CN104203260A - 用于治疗和预防癌症的包含蒲公英植物根部提取物的药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是有关于一种制备用于治疗或预防癌症的包括蒲公英属根部提取物的药物的改善方法。在一个方面，所述方法包括冷冻蒲公英属根部，以获得冷冻的根，所述冷冻步骤至少产生部分破坏一个或多个根部细胞的效果；干磨所述冷冻植物根，以获得磨碎的根部粉末，其中在所述干磨步骤中，冷冻的根的研磨温度维持在低于大约40℃；将该磨碎的根部粉末浸泡在溶剂中，获得含有液体溶液部分和固体部分的悬浮液；将所述液体溶液部分与所述固体部分进行分离，以提供使用在所述药剂中的分离的液体提取物。

Description

用于治疗和预防癌症的包含蒲公英植物根部提取物的药物及其制备方法

相关申请

本申请享有35 U.S.C.119(e)规定的、2012年2月10日申请的美国临时专利申请序列号61/597453的权益。

技术领域

本发明是有关于一种制备包含属于蒲公英属植物的根部提取物的药物的改进方法，该药物可以用于治疗、改善或预防癌症。本发明尤其是有关于一种包括蒲公英植物根部提取物的药物合成物的制备，用于治疗和/或预防癌症，且优选大肠癌、胰腺癌、例如黑色素瘤的皮肤癌、以及血癌，例如慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性单核细胞骨髓性白血病和霍奇金氏淋巴癌。

背景技术

蒲公英(Taraxacum)属植物，通常也熟知为蒲公英(dandelion)，是属于菊科。这些植物通常在北半球的温带被发现，并且蒲公英的种类包括西洋蒲公英(T.officinale)、红果蒲公英(T.erythrospermum)、朝鲜蒲公英(T.albidum)、日本蒲公英(T.japonicum)、平滑蒲公英(T.laevigatum)、红果蒲公英和加利福尼亚蒲公英(T.californicum)。

蒲公英是主根性二年生植物或是多年生草本植物，平均长度在15-30cm。它的叶子大，颜色为浅绿至深绿色，在其根部聚集丛生。它的花柄是直立的，并且具有单生、顶生花序。开花的直径范围在7-15mm，由140-400个黄色舌形小花组成。它的果实是圆锥形瘦果，棕褐色，种子上有白色冠毛结成的绒球，随风飘散到远处。

蒲公英属植物根部通常包含多种化合物，这些化合物包括倍半萜烯、类胡萝卜素、香豆素、类黄酮、酚酸、多糖、桉叶内酯、三萜烯、固醇、类固醇等。这种化合物的具体例子包括大根香叶内酯、桉叶内酯、愈创木内酯、蒲公英苦素、苯丙素、糖苷、蒲公英苷、莴苣苦素、叶黄素、紫黄素、七叶苷、东莨菪亭、槲皮素、木犀草素、芸香苷、金圣草黄素、咖啡酸、香荚兰酸、丁香酸、阿魏酸、绿原酸、菊苣酸、对羟基苯乙酸、对羟基苯甲酸、菊糖、葡聚糖、甘露聚糖、野黑樱苷、11β,13-二氢山莴苣素、苦荬菜内酯D、ainslioside蒲公英酸、β-吡喃葡萄糖基、蒲公英酸、葡萄糖基酯、11,13-二氢蒲公英酸、l’-葡萄糖苷、山莴苣苦素、山莴苣素、菊苣苷、四氢日登内酯B、蒲公英内酯-O-β-吡喃葡萄糖苷、野黑樱苷、二氢松柏苷、紫丁香苷、二氢丁香苷、蒲公英甾醇、ψ-蒲公英甾醇、高-蒲公英甾醇、豆甾醇、环状类固醇、伞形酮、蒲公英蛋白酶、α-香树脂醇、β-香树脂醇、阿里二醇、款东二醇、羽扇豆醇、蒲公英醇、蒲公英甾醇、3β-羟基-18-羽扇豆烯-21-酮、β-谷甾醇、菜油甾醇、莴苣素A、胆素、果胶和蒲公英赛醇。

蒲公英提取物在过去用于例如抗氧化剂、利尿剂、止痛剂、抗凝血剂和抗癌剂。Sigstedt在“Evaluation of aqueous extracts of Taraxacum officinale on growth and invasion of breast andprostate cancer cells”(International Journal of Oncology,32(2008):1085-1090)中报道了关于从蒲公英种的西洋蒲公英的叶子(“DLE”)、花(“DFE”)或根部(“DRE”)制备的粗提取物的抗癌活性。在Sigstedt的蒲公英粗提取物由下列步骤制备：1)在室温下将75g干的植物部分浸泡24小时；2)过滤得到的混合物，以除去微粒物质；以及3)冻干混合物，得到粉末。Sigstedt发现，DLE会减少MCF-1/AZ乳腺癌细胞的生长，对LNCaP C4-2B前列腺癌细胞则不会；并且DFE和DRE在影响癌细胞生长上都失败了。

Takasaki在“Anti-carcinogenic Activity of Taraxacum Plant.I”(Biol.Pharm.Bull.,22.6(1999):602-605)报道了关于从日本蒲公英种的蒲公英中制备的根部提取物。Takasaki描述，用3L甲醇溶液提取600g干的根部，提取3次，每次5个小时，然后蒸发掉甲醇溶液，得到109g的甲醇提取物。Takasaki还描述了用0.38L水提取60g的日本蒲公英根部1个小时的水提取物，然后冻干得到的溶液。Takasaki描述到，甲醇提取物和水提取物都能抑制两阶段的化学致癌的发生和生长。

在“Anti-carcinogenic Activity of Taraxacum Plant.II”(Biol.Pharm.Bull.,22.6(1999):606-61000)报道了Takasaki描述了另一种日本蒲公英的蒲公英根部的制备方法，是用40L正己烷提取6.7kg干的根部，提取3次，每次8个小时，得到120.5g的提取物。

蒲公英植物的部分已被用于制备包括胶囊和药酒的不同形式的提取物。尤其蒲公英的根部被收获用于制备“蒲公英咖啡”，将干的植物根部浸泡在沸水中而获得。已经意识到的是，这种传统形式的蒲公英提取物通常与更低的抗癌活性有关系，当被引入到癌的或肿瘤组织时会有10％的细胞死亡。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于治疗、改善和/或预防癌症的药剂或药物组合物，该药剂或药物组合物包括蒲公英属植物根部提取物，优选地结合药学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、辅助剂和/或其它抗癌剂。

本发明的另一目的是提供一种适合于和/或有益于作为药物使用或人使用的蒲公英属植物根部提取物。

本发明的还一目的是提供一种包含蒲公英属植物根部提取物的药剂或药物组合物的制备方法，该根部提取物包括至少一种化合物可用于治疗、改善和/或预防癌症。

已经意识到的是，蒲公英属植物根部提取物可用在治疗和/或预防癌症，并且这些癌症不受限制地包括胰腺癌、大肠癌、血癌和皮肤癌。皮肤癌可能是黑色素癌，血癌可能是白血病，例如但不限于此，霍奇金氏淋巴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病和慢性单核细胞骨髓性白血病。

在一个可能的方法中，治疗或预防癌症的药物通过下述步骤制备：冷冻蒲公英属植物根部，获得冷冻的根，选择所述冷冻步骤是用于实现至少部分破坏一个或多个根部细胞；干磨上述冷冻的根，得到磨碎的根部粉末，其中在所述干磨步骤中，冷冻的根维持在低于大约40℃的研磨温度；将磨碎的根部粉末浸泡在溶剂中，得到具有液体提取部分和固体颗粒部分的悬浮液；将液体提取物部分与固体颗粒部分分离，以提供用于药物的分离的液体提取物。

然而无意于受理论约束，实验表明，包含在蒲公英属植物根部中的抗癌化合物如果在干燥环境中提高温度的情况下可能会减少它们的活性，虽然这种影响在潮湿环境下是不明显的或不存在的。申请人已经意识到，在提取制备过程中，蒲公英属植物根部不可以暴露在干热环境中，以免导致减少甚至可能消除抗癌活性。蒲公英属植物根部和它的抗癌活性最容易受到在研磨步骤中的影响以使其活性消除，在所述研磨步骤中，植物根部、根部细胞和细胞内容物可能在与例如研磨刀片的研磨机的转动元件接触时被加热。许多实验显示，在高于40℃时会发生活性损失，暴露在高于70℃时可能会带来抗癌活性的完全丧失。

在一较佳实施例中，研磨温度保持在低于大约0℃，更优选地在低于大约-25℃，最优选地在低于大约-40℃。

更进一步地，已经意识到的是，含有蒲公英属植物根部提取物的药物，如果所述由干磨而非湿磨得到的植物根制备，其抗癌活性可能获得改善。干磨是被认为是能够提供改善的和/或可控的对根部细胞的破坏，这样更多含量的细胞内抗癌内容物或化合物提供给接下来的提取步骤。更佳地，所述冷冻的根干磨至平均粒径在小于大约100μm，更优选地，小于大约50μm，最优选地，在大约1μm至大约30μm。

在一个较佳的方面，蒲公英属植物根部提取物尤其用于包含在治疗、改善或预防癌症的药物中，如果蒲公英根部从植物在春季开花或发芽前、或较佳地前90天、更佳地前30天内采摘处于暂停活动的蒲公英属植物收获，或在冬季蓓蕾停止生长进入冬眠期之前收获。

然而无意于受理论约束，相信蒲公英属植物根部在开花期或休眠期制备会有物理变化。特别地，从在三个不同时间点(春天、夏天和初秋)获得的蒲公英根(“DRE”)制备的提取物得到的实验数据表明，从在早春和初秋时期收获的根制备的提取物对诱导癌细胞的细胞死亡更有效。尤其，在加拿大安大略省在三月、九月和十月收获的蒲公英根对诱导癌细胞的细胞死亡非常有效。相信根部提取物的抗癌化合物是被合成用于准备休眠期(在寒冷的气候)，其可能会诱导准备过冬的植物中的细胞死亡并消除老化细胞。

在一个较佳实施例中，蒲公英属植物根部在冷冻步骤前，干燥至相对湿度在大约5％至10％。较佳地，将植物根部切成片状根部切片，平均尺寸在大约0.2cm至1.0cm。

蒲公英属植物根部最好从下列蒲公英种类、但不限于这些种的植物中获得：西洋蒲公英、红果蒲公英、朝鲜蒲公英、日本蒲公英、平滑蒲公英、红果蒲公英和加利福尼亚蒲公英。较佳地，植物根部从开放的草地采摘的西洋蒲公英或平滑蒲公英中获得。

在冷冻步骤中，较佳地，植物根部接触或沉浸在液氮中，或者可选地，在低于0℃的冷冻温度中、或者更佳地在大约-210℃至大约-30℃之间实施，持续大约5分钟至24小时，或直到完全冰冻。

干磨步骤可以通过研磨机来实现，包括但不限于研钵及研杵、粉粹机、冲击式研磨机、微粉磨粉机，以对根部细胞产生实质性破坏。为了减少暴露在干燥环境中超过40℃升高的温度中，最好冷却研磨机，利用例如液氮，以阻止热量接触到冰冻的根或得到的磨碎的根部粉末。最好将研磨机冷却到低于-25℃，更佳地，低于-50℃。

为了更好实现位于根部细胞的有治疗活性的化合物的释放，所述研磨步骤较佳地破坏或破开细胞，以释放它们的内部物质。

将磨碎的根部粉末浸泡在液体或溶剂中，较佳地在极性溶剂中，例如在浸泡温度在大约5℃至大约100℃的水中，或者更佳地在大约25℃的水中。其它合适的溶剂包括但不限于正戊烷、环戊烷、环己烷、苯、甲苯、1,4-二氧己环、三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、碳酸丙烯酯、甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇和醋酸。磨碎的根部粉末在液体中较佳地浸泡大约5分钟至大约24小时，或者更佳地在大约10分钟至大约30分钟，有或没有搅拌。最佳地，磨碎的根部粉末以10g研磨的根部/50ml水的浓度浸泡在水中，并煮沸10分钟至30分钟。

所述悬浮液中的液体提取物部分，优选地通过过滤和/或离心分离，与固体颗粒部分进行分离。如果离心分离被操作施，较佳地，在5000×g至8000×g范围内实施，以除去任何多余的纤维。过滤优选为使用吸滤和滤纸张过滤器来操作，所述滤纸过滤器优选为具有的孔尺寸为小于或等于大约0.45μm，并最优选为小于或等于大约0.22μm。在一个最优选实施例中，所述过滤步骤使用降低的孔尺寸的滤纸过滤器逐步过滤。用于所述过滤步骤的一个或多个过滤器或滤纸可以是设置为可以除菌的。

较佳地，从悬浮液中获得的分离的液体提取物冷冻干燥至提取物粉末。更佳地，该冷冻干燥步骤的操作温度在大约-80℃至-40℃。

所述提取物粉末可以和药学上可接受的载体、稀释剂、粘结剂、辅助剂和/或额外的抗癌剂一起包括在所述药物中。所述抗癌剂包括二甲双胍、羟基脲、环磷酰胺和/或依托泊苷。

所述药物较佳地包括包含大约5mg/kg体重/天至大约1000mg/kg体重/天的范围内的所述提取物粉末的剂量，更佳地在大约10mg/kg体重/天至大约70mg/kg体重/天。或者，较佳地在大约0.5g至大约70g，更佳地在大约1至4g的所述提取物粉末包括在所述药物中制成每日剂量。

在另一方面，本发明还提供一种用于治疗或预防癌症的、包括蒲公英属植物根部提取物的药物的制备方法，该方法包括下列步骤：(1)冷冻蒲公英属植物根部，以获得冷冻的植物根，所述冷冻步骤至少产生部分破坏一个或多个根部细胞的效果，其中所述蒲公英植物根部包括在植物发芽或开花之前或在芽生长停止后收获的处于休眠状态的蒲公英属植物根部；(2)干磨所述冷冻的植物根，以获得平均粒径小于大约100μm、较佳地小于大约50μm的磨碎的植物根部粉末，其中在所述干磨步骤中，冷冻的根的研磨温度维持在低于大约40℃；(3)将该磨碎的植物根部粉末浸泡在包括乙醇和水的其中一种或两种的溶剂中，生成含有液体溶液部分和固体部分的混合物；(4)将所述液体溶液部分与所述固体部分进行分离；以及(5)冷冻干燥所述液体溶液部分，获得作为干燥的提取物粉末的蒲公英属植物根部提取物，并可选地，将该干燥的提取物部分与药学可接受的载体、稀释剂、粘合剂、辅助剂和抗癌剂中的一种或多种混合。

处于休眠状态的植物根部在第一次季节性植物开花或发芽之前的90天、较佳地30天内收获。该植物根部可来自属于西洋蒲公英、红果蒲公英、朝鲜蒲公英、日本蒲公英、平滑蒲公英、红果蒲公英和加利福尼亚蒲公英的种中的植物。

该植物根部较佳地在冷冻前干燥至小于大约10％的相对湿度。在接下来的所述冷冻步骤中，根植物根部较佳地接触或浸没在液氮中，至平均冷冻温度在大约-210℃至大约-30℃。

在所述干磨步骤中，所述冷冻的根研磨，较佳地，至平均粒径小于大约50μm、更佳地在大约1μm至大约30μm之间。所述干磨步骤可以通过研磨机实现，包括但不限于研钵及研杵、粉粹机、冲击式研磨机、微粉磨粉机，以对一个或多个根部细胞产生实质性破坏。为了减少暴露在干燥环境中升高的温度中，最好冷却研磨机，利用例如液氮，最好将研磨机冷却到低于大约-25℃，更佳地低于大约-50℃。

在所述浸泡步骤中所用的溶剂可以额外地包括正戊烷、环戊烷、环己烷、苯、甲苯、1,4-二氧己环、三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、碳酸丙烯酯、甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、甲醇或醋酸中的一种或多种。所述浸泡步骤的浸泡温度较佳地在大约5℃至大约100℃，较佳地浸泡大约5分钟至大约24小时，有或没有搅拌。

从混合物中的所述固体部分分离出所述液体溶液部分可以利用不同的分离技术。这种技术包括、但不限于离心分离和过滤。如果采用离心分离，较佳地在5000×g至8000×g之间进行。如果使用过滤，较佳地使用至少两种不同孔径的过滤器进行至少两次，例如大约0.45μm和大约0.22μm。为了提高人体服用的安全性，用于过滤步骤的一种或多种过滤器或滤纸可以设置成可以除菌的。

在一个较佳实施例中，研磨温度低于大约0℃、较佳地低于大约-25℃、更佳地低于大约-40℃。

所述药物较佳地包括一种包含大约5mg/kg体重/天至大约1000mg/kg体重/天、更佳地在大约10mg/kg体重/天至大约70mg/kg体重/天范围内的所述蒲公英属植物提取物的剂量。或者，较佳地在大约0.5g至大约70g，更佳地在大约1-4g的所述蒲公英属植物提取物包括在每日剂量形式的所述药物中。

在方面(1)中，本发明还提供一种用于治疗或预防癌症的药物的制备方法，该方法包括：冷冻蒲公英属植物根部，以获得冷冻的植物根，所述冷冻步骤至少产生部分破坏一个或多个根部细胞的效果；干磨所述冷冻植物根，以获得磨碎的植物根部粉末，其中在所述干磨步骤中，冷冻的根的研磨温度维持在低于大约40℃；将该磨碎的植物根部粉末浸泡在溶剂中，获得含有液体溶液部分和固体部分的悬浮液；将所述液体溶液部分与所述固体部分进行分离，以提供使用在所述药物中的分离的液体提取物。

在方面(2)中，本发明提供一种根据方面(1)所述的方法，其中所述癌症是大肠癌、胰腺癌、血癌或皮肤癌。

在方面(3)中，本发明提供一种根据方面(1)和/或(2)所述的方法，其中所述癌症包括所述血癌或所述皮肤癌，并且选自由慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性单核细胞骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴癌和黑色素瘤组成的组。

在方面(4)中，本发明提供一种根据方面(1)至(3)中任意一个或多个任意组合的方法，其中在所述冷冻步骤之前，该方法还包括干燥所述植物根部至相对湿度在大约5％至大约10％之间。

在方面(5)中，本发明提供一种根据方面(1)至(4)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述蒲公英属植物根部包括在植物开花或发芽之前或在芽生长停止之后收获的处于休眠状态的蒲公英属植物根部。

在方面(6)中，本发明提供一种根据方面(1)至(5)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述处于休眠状态的蒲公英属植物根部在所述的植物开花或发芽之前大约90天、较佳地大约30天内收获。

在方面(7)中，本发明提供一种根据方面(1)至(6)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述蒲公英属植物根部是来自属于选自包括西洋蒲公英、红果蒲公英、朝鲜蒲公英、日本蒲公英、平滑蒲公英、红果蒲公英和加利福尼亚蒲公英的组的种的植物中的一种或几种。

在方面(8)中，本发明提供一种根据方面(1)至(7)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述冷冻步骤包括将所述植物根部接触或浸没在液氮中，或者将所述植物根部冷冻至平均冷冻温度在大约-210℃至大约-30℃之间。

在方面(9)中，本发明提供一种根据方面(1)至(8)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述干磨步骤包括干燥研磨所述冷冻的根至平均粒径小于大约100μm、较佳地小于大约50μm。

在方面(10)中，本发明提供一种根据方面(1)至(9)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述干磨步骤包括用选自由粉粹机、冲击式研磨机和微粉磨粉机组成的组的研磨机干燥研磨冷冻的根，其中将研磨机或它的部件冷却至低于大约-25℃，更佳地低于大约-50℃，以阻止热量接触到冰冻的根或磨碎的根部粉末。

在方面(11)中，本发明提供一种根据方面(1)至(10)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述所述溶剂包括水、正戊烷、环戊烷、环己烷、苯、甲苯、1,4-二氧己环、三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、碳酸丙烯酯、甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇和醋酸中的一种或多种。

在方面(12)中，本发明提供一种根据方面(1)至(11)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述浸泡步骤包括将所述磨碎的根部粉末以浸泡温度在大约2℃至大约150℃、较佳地大约5℃至大约100℃条件下浸泡在水中，较佳地浸泡大约5分钟至大约24小时，有或没有搅拌。

在方面(13)中，本发明提供一种根据方面(1)至(12)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述分离步骤包括过滤和离心分离中的至少一种，其中所述过滤可以是实施一次，或者使用多个相同或不同孔径的过滤器实施多次，所述离心分离是在5000×g至8000×g之间进行。

在方面(14)中，本发明提供一种根据方面(1)至(13)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述分离步骤包括用具有第一孔径为大约0.45μm的第一过滤器和具有第二孔径为大约0.22μm的第二过滤器过滤所述悬浮液至少两次，其中所述第二过滤器是用于除菌。

在方面(15)中，本发明提供一种根据方面(1)至(14)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中在所述干磨步骤之前，该方法还包括将所述植物根部切片，形成多个根部切片。

在方面(16)中，本发明提供一种根据方面(1)至(15)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述研磨温度低于大约0℃。

在方面(17)中，本发明提供一种根据方面(1)至(16)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述研磨温度低于大约-25℃，较佳地低于大约-40℃。

在方面(18)中，本发明提供一种根据方面(1)至(17)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述方法还包括冷冻干燥分离后的液体提取物，以获得提取物粉末，以及，可选地，将所述提取物粉末与药学上可接受的载体、稀释剂、粘结剂、辅助剂和抗癌剂中的一种或多种混合。

在方面(19)中，本发明提供一种根据方面(1)至(18)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述抗癌剂是二甲双胍、羟基脲、环磷酰胺和依托泊苷中的一种或多种。

在方面(20)中，本发明提供一种根据方面(1)至(19)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述药物包括一个具有大约5mg/kg体重/天至大约1000mg/kg体重/天的范围内的所述提取物粉末的剂量，更佳地在大约10mg/kg体重/天至大约70mg/kg体重/天。

在方面(21)中，本发明提供一种根据方面(1)至(20)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述药物包括一个日剂量，该日剂量是具有大约0.5g至大约70g，更佳地在大约1至4g的所述提取物粉末。

在方面(22)中，本发明提供一种用于治疗或预防癌症的、包括蒲公英属植物根部提取物的药物的制备方法，该方法包括下列步骤：(1)冷冻蒲公英属植物根部，以获得冷冻的植物根，所述冷冻步骤至少产生部分破坏一个或多个根部细胞的效果，其中所述蒲公英植物根部包括在植物发芽或开花之前或在芽生长停止后收获的处于休眠状态的蒲公英属植物根部；(2)干磨所述冷冻植物根，以获得平均粒径在小于大约100μm、较佳地小于大约50μm的磨碎的植物根部粉末，其中在所述干磨步骤中，冷冻的根的研磨温度维持在低于大约40℃；(3)将该磨碎的植物根部粉末浸泡在包括乙醇和水的其中一种或两种溶剂中，生成含有液体溶液部分和固体部分的混合物；(4)将所述液体溶液部分与所述固体部分进行分离；以及(5)冷冻干燥所述液体溶液部分，获得作为干燥的提取物粉末的蒲公英属植物根部提取物，并可选地，将该干燥的提取物部分与药学可接受的载体、稀释剂、粘合剂、辅助剂和抗癌剂中的一种或多种混合。

在方面(23)中，本发明提供一种根据方面(22)所述的方法，其中所述癌症是大肠癌、胰腺癌、血癌或皮肤癌。

在方面(24)中，本发明提供一种根据方面(22)和/或(23)所述的方法，其中所述癌症是慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性单核细胞骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴癌或黑色素瘤。

在方面(25)中，本发明提供一种根据方面(22)至(24)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述处于休眠状态的蒲公英属植物根部在第一季节性植物开花或发芽之前大约90天、较佳地大约30天内收获。

在方面(26)中，本发明提供一种根据方面(22)至(25)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述蒲公英属植物根部是来自属于选自包括西洋蒲公英、红果蒲公英、朝鲜蒲公英、日本蒲公英、平滑蒲公英、红果蒲公英和加利福尼亚蒲公英的组的种的植物中的一种或多种。

在方面(27)中，本发明提供一种根据方面(22)至(26)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中在所述冷冻步骤之前，该方法还包括干燥所述植物根部至相对湿度低于大约10％。

在方面(28)中，本发明提供一种根据方面(22)至(27)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述冷冻步骤包括将所述植物根部接触或浸没在液氮中，冷冻至平均冷冻温度在大约-210℃至大约-30℃之间。

在方面(29)中，本发明提供一种根据方面(22)至(28)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述干磨步骤包括用研磨机干燥研磨所述冷冻的根至平均粒径小于大约50μm，并且产生对一个或多个根部细胞有实质性破坏的效果，所述研磨机选自由粉粹机、冲击式研磨机和微粉磨粉机组成的组，其中所述干磨步骤还包括将所述研磨机冷却至低于大约-25℃。

在方面(30)中，本发明提供一种根据方面(22)至(29)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述溶剂还包括正戊烷、环戊烷、环己烷、苯、甲苯、1,4-二氧己环、三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、碳酸丙烯酯、甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、甲醇或醋酸。

在方面(31)中，本发明提供一种根据方面(22)至(30)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述浸泡步骤包括将所述磨碎的植物根部粉末以浸泡温度在大约5℃至大约100℃条件下浸泡在溶剂中，较佳地浸泡大约5分钟至大约24小时，有或没有搅拌。

在方面(32)中，本发明提供一种根据方面(22)至(31)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述分离步骤包括过滤和离心分离中的至少一种，其中所述过滤是进行一次或者使用多个相同或不同孔径的过滤器进行多次，所述离心分离是在5000×g至8000×g之间进行。

在方面(33)中，本发明提供一种根据方面(22)至(32)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述分离步骤包括用具有第一孔径为大约0.45μm的第一过滤器和具有第二孔径为大约0.22μm的第二过滤器过滤所述混合物至少两次，其中所述第一和/或第二过滤器是用于除菌。

在方面(34)中，本发明提供一种根据方面(22)至(33)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述抗癌剂包括二甲双胍、羟基脲、环磷酰胺和依托泊苷中的一种或多种。

在方面(35)中，本发明提供一种根据方面(22)至(34)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中在所述干磨步骤之前，该方法还包括将所述蒲公英属植物根部切片，形成数片平均尺寸在大约0.2cm至1.5cm的根部切片。

在方面(36)中，本发明提供一种根据方面(22)至(35)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述研磨温度低于大约0℃。

在方面(37)中，本发明提供一种根据方面(22)至(36)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述研磨温度低于大约-25℃，较佳地低于大约-40℃。

在方面(38)中，本发明提供一种根据方面(22)至(37)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述药物包括一种具有大约5mg/kg体重/天至大约1000mg/kg体重/天的范围内的所述蒲公英属植物根部提取物的剂量，更佳地在大约10mg/kg体重/天至大约70mg/kg体重/天。

在方面(39)中，本发明提供一种根据方面(22)至(38)中的任意一个或多个任意组合的方法，其中所述药物包括一种日剂量，该日剂量是具有大约0.5g至大约70g，更佳地在大约1-4g的所述蒲公英属植物根部提取物。

附图说明

图1是显示基于用不同含量的DRE(x轴)治疗的人急性T-细胞白血病(Jurkat)细胞诱发细胞凋亡的百分数(y轴)的柱状图。

图2是显示不同浓度DRE(x轴)的Jurkat细胞的存活百分率(y轴)的柱状图。

图3是显示用不同浓度的DRE(x轴)治疗24、48或72小时后A375人体黑色素瘤细胞的存活百分率(y轴)的线图。

图4是一组用浓度为1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗48小时后，用Hoechst 33342荧光染料着色的A375人体黑色素瘤细胞的荧光显微镜照片。

图5是一组用浓度为0.6mg/ml、1.0mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗48小时后，用Hoechst荧光染料着色或Annexin-V染色剂着色(分别在顶部行和底部行)的MV-4-11细胞的400倍放大的图像。

图6是一组用浓度为0.6mg/ml、1.0mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗48小时后用Hoechst荧光染料着色或Annexin-V染色剂着色(分别在顶部行和底部行)的U-937细胞的400倍放大的图像。

图7是一组用浓度为0.6mg/ml、1.0mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗48小时后用Hoechst荧光染料着色或Annexin-V染色剂着色(分别在顶部行和底部行)的HL-60细胞的400倍放大的图像。

图8是用浓度为0.6mg/ml、1.0mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗48小时后，MV-4-11细胞被诱导凋亡的百分数(y轴)的柱状图。

图9是显示用浓度为0.6mg/ml、1.0mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗48小时后，HL-60细胞被诱导凋亡的百分数(y轴)的柱状图。

图10是显示用浓度为0.6mg/ml、1.0mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗48小时后，U-937细胞被诱导凋亡的百分数(y轴)的柱状图。

图11是显示用0.6mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗5分钟、15分钟、30分钟和60分钟后，MV-4-11细胞中的Caspase-8的活力或活性(y轴)的柱状图。

图12是显示用0.6mg/ml的DRE、并且包括对照组治疗5分钟、15分钟、30分钟和60分钟后，MV-4-11细胞中的Caspase-3的活力或活性(y轴)的柱状图。

图13是一组用浓度为2.5mg/ml、5mg/ml和7.5mg/ml的DRE、包括对照组(行)治疗24小时、48小时、72小时和96小时(列)的用Hoechst荧光染料着色的PANC-1细胞图像。

图14是显示用浓度为2.5mg/ml、5mg/ml和7.5mg/ml的DRE、包括对照组治疗24小时、48小时、72小时和96小时(x轴)的PANC-1细胞的细胞凋亡的平均百分数(y轴)的柱状图。

图15是一组用普通过滤水或包含5.0mg/ml的DRE的水治疗一个月(分别在左列和右列)后40倍或63倍放大(分别在顶部行和底部行)的伊红染色的balb/c小鼠的肝脏组织图像。

图16是显示用浓度为2.5mg/ml或5.0mg/ml的DRE、包括对照组治疗不同天数(x轴)的balb/c小鼠体重(y轴)的线图。

图17是一组用浓度为0.4mg/ml、0.6mg/ml和2.5mg/ml的DRE、包括对照组治疗96小时后，用Hoechst 33342荧光染色剂着色(上行)或在相衬照明(底行)上看到的DnFADD细胞400倍放大的显微镜图像。

图18是显示用浓度为0.4mg/ml、0.6mg/ml和2.5mg/ml(x轴)、包括对照组的DRE治疗的外周血单个核细胞的细胞死亡平均百分数(y轴)的柱状图。

图19是显示用浓度为0.4mg/ml和0.6mg/ml的DRE(x轴)、包括对照组治疗的外周血单个核细胞的浓度(y轴)的柱状图。

图20是显示用通过使用台盼蓝拒染试验获得的浓度为0.6mg/ml和2.5mg/ml的DRE(x轴)、包括对照组治疗的DnFADD细胞的浓度(y轴)图。

图21是显示用DRE、包括对照组治疗15分钟、30分钟、60分钟、180分钟和1440分钟的DnFADD细胞中Caspase-8的平均显示的活力或活性(y轴)的柱状图。

图22是一组用浓度为1.0mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的DRE、包括对照组治疗后，从最新诊断的白血病病人中分、离并用Hoescht或Annexin-V染色剂(分别在顶部行和底部行)着色的外周血单个核细胞的图像。

图23是显示用浓度为1.0mg/ml、2.5mg/ml和5.0mg/ml的DRE、包括对照组治疗24小时或48小时后，从最新诊断的白血病病人中分离并被诱导细胞凋亡的外周血单个核细胞的百分数(y轴)的柱状图。

图24是显示用浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml、5.5mg/ml和6.0mg/ml的DRE、包括对照组治疗24、48、72和96个小时后HT-29人体大肠癌细胞的存活率百分数(y轴)的柱状图。

图25是一组用普通过滤水(上行)或用DRE治疗一个月(底行)后，经伊红染色的balb/c小鼠心脏、肾脏和肝脏组织的图像。

图26是显示用DRE、包括对照组治疗不同天数(x轴)的balb/c小鼠的重量(y轴)的线图。

图27是显示从经DRE、包括对照组治疗的balb/c小鼠收集到的尿样中发现的蛋白质的含量(y轴)的柱状图。

图28是显示不同天数(x轴)对照组CD-I nu/nu小鼠的体重(y轴)的线图。

图29是显示用浓度为2.5mg/ml的DRE治疗不同天数(x轴)的CD-I nu/nu小鼠的体重(y轴)的线图。

图30是CD-I nu/nu小鼠移植HT-29细胞、并用过滤的普通过滤水治疗三个星期后的照片。

图31是CD-I nu/nu小鼠移植HT-29细胞、并用浓度为2.5mg/ml的DRE治疗三个星期后的照片。

图32是显示用浓度为2.5mg/ml的DRE、包括对照组治疗不同天数(x轴)的CD-Inu/nu小鼠的肿瘤体积(y轴)的柱状图。

图33是一组用普通过滤水治疗一个月后，用10倍或63倍放大(分别为顶部行和底部两行)的经伊红染色的CD-I nu/nu小鼠心脏、肾脏、肝脏和异种器官移植的肿瘤组织图像。

图34是一组用浓度为2.5mg/ml的DRE治疗一个月后，用10倍或63倍放大(分别为顶部行和底部两行)的经伊红染色的CD-I nu/nu小鼠心脏、肾脏、肝脏和异种器官移植的肿瘤组织图像。

具体实施方式

根据本发明的较佳实施例，用于治疗和/或预防肿瘤的蒲公英属植物根部提取物被制备。为制备出较佳的蒲公英属植物根部提取物，在加拿大安大略省，在春季开花之前的大约30天、以及正好在秋季的开始的时候，西洋蒲公英种的蒲公英被采集。采集到的植物在水中清洗，然后切下茎的基部以获得根部。然后将收获到的根部切成大约在长度方向上1/4”长的切片。

将切成的根部切片浸没在液氮中大约5-10分钟，直到完全冷冻。冷冻的切片在冲击式研磨机中研磨至平均粒径大约小于45μm。将磨碎的根部浸泡在沸腾过的蒸馏水中浸泡1个小时，以溶解活性化合物。

在提取/溶解步骤之后，包含有活性化合物的蒸馏水用孔径大约为0.45μm的滤纸真空过滤，以移除其它植物物质(plant matter)和过量的纤维。然后将得到的滤液在-80℃下冷冻干燥，以获得粉末的根部提取物。经干燥的提取物放在水中重构，给出最终浓度为100mg/ml的存货样本。该根部提取物的存货样本进一步用孔径大约为0.22μm的细菌过滤纸真空过滤，以杀菌、制备提取物备用。为了给药，将大约1g的粉末根部提取物重新溶解在大约10ml的沸腾过的水中，并过滤。然后滤液可以对诊断有癌症的病人给药。较佳地，用于给药的粉末根部提取物与水的比例应该每100ml大约在0.1g至50g之间的量。

将本发明的植物根部提取物的几份分离、并准备为生物活性试验做测试。基于DRE诱到细胞凋亡的机制，多种化合物能够单独地或与一个或多个不同目标结合地产生活性。而且，本发明的DRE在包括那些对白血病、大肠癌、胰腺癌和黑色素瘤中实施的体外研究显示，在人体癌细胞系中可选择性地诱发程序化的细胞死亡类型I和类型II，同时保持非肿瘤细胞对细胞凋亡和自噬诱导不敏感。尤其，发明人发现，DRE可通过靶向于癌细胞上的死亡受体，例如Fas或TNF死亡受体家族，或者激活死亡诱导信号复合物，来快速激活外在细胞死亡通路，从而诱导细胞死亡，通过治疗后Caspase-8的快速激活和随后的Caspase-3的激活可以证实这一点。

而且，在DRE中的化合物显示出可直接靶向于癌细胞的线粒体，意味着DRE的成分可直接与线粒体互相作用，引起它的不稳定，来释放促凋亡因子并产生活性氧。DRE被认为是包含了多种可能具有多重靶标的化合物，并可以是以水溶性盐、配位体衍生物或其它相互作用/结合的蛋白的形式存在。

本发明的药物，采用大量细胞系测试它的活性和/或安全性。除此之外，还用从十个不同癌症病人中分离出来的细胞系做体外实验，这十个不同癌症病人患有慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病或慢性单核细胞骨髓白血病。从这些病人中收集的血样用不同剂量的蒲公英根部提取物处理48小时。与从健康的志愿者中分离出的血液细胞系相比，蒲公英根部提取物显示出对慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和慢性单核细胞骨髓白血病的细胞系的诱导细胞死亡。

下面还提供一个表格，这个表格综述了许多在其它细胞系上做的额外测试和从每个测试的细胞系获得的实验数据：

为进一步明确地说明本发明的药物的有效性，提供下列举例性的实验的详细描述：

i)蒲公英根部提取物在人体T-细胞白血病细胞上的抗癌活性

DRE抵抗人体急性T-细胞白血病细胞系(Jurkat)的活性与它在非癌外周血单个核细胞(PBMCs)的影响平行进行评估。如图1所示，由人工Hoescht图像测定，蒲公英粗提取物(100μL)诱导大约50％细胞凋亡。而且，图2显示了DRE在浓度为0.4和0.6mg/ml时对Jurkat细胞的存活率的影响，通过WST-1的细胞增殖实验测定，如图所示，可以观察到随着DRE浓度的升高，细胞存活率逐渐降低。我们的发现显示，DRE在较低的浓度下可以选择性地诱导癌细胞的细胞凋亡，而对PBMCs无毒。而且，还显示，DRE的治疗导致Caspase-8的非常早期的激活和Caspase-3随后的激活。

ii)蒲公英根部提取物对于侵润性人体黑色素瘤细胞的抗癌活性

研究了DRE在体外对于人体黑色素瘤细胞系的影响。对于黑色素瘤，一种非常有侵润性的抗药性形式的皮肤癌，图3和图4显示DRE对诱导细胞凋亡非常有效。为获得图3，A375人体黑色素瘤细胞接种在96孔板(大约1000个细胞/孔)，并且用不同浓度的DRE治疗24、48和72个小时。如图4所示，可以观察到用最高10mg/ml的不同浓度的DRE治疗48小时的A375细胞中典型的细胞凋亡的形态。为获得图4的图像，细胞用Hoechst 33342荧光染色剂着色，在荧光显微镜下获得图像。通过明亮地着色，浓缩的主体部分显示细胞凋亡的细胞核。

DRE还显示出对线粒体的靶向作用，产生活性氧。而且，抗药性黑色素瘤细胞通过新陈代谢干涉药物二甲双胍对DRE更加敏感。

iii)蒲公英根部提取物对于侵润性人体慢性单核细胞骨髓白血病(CMML)的抗癌活性

评价了在更具有侵润性的白血病细胞系中DRE的功效，以确定它在诱导CMML细胞中的细胞凋亡/细胞自噬的选择性和功效。如图5至图10显示，DRE显示出以剂量和时间依赖性的方式有效地诱导细胞凋亡和细胞自噬。

如图11和图12所示，在CMML细胞中发现，通过细胞凋亡的外在通路的激活，Caspase-8和Caspase-3的快速激活，堪比在Jurkat细胞中的发现的水平。为获得图11和图12的柱状图，在DRE治疗后，在指定的时间点和DRE浓度，收集MV-4-11细胞，并且冲洗和用细胞裂解液孵育以获得细胞裂解产物。该细胞裂解产物用对每种Caspase的Caspase特异性的基质孵育，并孵育一个小时。用荧光分光计进行荧光阅读。

如图17和图20所示，表达显性-阴性FADD(DnFADD)蛋白质——一种死亡诱导信号复合体(DISC)的主要成分——的jurkat细胞，对由DRE诱导的细胞凋亡不敏感，进一步表明细胞死亡的外在通路的参与。图21显示，使用Caspase-8特异性基质和荧光阅读，DRE治疗后，在不同时间点的DnFADD细胞中Caspase-8的激活，并且制图。

还显示出，在慢性单核细胞骨髓白血病细胞中细胞凋亡的诱导在用pan-caspase抑制剂z-VAD-fmk预处理后受到阻碍。

非癌外周血单个核细胞(ncPBMCs)，用蒲公英根部提取物平行处理后，对细胞凋亡不敏感，表明蒲公英根部提取物在细胞培养中的选择性。

从这个研究结果表明，本发明的蒲公英根部提取物可以用于今天可用的传统的癌症治疗的新型无毒替换物。而且，也可以用于与传统疗法结合(更低浓度的毒性化合物)以提高它们在治疗癌症中的效果。

iv)蒲公英根部提取物对于侵润性人体胰腺癌细胞的抗癌活性

本发明的蒲公英根部提取物诱导侵润性人体胰腺癌细胞系(BxPC-3和PANC-1)的细胞凋亡具有剂量和时间依赖性。如图13和图14所示，随着剂量的增加和用DRE处理后的时间段的增加，明亮着色提高，可以观察到所指示的细胞凋亡的浓缩细胞核。PANC-1的Hoechst照片的人工量化显示，细胞凋亡平均百分数的增加具有剂量和时间依赖性。

平行地，在非癌正常人体和胎儿纤维母细胞中的类似实验显示，DRE可选择性地靶向人体胰腺癌细胞，证实了之前的研究结果。Caspase-8的早期激活和Caspase-3随后的激活显示，由DRE诱导的细胞凋亡是由于细胞凋亡的外在通路的激活。

DRE诱导人体胰腺癌细胞的细胞自噬的促进死亡形式。这种细胞自噬的诱导是与线粒体膜电位的不稳定相一致的，其在用DRE处理后可以观察到。通过复活实验显示，一旦细胞暴露于DRE，确保自噬信号就被维持。

v)蒲公英根部提取物(DRE)对于其它侵润性人体癌细胞的抗癌活性

本发明的DRE显示出对于侵润性人体大肠癌和成神经细胞瘤细胞是有效的。如图24所示，以剂量和时间依赖性方式，用DRE治疗后HT-29人体大肠癌细胞的存活率受到影响。在96h的EC₅₀确定为浓度3.0mg/ml。图24是从WST-1细胞增殖实验收集的数据得来的。具体地，将HT-29人体大肠癌细胞接种在96孔板上(大约5000个细胞/孔)，然后用不同浓度的DRE处理24、48、72和96个小时。

vi)蒲公英根部提取物在小鼠模型中的毒性评价

在体外小鼠模型中——在没有任何癌细胞的情况下使用雄性balb/c小鼠——研究了本发明提取物的毒性。有一个在普通过滤水计划上的控制组和两个DRE组；在低剂量组，在它们的饮用水中给出2.5mg/ml DRE(相当于对于一个70kg病人人体剂量的105g/天)，在高剂量组，在它们的饮用水中给出5.0mg/ml DRE。平均每个小鼠每天消耗大约5ml饮用溶液，折算为500mg/kg/天(低剂量组，以1∶10的提取率从5g干的根部提取)以及1000mg/kg/天(高剂量组，以相同的1∶10的提取率从10g干的根部提取)。这些剂量比在体外研究中的诱导细胞凋亡所需的更高。这些小鼠每天在它们的水中给于DRE，并且监控超过一个月，每天测量体重，如图16和图26两个独立的实验所示。过了34天后，按照温莎大学动物委员会指引方针牺牲这些小鼠，摘下器官(肝脏、肾脏和心脏)用于病理学分析。如图15和图25进一步显示，基于测量的体重和病例学可以看到对这些小鼠没有毒性。在对照组未经处理小鼠和喂有DRE的小鼠之间从体重变化和获得器官的病理学看没有差别。

进一步的疗效研究在用DRE治疗组中的四个小鼠上进行，全部的35天给出500mg/kg/天的DRE。它们的来自肝脏、肾脏和心脏的组织分析任何毒性的迹象。与用水喂养的对照组小鼠对比，这些组织显示出没有任何变化。为进一步的毒性显示，尿液也从每组小鼠获得并使用布拉德福德(Bradford)蛋白质评估实验分析蛋白质含量。如图27所示，与那些对照组小鼠对比，在用DRE喂养的小鼠中发现更低水平的蛋白质。这些结果表明，本发明的DRE，作为在一个长的时间段内对它们饮用水的补充，在小鼠中是无毒的并且耐受良好的。

在体外用小鼠模型进行的进一步的毒性试验确认，本发明的提取物以每天剂量在3％的体重、1.0g/kg/天至100g/kg/天没有发现任何明显的毒性。

基于这些毒性试验，对于人体病人的有效剂量较佳地在大约0.5-4.0g/天/病人(70kg体重)，或更佳地2.0g/天/病人(是小鼠中耐受良好的剂量的2％不到)。一个用本发明DRE治疗的病人是有耐药力的，对于23mg/kg/天是敏感的。

vii)蒲公英提取物在白血病病人衍生的离体案例中的抗癌活性

来自最新诊断的病人的病人衍生白血病样品中研究了DRE的效果。使用来自9个病人的案例进行实验。从最新诊断的病人获取血液样本，分离出外周血单个核细胞(PBMCs)并用本发明的DRE进行处理。如图22和图23所示，本发明的DRE以剂量和时间依赖性方式有效地诱导了从白血病病人获得的PBMCs的细胞凋亡。图23是通过从6个不同病人的Hoechst照片的人工量化获得的。

viii)蒲公英提取物在免疫功能不全的小鼠中对抗人体大肠癌异种器官移植的疗效

为了评价本发明的DRE对不同癌症的体外模型中的疗效，使用免疫功能不全的CD-I nu/nu小鼠做大肠癌模型的异种器官移植。具体地，在小鼠的任意一侧皮肤下注射HT-29细胞，并在进入治疗之前的允许形成肿瘤一个星期。小鼠分成两组(每组4个小鼠)，一组是用普通过滤水计划，另一组是在它们的饮用水中给出2.5mg/ml的DRE水溶液(400mg/kg/天，以提取比例1∶10从5g干的根部提取)，喂服一个月。每天测量每只小鼠的体重，在治疗一个月后，牺牲小鼠，并摘取器官用于病理学分析。

如图28和图29所示，在对照组喂水小鼠和喂DRE小鼠之间的体重没有变化，证实了没有毒性。图30和图31分别为用普通过滤水或DRE处理三个星期后CD-I nu/nu小鼠的照片。如图32所示，与喂DRE小鼠比较，喂水小鼠具有更大体积的肿瘤，表明了DRE在体外模型中对抗大肠癌的疗效。

如图33和图34进一步显示，心脏、肾脏和肝脏的组织化学状态在对照组与用DRE处理的动物之间没有显示任何差异，表明对这些组织没有毒性。另一方面，在对照组和处理的动物中的肿瘤化学状态显示了明显的差别，可以看到处理的动物中肿瘤细胞核的显著下降。

用HCT116细胞替换HT-29细胞做类似研究，显示出类似的疗效和毒性结果。

上述结果表明，在DRE治疗组中与喂水组对比，DRE能够阻止大肠癌肿瘤的生长。在DRE治疗组中没有观察到毒性，证实了毒性评估的结果。这些结果显示了DRE在大肠癌体外模型中的潜在疗效。

ix)临床数据

一个患有难治的M5急性骨髓性白血病的70岁的老人报道单独DRE持续18个月就已达到持续的缓解。虽然他从他的急性单核细胞白血病得到完全的缓解，但他有继续患有慢性单核细胞骨髓白血病(CMML)的迹象。当他降低DRE的服用频率时，看到他的外周血单核细胞数在升高，同样地，当他增加DRE的服用量时，他的外周血单核细胞数得到控制。在两个患有慢性单核细胞骨髓白血病的女性中只使用DRE也观察到暂时的响应。

在服用这个产品的病人中报道了瞬态响应。一个患有难治的急性骨髓性白血病的病人开始同时服用DRE和羟基脲，对这个组合做出立即显著的响应。患有多样大皮肤结节的病人在24小时内得到缓解。这个病人维持这个响应一个月时间，尽管在24小时后停止服用羟基脲。他接受这个药非常良好，没有报道有毒性。

另一个病人服用DRE用于难治的霍奇金氏淋巴瘤。这个病人是40岁的女性，做了多种化学疗法和自体同源干细胞移植都失败了。这个病人做了环磷酰胺和依托泊苷形式共存的化学疗法。她从这个组合遭受了血细胞减少，在加DRE之前从这些药物遭受了血细胞减少。当加入DRE后，她在CT扫描中具有显著但临时的响应。她在服用这个产品三个月后获得进展，并且在这个进展之后发展为胰腺炎。

许多已经使用DRE用于包括大肠癌的各种恶性肿瘤的病人报道了非常良好的耐受性并且自我报告响应。另一个患有霍奇金氏淋巴瘤的病人报道，用DRE治疗有显著明显的响应。

可以加入对根部提取物功效不会产生损害的其它抗癌成分或药物到本发明的药物中。这种抗癌成分包括、但不限于：叶酸拮抗剂，5-氟嘧啶(包括5-氟尿嘧啶)，例如β-L-1,3-二氧环戊基胞苷、β-L-1,3-二氧环戊基5-氟胞嘧啶核苷的胞嘧啶核苷的类似物，抗代谢物(包括嘌呤拮抗物、阿糖胞苷、氟达拉滨、氟脲苷、6-硫基嘌呤、氨甲喋呤和6-硫鸟嘌呤)，羟基脲，有丝分裂抑制剂(包括CPT-11、依托泊苷(VP-21)、紫杉酚和例如长春新碱和长春花碱的长春花生物碱)，烷化剂(包括但不限于白消安、瘤可宁、环磷酰胺、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑和噻替派)，非典型烷化剂，含铂化合物，争光霉素，抗肿瘤抗生素，例如阿霉素和放线菌素D的蒽环霉素，蒽醌，拓扑异构酶Ⅱ型抑制剂，荷尔蒙剂(包括但不限于类固醇激素(地塞米松、强的松和甲泼尼松)，例如氟甲睾酮和甲基睾酮的雄激素)，例如己烯雌酚的雌激素，例如三苯氧胺的抗雌激素，例如亮丙瑞林的LHRH类似物，例如氟他胺、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮和甲羟孕酮的抗雄激素，天冬酰胺酶，卡莫司汀，洛莫司汀，六甲基-三聚氰胺，达卡巴嗪，米托坦，链脲菌素，顺铂，卡铂，左旋咪唑和亚叶酸。较佳地，该抗癌剂是二甲双胍、羟基脲、环磷酰胺或依托泊苷。本发明的化合物还可与例如干扰素、白介素、肿瘤细胞坏死因子、巨噬细胞集落刺激因子和集落刺激因子的酵素治疗剂和免疫系统调节剂结合使用。根部提取物可以通过任意合适途径给药给病人，适合途径例如包括口服、肠胃外给药、静脉注射、真皮内注射、经皮给药、黏膜给药、皮下注射和局部给药。

较佳地，根部提取物通过口服给药。大量的给药/剂量实验显示，本发明的药物如果通过口服可以产生更大的抗癌活性，并可能暴露于服用者的消化系统。根部提取物以粉末或液体提取物形式、而没有更多的修饰的口服给药。或者，根部提取物溶解在液体中，最佳地水中，包含提取物的液体可口服给药。为防止疏忽大意引入细菌或细菌感染，本发明的提取物可以煮沸成茶，且包含提取物的茶可口服用药。根部提取物还可以是封装成胶囊或压缩成片剂。这种胶囊或药片可以纯化以除去杂质和/或细菌，或者还可以包括惰性稀释剂、可食用的载体、粘结剂和/或辅助材料。

片剂、胶囊等等包含下列任意一种组分或类似性质的化合物：例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶的粘结剂；例如淀粉或乳糖的赋形剂；例如海藻酸、淀粉乙醇酸钠(Primogel)或玉米淀粉的崩解剂；例如硬脂酸镁或sterotes的润滑剂；例如胶状二氧化硅的助流剂；例如蔗糖或糖精的增甜剂；或者例如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精的增味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除上述材料，它还可以包括例如脂肪油的液体载体。除此之外，剂量单位形式可以包括其它各种修改剂量单位的物理形式的材料，例如糖衣、虫胶或其它肠内吸收剂。

需要注意的是，剂量随着环境、年龄、体重和患癌的严重性而变化。对于本领域技术人员很显而易见的是，对于每个病人，特定的剂量方案可以根据个人需要随时间调整。根部提取物可一次性给药，或分成多个更小剂量在各种时间间隔给药。

本发明的药物适合于治疗和/或预防癌症，包括皮肤组织、器官、骨头、软骨、血液和血管的癌症。根部提取物可用于治疗各种癌症，包括但不限于，头部、颈部、眼睛、口腔、咽喉、食管、胸部、骨头、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、乳腺、卵巢、肾脏、肝脏、胰腺和脑部的癌症。该癌症包括原发性和转移性癌症。

本发明的最佳实施例描述到此为止。最佳实施例仅仅作为举例而提供、所述举例并不意味着限制本发明的保护范围。对本领域技术人员显而易见的是，可以在本发明保护范围内，对所述最佳实施例进行变化和修饰。

Claims (39)

1.一种制备用于治疗或预防癌症的药物的方法，该方法包括：

冷冻蒲公英属植物根部，以获得冷冻的植物根，所述冷冻步骤至少产生部分破坏一个或多个根部细胞的效果；

干燥研磨所述冷冻植物根，以获得磨碎的根部粉末，其中在所述干燥研磨步骤中，冷冻的根的研磨温度维持在低于大约40℃；

将该磨碎的根部粉末浸泡在溶剂中，获得含有液体萃取部分和固体颗粒部分的悬浮液；以及

将所述液体萃取部分与所述固体颗粒部分进行分离，以提供使用在所述药剂中的分离的液体提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症是大肠癌、胰腺癌、血癌或皮肤癌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述癌症包括所述血癌或所述皮肤癌，并且选自由慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性单核细胞骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴癌和黑色素瘤组成的组。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述冷冻步骤之前，该方法还包括干燥所述植物根部至相对湿度在大约5%至大约10%之间。

5.根据权利要求1-4中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述蒲公英属植物根部包括在植物开花或发芽之前或在芽生长停止之后收获的处于休眠状态的蒲公英属植物根部。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述处于休眠状态的蒲公英属植物根部在所述的植物开花或发芽之前大约90天、较佳地大约30天内收获。

7.根据权利要求1-6中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述蒲公英属植物根部是来自于属于选自包括西洋蒲公英、红果蒲公英、朝鲜蒲公英、日本蒲公英、平滑蒲公英、红果蒲公英和加利福尼亚蒲公英的组的种的植物。

8.根据权利要求1-7中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述冷冻步骤包括将所述植物根部接触或浸没在液氮中，或者将所述植物根部冷冻至平均冷冻温度在大约-210℃至大约-30℃之间。

9.根据权利要求1-8中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述干燥研磨步骤包括干燥研磨所述冷冻的根至平均粒径小于大约100μm、较佳地小于大约50μm。

10.根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述干燥研磨步骤包括用选自由粉粹机、冲击式研磨机和微粉磨粉机组成的组的研磨机干燥研磨所述冷冻的根，其中将研磨机或它的部件冷却至低于大约-25℃，更佳地低于大约-50℃，以阻止热量接触到所述冷冻的根或磨碎的根部粉末。

11.根据权利要求1-10中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述溶剂包括水、正戊烷、环戊烷、环己烷、苯、甲苯、1,4-二氧己环、三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、碳酸丙烯酯、甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇和醋酸中的一种或多种。

12.根据权利要求1-11中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述浸泡步骤包括将所述磨碎的根部粉末浸泡在水中，浸泡温度在大约5℃至大约100℃浸泡在水中，较佳地浸泡大约5分钟至大约24小时，有或没有搅拌。

13.根据权利要求1-12中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括过滤和离心分离中的至少一种，其中所述过滤是进行一次或者使用多种相同或不同孔径的过滤器进行多次，所述离心分离是在5000×g至8000×g之间进行。

14.根据权利要求1-13中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括用具有第一孔径为大约0.45μm的第一过滤器和具有第二孔径为大约0.22μm的第二过滤器过滤所述悬浮液至少两次，其中所述第二过滤器是用于除菌。

15.根据权利要求1-14中的任意一项所述的方法，其特征在于，在所述干燥研磨步骤之前，该方法还包括将所述植物根部切片，形成多个根部切片。

16.根据权利要求1-15中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述研磨温度低于大约0℃。

17.根据权利要求1-16中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述研磨温度低于大约-25℃，较佳地低于大约-40℃。

18.根据权利要求1-17中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括冷冻干燥分离后的液体提取物，以获得提取物粉末，以及，可选地，将所述提取物粉末与药学上可接受的载体、稀释剂、粘结剂、辅助剂和抗癌剂中的一种或多种混合。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗癌剂是二甲双胍、羟基脲、环磷酰胺和依托泊苷中的一种或多种。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述药剂包括一种具有大约5mg/kg体重/天至大约1000mg/kg体重/天的范围内的所述提取物粉末的剂量，更佳地在大约10mg/kg体重/天至大约70mg/kg体重/天。

21.根据权利要求1-20中的任意一项所述的方法，所述药剂包括一日剂量，该日剂量是具有大约0.5g至大约70g、更佳地在大约1至4g的所述提取物粉末。

22.一种制备用于治疗或预防癌症的包括蒲公英属植物根部提取物的药物的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

（1）冷冻蒲公英属植物根部，以获得冷冻的植物根，所述冷冻步骤至少产生部分破坏至少一个根部细胞的效果，其中所述蒲公英植物根部包括在植物发芽或开花之前或在芽生长停止后采摘的处于休眠状态的蒲公英属植物根部；

（2）干燥研磨所述冷冻植物根，以获得平均粒径在小于大约100μm、较佳地小于大约50μm的磨碎的植物根部粉末，其中在所述干燥研磨步骤中，冷冻的根的研磨温度维持在低于大约40℃；

（3）将该磨碎的植物根部粉末浸泡在包括乙醇和水的其中一种或两种溶剂中，生成含有液体溶液部分和固体部分的混合物；

（4）将所述液体溶液部分与所述固体部分进行分离；以及

（5）冷冻干燥所述液体溶液部分，获得作为干燥的提取物粉末的蒲公英属植物根部提取物，并可选地，将该干燥的提取物部分与药学可接受的载体、稀释剂、粘合剂、辅助剂和抗癌剂中的一种或多种混合。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述癌症是大肠癌、胰腺癌、血癌或皮肤癌。

24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述癌症是慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性单核细胞骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴癌或黑色素瘤。

25.根据权利要求22-24中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述处于休眠状态的蒲公英属植物根部在第一季节性植物开花或发芽之前大约90天、较佳地大约30天内收获。

26.根据权利要求22-25中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述蒲公英属植物根部是来自于属于选自包括西洋蒲公英、红果蒲公英、朝鲜蒲公英、日本蒲公英、平滑蒲公英、红果蒲公英和加利福尼亚蒲公英的组的种的植物。

27.根据权利要求22-26中的任意一项所述的方法，其特征在于，在所述冷冻步骤之前，该方法还包括干燥所述植物根部至相对湿度低于大约10%。

28.根据权利要求22-27中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述冷冻步骤包括将所述植物根部接触或浸没在液氮中，冷冻至平均冷冻温度在大约-210℃至大约-30℃之间。

29.根据权利要求22-28中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述干燥研磨步骤包括用研磨机干燥研磨所述冷冻的根至平均粒径小于大约50μm，并且产生对一个或多个根部细胞有实质性破坏的效果，所述研磨机选自由粉粹机、冲击式研磨机和微粉磨粉机组成的组，其中所述干燥研磨步骤还包括将所述研磨机冷却至低于大约-25℃。

30.根据权利要求22-29中的任意一个所述的方法，其特征在于，所述溶剂还包括正戊烷、环戊烷、环己烷、苯、甲苯、1,4-二氧己环、三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、碳酸丙烯酯、甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、甲醇或醋酸。

31.根据权利要求22-30中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述浸泡步骤包括将所述磨碎的植物根部粉末以浸泡温度在大约5℃至大约100℃浸泡在溶剂中，较佳地浸泡大约5分钟至大约24小时，有或没有搅拌。

32.根据权利要求22-31中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括过滤和离心分离中的至少一种，其中所述过滤是进行一次或者使用多种相同或不同孔径的过滤器进行多次，所述离心分离是在5000×g至8000×g之间进行。

33.根据权利要求22-32中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括用具有第一孔径为大约0.45μm的第一过滤器和具有第二孔径为大约0.22μm的第二过滤器过滤所述混合物至少两次，其中所述第一和/或第二过滤器是用于除菌。

34.根据权利要求22-33中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述抗癌剂包括二甲双胍、羟基脲、环磷酰胺和依托泊苷中的一种或多种。

35.根据权利要求22-34中的任意一项所述的方法，其特征在于，在所述干燥研磨步骤之前，该方法还包括将所述蒲公英属植物根部切片，形成多个平均尺寸在大约0.2cm至1.5cm的根部切片。

36.根据权利要求22-35中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述研磨温度低于大约0℃。

37.根据权利要求22-36中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述研磨温度低于大约-25℃，较佳地低于大约-40℃。

38.根据权利要求22-37中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述药剂包括一种具有大约5mg/kg体重/天至大约1000mg/kg体重/天的范围内的所述蒲公英属植物根部提取物的剂量，更佳地在大约10mg/kg体重/天至大约70mg/kg体重/天。

39.根据权利要求22-37中的任意一项所述的方法，其特征在于，所述药剂包括一种日剂量，该日剂量是具有大约0.5g至大约70g、更佳地在大约1-4g的所述蒲公英属植物根部提取物。