CN104232622A - 一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法，是用一对寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互为反向的核苷酸片段，在恒温条件下使得目的基因在引物及DNA聚合酶的作用下进行聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。本发明为核酸检测提供了新的技术平台，扩增产物比较简单，不仅可以应用在检测领域，还可以再稍加处理后对扩增产物进行克隆回收和测序，该方法可以应用在所有需要核酸扩增的领域，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Description

一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域中的恒温核酸扩增方法，特别是涉及一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其在进行核酸(DNA或RNA)检测中的应用。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，即PCR技术，是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，特点是利用耐热的DNA聚合酶，将引物和目标DNA混合，经过高温变性、低温退火和适温延伸3个过程为一个周期进行循环，将目标DNA在短时间内得到大量扩增。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出的优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑，但PCR技术一直无法摆脱热循环的限制，经过几十年技术的发展，一些恒温核酸扩增技术逐渐被发明出来。
核酸恒温扩增技术是指在温度不变的情况下将目标基因大量复制的技术。目前，核酸恒温扩增方法主要包括以下几种：
TAS，即转录依赖的扩增系统(Transcript-based Amplification System)，是美国SISKA诊断研究所和Salk研究所于1989年共同研发的，主要应用于RNA的扩增，它的反应原理是在逆转录酶和T7RNA多聚酶的作用下将目标RNA通过阶梯式温度变化而大量扩增出来，在扩增过程中也主要依靠了逆转录酶的多聚酶活性和RNase H的活性，这种扩增方式摆脱了高热循环的限制，只需要将温度进行阶梯设置，具有重大的进步意义，且具有很高的特异性和敏感性，但在反应过程中需要不断添加逆转录酶和T7RNA多聚酶，给使用带来很多不方便，而且目前只能扩增RNA。
NASBA，即依赖于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence-BasedAmplification)，在1991年，由加拿大Can-gene公司最先发表论文介绍，NASBA是一种等温扩增技术，它能在体外将核酸序列进行大量复制，是由两个引物介导的、稳定持续的酶促反应。NASBA反应要依赖AMV逆转录酶、RNase H、T7RNA聚合酶，整个反应在恒温(41℃)条件下进行的，1.5-2h即可得到理想的结果。NASBA的缺点为：在产物检测上仍需要复杂的后续程序；酶非耐热性，且要在RNA链溶解之后才能加入；低温容易导致引物的非特异性相互作用从而造成非特异性扩增；反应需要加入三种酶，且需要三种酶在同一温度、同一反应体系下被激活。
3SR，即自主序列复制(Self-Sustained Sequence Replication)，也是由美国SISKA诊断研究所和Salk研究所在TAS基础上研发而来，原理同TAS基本相似，只不过多了RNase H酶，同时其反应也必需AMV逆转录酶和T7RNA多聚酶。相比NASBA，3SR比较复杂，敏感性不强。NASBA正逐渐取代3SR。
SDA，即链替代扩增(Strand Displacement Amplification)，是1992年由美国学者Wallker等人建立，它利用限制性内切核酸酶剪切DNA识别位点的能力和DNA聚合酶在缺口处向3’延伸并置换下游序列的能力，在等温条件下将目标序列大量扩增出来。SDA的缺点是仍需要变性的过程，扩增的靶序列不能超过200bp，后续检测复杂。
RCA，即滚环扩增(Rolling Circle Amplification)，于1998年被发明出来。该方法的灵感主要来自自然界微生物环状DNA的复制过程，通过体外模拟这种环状DNA的扩增而发明的，主要通过巧妙的引物设计和在DNA聚合酶的作用下将靶序列大量扩增出来，但其扩增产物非常复杂，且片段大小不一。由于RCA只能扩增环状的DNA模板，所以大大限制了其的应用范围。
HDA，即依赖解旋酶基因扩增(Helicase-Dependent Amplification)，是由美国New England Biolabs公司的科研人员Vincent等在2004年首次介绍的一种恒温体外核酸扩增技术，它的反应原理是在解旋酶的作用下将双链DNA打开，再依靠单链DNA结合蛋白与模板单链结合，这样就可以使DNA保持单链的状态，然后引物与单链结合，在DNA聚合酶的作用下向前延伸。但是，HDA扩增也需要三种酶，因而大大限制了其的应用范围。
SPIA，即单引物等温扩增技术(Single Primer Isothermal Amplification)，2005年被发明出来。该技术主要通过一条3’端是DNA片段、5’端是RNA片段的混合物，在RNase H及具有强链置换活性的DNA聚合酶作用下，单链的cDNA便被大量的扩增出来。SPIA扩增的温度为60℃左右，在半个小时内完成。SPIA扩增技术具有扩增效率高、保守性强、原理简单等优点，适用于核酸检测、核酸测序、SNP检测、单链模板制备以及基因芯片探针制备等方面。
2000年，Notomi等人建立的一种新的体外核酸扩增技术，即环介导恒温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)，这种新颖的扩增方法需要至少4条引物，最多6条引物来特异性识别目标片段的6个、7个或者8个区域，在DNA聚合酶的链置换作用下可以在很短的时间内将靶序列扩增出来，具有简单、特异、高效、迅速的特点，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物的产生，即白色的焦磷酸镁沉淀，这一特性可以使LAMP反应通过浊度变化来直接判断阴、阳性结果。PCR需要两条引物来特异性结合靶序列的两个区间，而LAMP则是特异性的结合6至8个区间，所以相较于PCR，具有很强的特异性；敏感性比普通PCR可以提高10-100倍，与荧光定量PCR的敏感性相当，而且LAMP扩增的过程是在恒温条件下进行的，有热稳定的设备(比如恒温水浴锅、恒温金属浴等)就能满足反应要求，因次大大降低了检测成本。自从LAMP技术被报道后，在短短的十几年的时间里，已经被广泛应用于细菌、真菌、病毒等微生物的检测，遗传病的诊断，以及性别的早期判定等领域。
各种恒温扩增技术的比较结果详见表1。
表1恒温扩增技术的比较结果
※注：PubMed表示以各种恒温扩增技术的英文全称在PubMed所能检索到的文章数，截止到2014年3月25日。
这些恒温核酸扩增方法中最有优势的是LAMP法，但LAMP产物过于复杂，且LAMP产物的回收测序很困难，不能像普通PCR产物一样直接测序；由于LAMP产物是极其复杂的不规则的扩增混合物，因此LAMP产物不可以用来克隆。这些缺点使LAMP的应用只局限在基因的快速检测方面。
发明内容
通过对以上核酸扩增方法进行深入研究，以及针对现有技术中存在的技术缺陷，本发明提供了一种新的用聚合酶螺旋反应(Polymerase Spiral Reaction，PSR)恒温扩增核酸的方法。
本发明所提供的用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法，是用一对寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互为反向的核苷酸片段，在恒温条件下使得目的基因在引物及DNA聚合酶的作用下进行聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。
所述聚合酶螺旋反应的最基本引物只包括一对引物，一条正向引物FP和一条反向引物BP，引物设计与普通PCR非常相似，F和B为引物设计区，它们之间为延伸区，只需要在这两条引物的引导下，聚合酶螺旋反应(自螺旋链式反应)就可以开始：
FP(Forward Primer)：该引物由F区域和N区域两部分组成，F区域与靶序列的Fc区域互补，N区域是一段特别的序列，可以来自靶序列本身，也可以来自外源序列，但必须和BP引物5’端N区域序列一样，这一点是聚合酶螺旋反应的关键之处；
BP(Backward Primer)：该引物由B区域和N区域两部分组成，B区域与靶序列的Bc区域互补，N区域是一段特别的序列，可以来自靶序列本身，也可以来自外源序列，但必须和FP引物5’端N区域序列一样。
所述用聚合酶螺旋反应(PSR)及其专用引物恒温扩增核酸的方法的反应过程如下：
1)依次用引物FP和BP形成自螺旋环结构：
1.1)反应在恒温环境(60℃-65℃)下进行，靶序列双链解开成两条单链，引物FP中的F部分与其中一条3’端至5’端的单链的Fc部分结合，并向3’端延伸至合成出与3’端至5’端单链的B区域的互补序列Bc及后续序列，即逐渐形成双链结构，然后双链结构解开，形成两条单链，即一条5’端至3’端的包括N区域、F区域及Bc区域的中间单链和一条靶序列的3’端至5’端的单链；
1.2)引物BP与5’端至3’端的包括N区域、F区域及Bc区域的中间单链结合，BP中的B部分与中间单链的Bc区域互补结合，并向3’端延伸至合成出与F区域互补的Fc区域及与N区域互补的Nc区域，形成双链结构，当双链结构解开形成单链时，便形成了两条单链，至此形成了聚合酶螺旋反应中最为关键的一条目的单链，即3’端至5’端的包括Nc区域、Fc区域、B区域和N区域的单链；
1.3)目的单链两端的Nc区域和N区域互补，这样它们(Nc区域和N区域)就可以相结合形成自螺旋环结构，由于Nc末端为3’端，可以以自身为模板进行自螺旋延伸，一旦形成自螺旋环结构，就会开始剧烈的聚合酶螺旋反应，5分钟左右便会完成扩增，形成大小不等的螺旋形扩增产物，从而最终完成核酸的扩增；
2)同时，还可依次用引物BP和FP形成自螺旋环结构：
2.1)反应在恒温环境(60℃-65℃)下进行，靶序列双链解开成两条单链，引物BP中的B部分与其中一条3’端至5’端的单链的Bc部分结合，并向3’端延伸至合成出与3’端至5’端单链的F区域的互补序列Fc及后续序列，即逐渐形成双链结构，然后双链结构解开，形成两条单链，即一条5’端至3’端的包括N区域、B区域及Fc区域的中间单链和一条靶序列的3’端至5’端的单链；
2.2)引物FP与5’端至3’端的包括N区域、B区域及Fc区域的中间单链结合，FP中的F部分与中间单链的Fc区域互补结合，并向3’端延伸至合成出与B区域互补的Bc区域及与N区域互补的Nc区域，形成双链结构，当双链结构解开形成单链时，便形成了两条单链，至此形成了聚合酶螺旋反应中最为关键的一条目的单链，即5’端至3’端的包括N区域、F区域、Bc区域和Nc区域的单链；
2.3)目的单链两端的Nc区域和N区域互补，这样它们(Nc区域和N区域)就可以相结合形成自螺旋环结构，由于Nc末端为3’端，可以以自身为模板进行自螺旋延伸，一旦形成自螺旋环结构，就会开始剧烈的聚合酶螺旋反应，5分钟左右便会完成扩增，形成大小不等的螺旋形扩增产物，从而最终完成核酸的扩增。
所述用于检测NDM-1基因的FP引物如序列表中序列2所示，BP引物如序列表中序列3所示；所述用于检测H1N1基因的FP引物如序列表中序列5所示，BP引物如序列表中序列6所示。
本发明还提供了一种用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法及浊度法检测待测样品中是否含有目的基因(DNA)的方法，可包括以下步骤：
1)配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2)按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3)取2μL核酸提取液加入步骤1)配制的PSR反应液中，使最终反应体积为25μL，混匀反应液，加入封闭剂以防止污染；
4)置60-65℃环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应，反应时间120-150min；
5)用实时浊度仪记录反应管中浊度的变化，曲线上升的样品判定为阳性结果，曲线没有上升的样品判定为阴性结果。
本发明还提供了一种用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法及显色法判定检测待测样品中是否含有目的基因(DNA)的方法，肉眼观察即可得出实验结果，可包括以下步骤：
1)配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2)按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3)取2μL核酸提取液和1μL显色液(主要是一些可以根据反应液中Mg2+浓度变化而产生颜色变化的金属离子指示剂，如钙黄绿素/Mn2+混合液、羟基萘酚蓝等；还包括一些可以核酸染料，如SYBR Green I等)，加入到步骤1)配制的PSR反应液中，使最终反应体积为26μL，混匀反应液，加入封闭剂以防止污染；
4)置60-65℃环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应，反应时间120-150min；
5)取出反应管，肉眼或紫外光辅助下观察，反应液颜色改变的样品为阳性结果，保持颜色不变的样品为阴性结果。
本发明还提供了一种用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法及浊度法或显示法检测待测样品中是否含有RNA的方法，包括以下步骤：
1)配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶和逆转录酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2)按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3)取2μL核酸提取液加入到步骤1)配制的PSR反应液中，混匀反应液，加入封闭剂以防止污染；
4)置60-65℃环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应，反应时间120-150min；
5)用浊度法或者显色法判定反应结果。
上述封闭剂(专利申请号：201210371448.5)为熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25℃、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块，封闭剂的使用方法为：将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，进行反应。
本发明提供了一种恒温扩增核酸的新方法，将其命名为聚合酶螺旋反应(Polymerase Spiral Reaction，PSR)，本发明具有以下优点：
1、扩增反应可在恒温环境下进行，这使得用一个水浴锅或者恒温金属浴就可以满足实验要求；
2、引物设计简单，只需要一对引物即可完成核酸的扩增，若添加一对加速引物，反应时间则大大缩短；PSR用户使用普通的PCR引物设计软件(如Primer5、DNAMAN等)即可完成引物的设计，只需在PCR引物5’端添加一对通用的外源基因(N)即可完成恒温扩增反应；
3、敏感性高，适用于病毒等核酸含量低的样品的检测；
4、高效扩增，扩增DNA量能达到0.6μg/μL；
5、操作简单，通过实时浊度仪或者钙黄绿素/Mn2+显色液即可肉眼观察实验结果；
6、待扩增的目的片段大小可变性广，从100bp至200bp均能完成扩增。
综上所述，本发明为核酸检测提供了新的技术平台，扩增产物比较简单，不仅可以应用在检测领域，还可以再稍加处理后对扩增产物进行克隆回收和测序，该方法可以应用在所有需要核酸扩增的领域，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为聚合酶螺旋反应最基本引物示意图
图2为PSR引物设计的区域划分
图3为用FP引物进行PSR扩增的原理示意图(1)
图4为用FP引物进行PSR扩增的原理示意图(2)
图5为用BP引物进行PSR扩增的原理示意图(1)
图6为用BP引物进行PSR扩增的原理示意图(2)
图7为PSR自螺旋环的结构示意图
图8为PSR反应产物的示意图
图9为含有两条引物扩增DNA的PSR反应结果
图10为PSR扩增产物的酶切验证结果
图11为含有两条引物扩增RNA的PSR反应结果
具体实施方式
本发明提供了一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法，是用一对寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互为反向的核苷酸片段，在恒温条件下使得目的基因在引物及DNA聚合酶的作用下进行聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。
如图1所示，所述聚合酶螺旋反应的最基本引物只包括一对引物，一条正向引物FP和一条反向引物BP，引物设计与普通PCR非常相似，如图2所示，F和B为引物设计区，它们之间为延伸区，只需要在这两条引物的引导下，聚合酶螺旋反应(自螺旋链式反应)就可以开始：
FP(Forward Primer)：该引物由F区域和N区域两部分组成，F区域与靶序列的Fc区域互补，N区域是一段特别的序列，可以来自靶序列本身，也可以来自外源序列，但必须和BP引物5’端N区域序列一样，这一点是聚合酶螺旋反应的关键之处；
BP(Backward Primer)：该引物由B区域和N区域两部分组成，B区域与靶序列的Bc区域互补，N区域是一段特别的序列，可以来自靶序列本身，也可以来自外源序列，但必须和FP引物5’端N区域序列一样。
所述用聚合酶螺旋反应(PSR)及其专用引物恒温扩增核酸的方法的反应过程及原理如下：
1)依次用引物FP和BP形成图7A中的自螺旋环结构：
1.1)如图3A所示，反应在恒温环境(60℃-65℃)下进行，靶序列双链解开成两条单链，引物FP中的F部分与其中一条3’端至5’端的单链的Fc部分结合，并向3’端延伸至合成出与3’端至5’端单链的B区域的互补序列Bc及后续序列，即逐渐形成图3B中的双链结构，然后图3B中的双链结构解开，便形成了图3C中的两条单链，即一条5’端至3’端的包括N区域、F区域及Bc区域的中间单链和一条靶序列的3’端至5’端的单链；
1.2)如图4A所示，引物BP与图3C中的一条5’端至3’端的包括N区域、F区域及Bc区域的中间单链结合，BP中的B部分与中间单链的Bc区域互补结合，并向3’端延伸至合成出与F区域互补的Fc区域及与N区域互补的Nc区域，形成图4B中的双链结构，当图4B的双链结构解开形成单链时，便形成了图4C中的两条单链，至此形成了聚合酶螺旋反应中最为关键的一条目的单链，即图4C中的下面那条3’端至5’端的包括Nc区域、Fc区域、B区域和N区域的单链；
1.3)从图4C中可以看出，目的单链两端的Nc区域和N区域互补，这样它们(Nc区域和N区域)就可以相结合形成图7A中的自螺旋环结构，由于Nc末端为3’端，可以以自身为模板进行自螺旋延伸，一旦形成自螺旋环结构，就会开始剧烈的聚合酶螺旋反应，5分钟左右便会完成扩增，形成如图8所示的大小不等的螺旋形扩增产物，从而最终完成核酸的扩增；
2)同时，还可依次用引物BP和FP形成图7B中的自螺旋环结构：
2.1)如图5A所示，反应在恒温环境(60℃-65℃)下进行，靶序列双链解开成两条单链，引物BP中的B部分与其中一条3’端至5’端的单链的Bc部分结合，并向3’端延伸至合成出与3’端至5’端单链的F区域的互补序列Fc及后续序列，即逐渐形成图5B中的双链结构，然后图5B的双链结构解开，便形成了图5C中的两条单链，即一条5’端至3’端的包括N区域、B区域及Fc区域的中间单链和一条靶序列的3’端至5’端的单链；
2.2)如图6A所示，引物FP与图3C中的一条5’端至3’端的包括N区域、B区域及Fc区域的中间单链结合，FP中的F部分与中间单链的Fc区域互补结合，并向3’端延伸至合成出与B区域互补的Bc区域及与N区域互补的Nc区域，形成图6B中的双链结构，当图6B的双链结构解开形成单链时，便形成了图6C中的两条单链，至此形成了聚合酶螺旋反应中最为关键的一条目的单链，即图6C中的上面那条5’端至3’端的包括N区域、F区域、Bc区域和Nc区域的单链；
2.3)从图6C中可以看出，目的单链两端的Nc区域和N区域互补，这样它们(Nc区域和N区域)就可以相结合形成图7B中的自螺旋环结构，由于Nc末端为3’端，可以以自身为模板进行自螺旋延伸，一旦形成自螺旋环结构，就会开始剧烈的聚合酶螺旋反应，5分钟左右便会完成扩增，形成如图8所示的大小不等的螺旋形扩增产物，从而最终完成核酸的扩增。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所用引物由大连宝生物公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、用聚合酶螺旋反应(PSR)检测待测样品中是否含有NDM-1基因
以NDM-1基因为例，用聚合酶螺旋反应(PSR)检测待测样品中是否含有目的基因(DNA)，具体方法包括以下步骤：
一、设计PSR引物
从美国基因数据库GenBank检索获得NDM-1基因的核苷酸序列(GenBank号：FN396876)，通过BLAST软件进行同源性分析，找到保守靶序列(序列表中序列1)，再根据其保守靶序列设计PSR引物。
与普通PCR相同，先设计一对引物F与B，F引物：5’-GGTCGATACCGCCTGGAC-3’，B引物：5’-GCATGCAGCGCGTCCA-3’，然后在两者的5’端添加一段通用外源序列N，F引物添加序列N(5’-3’：ACGATTCGTACATAGAAGTATAG)形成引物FP，B引物添加序列N(5’-3’：GATATGAAGATACATGCTTAGCA)形成引物BP，引物序列见表2。
表2扩增NDM-1基因的PSR引物序列
引物名称 序列(5’-3’)
FP ACGATTCGTACATAGAAGTATAG-GGTCGATACCGCCTGGAC(序列表中序列2)
BP GATATGAAGATACATGCTTAGCA-GCATGCAGCGCGTCCA(序列表中序列3)
二、用聚合酶螺旋反应(PSR)及浊度法检测待测样品中是否含有NDM-1基因
1、配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2、按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3、取2μL核酸提取液加入步骤1配制的PSR反应液中，使最终反应体积为25μL，混匀反应液，加入封闭剂(封闭剂为熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25℃、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块，封闭剂的使用方法为：将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，进行反应。)以防止气溶胶污染；
4、置63℃(60-65℃均可)环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应，反应时间120min(120-150min均可)；
5、用实时浊度仪记录反应管中浊度的变化，曲线上升的样品判定为阳性结果，曲线没有上升的样品判定为阴性结果。
结果如图9所示，四个阳性样品均显示出上升的浊度曲线，而四个阴性样品保持零浊度不变，与预期结果相符。
三、用聚合酶螺旋反应(PSR)及显色法检测待测样品中是否含有NDM-1基因
1、配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2、按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3、取2μL(浓度20ng/μL以上)核酸提取液和1μL显色液(主要是一些可以根据反应液中Mg2+浓度变化而产生颜色变化的金属离子指示剂，如钙黄绿素/Mn2+混合液、羟基萘酚蓝等；还包括一些可以核酸染料，如SYBR Green I等)，加入到步骤1配制的PSR反应液中，使最终反应体积为26μL，混匀反应液，加入封闭剂(封闭剂为熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25℃、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块，封闭剂的使用方法为：将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，进行反应。)以防止气溶胶污染；
4、置63℃(60-65℃均可)环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应，反应时间120min(120-150min均可)；
5、取出反应管，肉眼或紫外光辅助下观察，反应液颜色改变的样品为阳性结果，保持颜色不变的样品为阴性结果。
结果四个阳性样品的反应液颜色改变，而四个阴性样品的反应液颜色未变，与预期结果相符。
四、聚合酶螺旋反应(PSR)扩增产物的酶切验证
在NDM-1靶序列中找到两个酶切位点，Taq Ⅰ与Hinf Ⅰ酶切位点，将步骤二或步骤三获得的PSR扩增产物用这两种酶分别酶切后，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图10(1号泳道为Taq Ⅰ酶切产物，3号泳道为Hinf Ⅰ酶切产物，2号、4号泳道为PSR扩增产物)所示，可以看出，未经酶切的PSR扩增产物在泳道中呈弥漫排布(自螺旋反应会产生无数个长短不同的环状扩增产物，片段大小在150bp到几万bp不等，因此在泳道中呈现弥漫状排布)，而经酶切后得到单一条带(长短大小不等的环状扩增产物是同一靶序列的不停重复，而靶序列上又含有酶切位点，所以经过酶切后就只剩下一个片段大小的产物，在电泳中呈现单一条带)，表明前述PSR扩增原理正确，PSR切实可行。
实施例2、用聚合酶螺旋反应(PSR)检测待测样品中是否含有RNA
以检测H1N1病毒为例，用聚合酶螺旋反应(PSR)检测待测样品中是否含有RNA，具体方法包括以下步骤：
一、设计PSR引物
从美国基因数据库GenBank检索获得H1N1基因的核苷酸序列(GenBank号：KM361419.1)，通过BLAST软件进行同源性分析，找到保守靶序列(序列表中序列4)，再根据其保守靶序列设计PSR引物。
与普通PCR相同，先设计一对引物F与B，F引物：5’-GCAATGAGAACTATTGGGACTC-3’，B引物：5’-ATTTGCTGCAATGACGAGAG-3’，然后在两者的5’端添加一段通用外源序列N，F引物添加序列N(5’-3’：ACGATTCGTACATAGAAGTATAG)形成引物FP，B引物添加序列N(5’-3’：GATATGAAGATACATGCTTAGCA)形成引物BP，引物序列见表3。
表3扩增H1N1基因的PSR引物序列
引物名称 序列(5’-3’)
FP ACGATTCGTACATAGAAGTATAG-GCAATGAGAACTATTGGGACTC(序列表中序列5)
BP GATATGAAGATACATGCTTAGCA-ATTTGCTGCAATGACGAGAG(序列表中序列6)
二、用聚合酶螺旋反应(PSR)及浊度法检测待测样品中是否含有H1N1靶基因
1、配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶和逆转录酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2、按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3、取2μL核酸提取液加入步骤1配制的PSR反应液中，使最终反应体积为25μL，混匀反应液，加入封闭剂(封闭剂为熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25℃、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块，封闭剂的使用方法为：将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，进行反应。)以防止气溶胶污染；
4、置63℃(60-65℃均可)环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应，反应时间120min(120-150min均可)；
5、用实时浊度仪记录反应管中浊度的变化，曲线上升的样品判定为阳性结果，曲线没有上升的样品判定为阴性结果。
结果如图11所示，两个阳性样品均显示出上升的浊度曲线，而两个阴性样品保持零浊度不变，与预期结果相符。
三、用聚合酶螺旋反应(PSR)及显色法检测待测样品中是否含有H1N1靶基因
1、配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶和逆转录酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2、按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3、取2μL(浓度20ng/μL以上)核酸提取液和1μL显色液(主要是一些可以根据反应液中Mg2+浓度变化而产生颜色变化的金属离子指示剂，如钙黄绿素/Mn2+混合液、羟基萘酚蓝等；还包括一些可以核酸染料，如SYBR Green I等)，加入到步骤1配制的PSR反应液中，使最终反应体积为26μL，混匀反应液，加入封闭剂(封闭剂为熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25℃、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块，封闭剂的使用方法为：将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，进行反应。)以防止气溶胶污染；
4、置63℃(60-65℃均可)环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应，反应时间120min(120-150min均可)；
5、取出反应管，肉眼或紫外光辅助下观察，反应液颜色改变的样品为阳性结果，保持颜色不变的样品为阴性结果。
结果两个阳性样品的反应液颜色改变，而两个阴性样品的反应液颜色未变，与预期结果相符。

Claims (8)

1.一种用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法，是用一对寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互为反向的核苷酸片段，在恒温条件下使得目的基因在引物及DNA聚合酶的作用下进行聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。
2.根据权利要求1所述的恒温扩增核酸的方法，其特征在于：所述聚合酶螺旋反应(PSR)的最基本引物只包括一对引物，一条正向引物FP和一条反向引物BP，，F和B为引物设计区，它们之间为延伸区，在这两条引物的引导下，聚合酶螺旋反应(自螺旋链式反应)就可以开始：
FP(Forward Primer)：该引物由F区域和N区域两部分组成，F区域与靶序列的Fc区域互补，N区域是一段特别的序列，可以来自靶序列本身，也可以来自外源序列，但必须和BP引物5′端N区域序列一样；
BP(Backward Primer)：该引物由B区域和N区域两部分组成，B区域与靶序列的Bc区域互补，N区域是一段特别的序列，可以来自靶序列本身，也可以来自外源序列，但必须和FP引物5′端N区域序列一样。
3.根据权利要求2所述的恒温扩增核酸的方法，其特征在于：所述用聚合酶螺旋反应(PSR)及其专用引物恒温扩增核酸的方法的反应过程如下：
1)依次用引物FP和BP形成自螺旋环结构：
1.1)反应在恒温环境(60℃-65℃)下进行，靶序列双链解开成两条单链，引物FP中的F部分与其中一条3’端至5’端的单链的Fc部分结合，并向3’端延伸至合成出与3’端至5’端单链的B区域的互补序列Bc及后续序列，即逐渐形成双链结构，然后双链结构解开，形成两条单链，即一条5’端至3’端的包括N区域、F区域及Bc区域的中间单链和一条靶序列的3’端至5’端的单链；
1.2)引物BP与5’端至3’端的包括N区域、F区域及Bc区域的中间单链结合，BP中的B部分与中间单链的Bc区域互补结合，并向3’端延伸至合成出与F区域互补的Fc区域及与N区域互补的Nc区域，形成双链结构，当双链结构解开形成单链时，便形成了两条单链，至此形成了聚合酶螺旋反应中最为关键的一条目的单链，即3’端至5’端的包括Nc区域、Fc区域、B区域和N区域的单链；
1.3)目的单链两端的Nc区域和N区域互补，Nc区域和N区域相结合后形成自螺旋环结构，由于Nc末端为3’端，可以以自身为模板进行自螺旋延伸，一旦形成自螺旋环结构，就会开始剧烈的聚合酶螺旋反应，5分钟左右便会完成扩增，形成大小不等的螺旋形扩增产物，从而最终完成核酸的扩增；
2)同时，还可依次用引物BP和FP形成自螺旋环结构：
2.1)反应在恒温环境(60℃-65℃)下进行，靶序列双链解开成两条单链，引物BP中的B部分与其中一条3’端至5’端的单链的Bc部分结合，并向3’端延伸至合成出与3’端至5’端单链的F区域的互补序列Fc及后续序列，即逐渐形成双链结构，然后双链结构解开，形成两条单链，即一条5’端至3’端的包括N区域、B区域及Fc区域的中间单链和一条靶序列的3’端至5’端的单链；
2.2)引物FP与5’端至3’端的包括N区域、B区域及Fc区域的中间单链结合，FP中的F部分与中间单链的Fc区域互补结合，并向3’端延伸至合成出与B区域互补的Bc区域及与N区域互补的Nc区域，形成双链结构，当双链结构解开形成单链时，便形成了两条单链，至此形成了聚合酶螺旋反应中最为关键的一条目的单链，即5’端至3’端的包括N区域、F区域、Bc区域和Nc区域的单链；
2.3)目的单链两端的Nc区域和N区域互补，Nc区域和N区域相结合后形成自螺旋环结构，由于Nc末端为3’端，可以以自身为模板进行自螺旋延伸，一旦形成自螺旋环结构，就会开始剧烈的聚合酶螺旋反应，5分钟左右便会完成扩增，形成大小不等的螺旋形扩增产物，从而最终完成核酸的扩增。
4.根据权利要求2所述的恒温扩增核酸的方法，其特征在于：所述用于检测NDM-1基因的FP引物如序列表中序列2所示，BP引物如序列表中序列3所示；所述用于检测H1N1基因的FP引物如序列表中序列5所示，BP引物如序列表中序列6所示。
5.一种用权利要求1或2或3所述用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法及浊度法检测待测样品中是否含有目的基因(DNA)的方法，包括以下步骤：
1)配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2)按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3)取2μL核酸提取液加入步骤1)配制的PSR反应液中，使最终反应体积为25μL，混匀反应液，加入封闭剂以防止污染；
4)置60-65℃环境中进行恒温扩增反应，反应时间120-150min；
5)用实时浊度仪记录反应管中浊度的变化，曲线上升的样品判定为阳性结果，曲线没有上升的样品判定为阴性结果。
6.一种用权利要求1或2或3所述用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法及显色法判定检测待测样品中是否含有目的基因(DNA)的方法，包括以下步骤：
1)配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2)按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3)取2μL核酸提取液和1μL显色液(主要是一些可以根据反应液中Mg2+浓度变化而产生颜色变化的金属离子指示剂，如钙黄绿素/Mn2+混合液、羟基萘酚蓝等；还包括一些可以核酸染料，如SYBR Green I等)，加入到步骤1)配制的PSR反应液中，使最终反应体积为26μL，混匀反应液，加入封闭剂以防止污染；
4)置60-65℃环境中进行恒温扩增反应，反应时间120-150min；
5)取出反应管，肉眼或紫外光辅助下观察，反应液颜色改变的样品为阳性结果，保持颜色不变的样品为阴性结果。
7.一种用权利要求1或2或3所述用聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增核酸的方法及浊度法或显示法检测待测样品中是否含有RNA的方法，包括以下步骤：
1)配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶和逆转录酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2)按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3)取2μL核酸提取液加入到步骤1)配制的PSR反应液中，混匀反应液，加入封闭剂以防止污染；
4)置60-65℃环境中进行恒温扩增反应，反应时间120-150min；
5)用浊度法或者显色法判定反应结果。
8.根据权利要求4或5或6所述的方法，所述封闭剂为熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25℃、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块，封闭剂的使用方法为：将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，进行反应。
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Denomination of invention: Nucleic acid isothermal amplification method and application thereof by polymerase spiral reaction

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