mL/个体的通过施用前混合14C-IMP和OLL2959菌株制备的混合物。对这些组,以10μCi/个体施用14C-IMP。向阴性对照组施用2mL/个体的生理盐水。
在所有的情况下,在施用测试物质后的15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟和180分钟的时间点,通过非麻醉状态下的大鼠的尾静脉收集60μL血液。将收集的血液样品与等量的2mg/mL EDTA-2Na溶液混合并在冰上冷却。
使用液体闪烁计数器测量收集的血液样品中的放射性。
此外,使用14C-次黄嘌呤代替14C-IMP类似地进行动物测试。在使用14C-次黄嘌呤的该测试中,使用总共三组,即阴性对照(生理盐水处理)组、次黄嘌呤处理组和次黄嘌呤+OLL2959菌株处理组(阴性对照组仅包括四只大鼠,且其他各组包括五只大鼠)。
结果示于图11至14中。如图11和12所示,在测试物质的血液浓度达到峰值的时间点附近,在施用单剂量的加氏乳杆菌OLL2959菌株的大鼠中IMP吸收量显著降低(*p<0.1,次黄嘌呤处理组相对于次黄嘌呤+OLL2959菌株处理组;Student's t检验)。类似地,如图13和14所示,在施用单剂量的加氏乳杆菌OLL2959菌株的大鼠中次黄嘌呤吸收量显著降低(##p<0.01,#p<0.05,次黄嘌呤处理组相对于次黄嘌呤+OLL2959菌株处理组;Student's t检验)。这些结果进一步揭示了通过施用单剂量的加氏乳杆菌OLL2959菌株减少嘌呤吸收的作用。由于IMP也是鱼或肉中的可口成分,因此证实减少IMP或其碱即次黄嘌呤的吸收的作用具有重要意义。
[实施例11]体外嘌呤摄取能力的评价
将14C-次黄嘌呤或14C-肌苷以1μCi/ml加入用PBS调整至大约1.0x108cfu/ml的加氏乳杆菌OLL2959菌株,并将所得混合物在37℃孵育15分钟或30分钟。收集孵育后的细胞,并使用液体闪烁计数器测量放射性。
结果示于图15中。显示,加氏乳杆菌OLL2959菌株在体外将肌苷和次黄嘌呤二者获取(捕获)到细胞中(图15)。作为嘌呤碱的次黄嘌呤的摄取量比作为核苷的肌苷摄取量更大。该结果与对腺苷和腺嘌呤之间的关系获得的结果相同。
[实施例12]OLL2959菌株在酸奶中的存活性的评价
将加氏乳杆菌OLL2959菌株以2.5x 108±0.1x 108cfu/ml的浓度加入酸奶饮料或生理盐水(第0天),并在第7天、第21天和第28天确定活细胞计数。在每个时间点的存活率表示为活细胞计数相对于第0天的活细胞计数的比率(%)。
结果,添加到酸奶饮料中的加氏乳杆菌OLL2959菌株的存活率在第7天为72.6%,在第21天为58.5%,且在第28天为61.0%(图16)。另一方面,添加到生理盐水中的加氏乳杆菌OLL2959菌株的存活率在第7天为10.6%,且在第21天和第28天为0.0%(图16)。
这些结果表明,加氏乳杆菌OLL2959菌株在酸奶中的存活性高于在生理盐水中的存活性。
工业实用性
根据本发明,可以有效地获得具有嘌呤捕获作用的乳酸菌,其具有高嘌呤摄取能力和在嘌呤的存在下的高增殖能力。这样的乳酸菌可通过减少施用乳酸菌的受试者的肠道中的嘌呤量,减少嘌呤在肠道中的吸收量,导致血清尿酸水平降低。因此,本发明还可用于开发用于减少肠道中的嘌呤并降低血清尿酸水平的口服制剂。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请将通过引用以其整体并入本文。
PCT/RO/134表
Claims (13)
1.一种筛选乳酸菌的方法,包括测量乳酸菌在含有嘌呤的培养基中的嘌呤摄取量,和利用所述嘌呤摄取量作为指标选择具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述培养基中的嘌呤是嘌呤碱。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述培养基中的嘌呤用放射性同位素标记。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,包括在所述包含嘌呤的培养基中测量所述乳酸菌的增殖的量,和使用所述增殖量与所述嘌呤摄取量一起作为指标选择具有嘌呤捕获作用的乳酸菌。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述乳酸菌是加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)细菌。
6.一种具有嘌呤捕获作用的乳酸菌,其是通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法可获得的。
7.一种用于捕获嘌呤的剂,所述剂包含通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法可获得的具有嘌呤捕获作用的乳酸菌作为活性组分。
8.根据权利要求7所述的用于捕获嘌呤的剂,所述剂用于在降低血清尿酸水平中使用。
9.根据权利要求7或8所述的用于捕获嘌呤的剂,其中所述乳酸菌是加氏乳杆菌OLL2959菌株(登录号:NITE BP-224)。
10.一种食品或饮料产品或药物制剂,所述食品或饮料产品或药物制剂包含根据权利要求7至9中任一项所述的用于捕获嘌呤的剂。
11.根据权利要求9所述的食品或饮料产品或药物制剂,所述食品或饮料产品或药物制剂用于在减少肠道中的嘌呤中使用。
12.根据权利要求10或11所述的食品或饮料产品或药物制剂,所述食品或饮料产品或药物制剂用于在向具有6至8mg/dL血清尿酸水平的人类受试者施用中使用。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的食品或饮料产品或药物制剂,所述食品或饮料产品或药物制剂包含每剂量1x108至1x1010cfu的所述乳酸菌。
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