CN112980927A - 一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，用一对引物(F和B)，在引物(F和B)的5’端添加一段靶序列中的片段，构成一对复合引物Ft和Bt，在恒温条件下使得目的基因在复合引物与DNA聚合酶的作用下发生聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。本发明扩增反应可在恒温环境下进行，这使得用一个水浴锅或者恒温金属浴就可以满足实验要求；引物设计简单；敏感性高；高效扩增；操作简单，通过实时浊度仪即可观察实验结果。
Description
技术领域
本发明涉及扩增核酸领域。更具体地说，本发明涉及一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，即PCR技术，是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，特点是利用耐热的DNA聚合酶，将引物和目标DNA混合，经过高温变性、低温退火和适温延伸3个过程为一个周期进行循环，将目标DNA在短时间内得到大量扩增。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出的优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑，但PCR技术一直无法摆脱热循环的限制，经过几十年技术的发展，一些恒温核酸扩增技术逐渐被发明出来。
这些恒温核酸扩增方法中最有优势的是LAMP法，但LAMP产物过于复杂，且LAMP产物的回收测序很困难，不能像普通PCR产物一样直接测序；由于LAMP产物是极其复杂的不规则的扩增混合物，因此LAMP产物不可以用来克隆。这些缺点使LAMP的应用只局限在基因的快速检测方面。
发明内容
针对现有技术中存在的技术缺陷，本发明提供了一种新的用聚合酶螺旋反应(Polymerase Spiral Reaction，PSR)恒温扩增核酸的方法。
为达到上述目的，本发明采取的技术手段为：
一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，用一对引物(F和B)，在引物(F和B)的5’端添加一段靶序列中的片段，构成一对复合引物Ft和Bt，在恒温条件下使得目的基因在复合引物与DNA聚合酶的作用下发生聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。
优选的是，其中，所述F和B为引物设计区域，它们之间为延伸区，在这两条引物的引导下，聚合酶螺旋反应就可以开始：
Ft：该引物包括F区域和N区域，F区域与靶序列的Fc区域互补，N区域来自靶序列本身序列，且和Bt引物5’端N区域序列一样；
Bt：该引物包括B区域和N区域，B区域与靶序列的Bc区域互补，N区域来自靶序列本身，且和Ft引物5’端N区域序列一样。
优选的是，其中，所述聚合酶螺旋反应过程如下：
1)反应在60℃-67℃环境下进行，靶序列双链解开成两条单链，引物Ft中的F段与靶序列上的Fc段结合，并在DNA聚合酶作用下，向3’端延伸，合成出双链结构，然后在甜菜碱作用下将双链结构解开，形成两条单链；
2)引物Bt中的B段与单链的Bc段结合，并向3’端延伸，形成双链结构，生成的单链会再次断开成单链；
3)由步骤2)形成的单链上的Nc段和N段互补，Nc段根据碱基互补配对，旋转与N段形成自螺旋环结构，由于Nc末端为3’端，可以被DNA聚合酶用碱基填补，继续向3’端延伸，展开后生成DNA双链；
4)由3)得到的该DNA双链在甜菜碱存在的情况下解链成单链，单链的Nc段旋转与N段互补结合，再次形成一个自螺旋环结构，并继续向3’端延伸，之后会反复重复引物结合、延伸、解链、单链旋转、延伸的循环，最终会形成一系列大小不一的分子，实现等温条件下核酸扩增。
优选的是，其中，所述反应在65℃环境下进行。
优选的是，其中，所述甜菜碱的浓度为0.8mol/L。
优选的是，其中，所述DNA聚合酶为Bca(exo-)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或TagDNA聚合酶中的一种。
优选的是，其中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
本发明至少包括以下有益效果：扩增反应可在恒温环境下进行，这使得用一个水浴锅或者恒温金属浴就可以满足实验要求；引物设计简单；敏感性高；高效扩增；操作简单，通过实时浊度仪即可观察实验结果，而且处理后能够对扩增产物进行克隆回收和测序，任何需要核酸扩增的领域都能够应用此方法，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1是本发明聚合酶螺旋反应的引物组成及结合位置示意图；
图2是本发明聚合酶螺旋反应起始过程示意图；
图3是本发明聚合酶螺旋反应循环过程示意图。
具体实施方式
使用聚合酶螺旋反应法对H1N1病毒进行聚合酶螺旋反应扩增。请参阅图1-3，其中，图1是聚合酶螺旋反应的引物组成及结合位置示意图，图2是反应起始过程示意图，图3是反应循环过程示意图，所用引物名称序列(5’-3’)：
Ft：GTATGTGTCTTCAACGGATGGTATATACCAATGTTGTGGTTGCT
Bt：GTATGTGTCTTCAACGGATGGTTCCCAAATCATAACGGTCC
实施例1：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.2mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例2：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.4mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例3：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.6mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例4：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例5：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、1.0mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例6：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、1.2mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例7：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、1.4mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例8：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U Bca(exo-)DNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例9：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U TagDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在60℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例10：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在61℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例11：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在62℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例12：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在63℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例13：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在64℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例14：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在65℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例15：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在66℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
实施例16：
制备25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、0.8mol/L甜菜碱、8mmol/LMgSO4、1.4mmol/L dNTP、8U BstDNA聚合酶、40pmol Ft和Bt，在67℃恒温环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应。
对比例1：
按照CN104232622B方法对H1N1病毒进行聚合酶螺旋反应扩增。
引物名称序列(5’-3’):
FP：ACGATTCGTACATAGAAGTATAG-GCAATGAGAACTATTGGGAC
BP：GATATGAAGATACATGCTTAGCA-ATTTGCTGCAATGACGAG
1、配制23μL PSR反应液，其中各物质浓度为：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8UBst DNA聚合酶和逆转录酶，加入的PSR引物量为：FP和BP各40pM；
2、按常规方法提取待测样品中的核酸，浓度20ng/μL以上；
3、取2μL核酸提取液加入步骤1配制的PSR反应液中，使最终反应体积为25μL，混匀反应液，加入封闭剂(封闭剂为熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25℃、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块，封闭剂的使用方法为：将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，进行反应。)以防止气溶胶污染；
4、置63℃(60-65℃均可)环境中(如水浴锅、金属浴等)进行恒温扩增反应，反应时间120min(120-150min均可)。
对H1N1病毒进行聚合酶螺旋反应(PSR)扩增结果
从上表中实施例1-16及对比例1来看，实施例14所需的反应时间最少，也就是最先发生聚合酶螺旋反应扩增(PSR)，说明在实施例14中引物的扩增效率最高，敏感性高，为最佳组合。
从上述数据得出，16个实施例中反应时间在30-40之间的有3例，反应时间在40-50之间的有10例，反应时间在50-60之间的有2例，实施例1-16中最早的反应是实施例14，在25分钟的时候就能在实时浊度仪上观察出，而对比例1在反应67分钟时才能从实时浊度仪上观察出，实施例14的反应时间25分钟仅为对比例1反应时间67分钟的三分之一，所以通过实施例及对比例来看本发明的引物扩增效率高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，用一对引物(F和B)，在引物(F和B)的5’端添加一段靶序列中的片段，构成一对复合引物Ft和Bt，在恒温条件下使得目的基因在复合引物与DNA聚合酶的作用下发生聚合酶螺旋反应，使目的基因自螺旋式延伸，从而完成核酸的扩增。
2.根据权利要求1所述的一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，所述F和B为引物设计区域，它们之间为延伸区，在这两条引物的引导下，聚合酶螺旋反应就可以开始：
Ft：该引物包括F区域和N区域，F区域与靶序列的Fc区域互补，N区域来自靶序列本身序列，且和Bt引物5’端N区域序列一样；
Bt：该引物包括B区域和N区域，B区域与靶序列的Bc区域互补，N区域来自靶序列本身，且和Ft引物5’端N区域序列一样。
3.根据权利要求2所述的一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，所述聚合酶螺旋反应过程如下：
1)反应在60℃-67℃环境下进行，靶序列双链解开成两条单链，引物Ft中的F段与靶序列上的Fc段结合，并在DNA聚合酶作用下，向3’端延伸，合成出双链结构，然后在甜菜碱作用下将双链结构解开，形成两条单链；
2)引物Bt中的B段与单链的Bc段结合，并向3’端延伸，形成双链结构，生成的单链会再次断开成单链；
3)由步骤2)形成的单链上的Nc段和N段互补，Nc段根据碱基互补配对，旋转与N段形成自螺旋环结构，由于Nc末端为3’端，可以被DNA聚合酶用碱基填补，继续向3’端延伸，展开后生成DNA双链；
4)由步骤3)得到的该DNA双链在甜菜碱存在的情况下解链成单链，单链的Nc段旋转与N段互补结合，再次形成一个自螺旋环结构，并继续向3’端延伸，之后会反复重复引物结合、延伸、解链、单链旋转、延伸的循环，最终会形成一系列大小不一的分子，实现等温条件下核酸扩增。
4.根据权利要求3所述的一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，其特征在于，所述反应在65℃环境下进行。
5.根据权利要求3所述的一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，其特征在于，所述甜菜碱的浓度为0.8mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bca(exo-)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或Tag DNA聚合酶中的一种。
7.根据权利要求6所述的一种基于聚合酶螺旋反应的扩增核酸方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
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