CN105456444A - 一种治疗黑色素瘤的中药制剂及其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗黑色素瘤的中药制剂及其制备方法及应用，所述中药制剂由以下质量份的原料制成：蒲公英12～18份、白芍7～14份、香橼5～8份；水热提取蒲公英有效成分；醇热提取白芍有效成分；香橼洗净，入乙醇溶液浸泡，粉碎提取，药渣再用热水粉碎提取，合并得香橼提取液；将蒲公英有效成分、白芍有效成分及香橼提取液混合，减压浓缩，喷雾干燥，制成颗粒剂。本发明以清热解毒、消肿散结、利尿通淋的蒲公英为主药，以平肝止痛、养血调经、敛阴止汗的白芍和舒肝理气、宽中、化痰的香橼为辅药，各味药材相互协同，共奏清热解毒、消肿散结、舒肝、理气、养血的功效，对于黑色素瘤的治疗可以显著抑制黑色素瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡。

Description

一种治疗黑色素瘤的中药制剂及其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体是一种治疗黑色素瘤的中药制剂及其制备方法及应用。
背景技术
恶性黑素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤。皮肤黑素瘤表现为色素性皮损在数月或数年中发生明显改变。虽其发病率低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高，因此早期诊断、早期治疗很重要。恶性黑素瘤大多发生于成人，巨大性先天性色素痣继发癌变的病例多见于儿童。
皮肤恶性黑素瘤的临床症状，包括出血、瘙痒、压痛、溃疡等，一般来讲，黑素瘤的症状与发病年龄相关，年轻患者一般表现为瘙痒、皮损的颜色变化和界限扩大，老年患者一般表现为皮损出现溃疡，通常提示预后不良。皮肤恶性黑素瘤的皮损表现与解剖部位及肿瘤的生长方式相关，即与组织学类型相关，组织学类型又因年龄、型别、种族的不同而有很大差异。不同类型的黑素瘤具有不同的病因和遗传学背景，目前黑素瘤的临床组织学分型采用Clark分型，包括四型：恶性雀斑痣样黑素瘤(LMM)；浅表扩散性黑素瘤；肢端雀斑样黑素瘤/黏膜黑素瘤；结节性黑素瘤(NM)。在患恶性黑素瘤的白种人中，约70％为SSM。但在所有恶性黑素瘤的亚洲人中，发生于较少日光照射部位的ALM占72％。
目前临床对于黑色素瘤的治疗方法包括传统治疗、基因治疗和生物治疗。传统治疗是最为多见的黑色素瘤的治疗方式，包括早期手术切除和中晚期手术切除后辅以化疗和放疗。有专家报道对部分切除后有残存病变的黑色素瘤行放射治疗，结果表明黑色素瘤对放射有阻抗性。有专家也证实与单独化疗对比，化疗联合免疫疗法可提高疗效，不过仍提示放射疗法可作为黑色素瘤术后的主要治疗手段。
香橼为芸香科植物枸橼或香圆(西南香圆)的干燥成熟果实，性温，味辛、苦、酸，归肝、脾、肺经，具有舒肝理气、宽中、化痰的功效。用于肝胃气滞，胸胁胀痛，脘腹痞满，呕吐噫气，痰多咳嗽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有清热解毒、消肿散结、舒肝、理气、养血功效的治疗黑色素瘤的中药制剂及其制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种治疗黑色素瘤的中药制剂，由以下质量份的原料制成：蒲公英12～18份、白芍7～14份、香橼5～8份。
作为本发明进一步的方案：由以下质量份的原料制成：蒲公英14～17份、白芍9～12份、香橼5～7份。
作为本发明进一步的方案：由以下质量份的原料制成：蒲公英16份、白芍10份、香橼6份。
所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蒲公英洗净，加入8～10倍量的蒸馏水，浸泡2～3小时后，武火煮沸，文火煎煮3～4小时，过滤得第一次提取液和第一次药渣；往第一次药渣中再次加入6～8倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮2～3小时，过滤得第二次提取液和第二次药渣；最后，往第二次药渣中加入4～6倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮1～2小时，过滤得第三次提取液和第三次药渣，将第三次药渣丢弃；合并三次提取液，过滤得滤液，将所得滤液浓缩成60℃下相对密度为1.15～1.16的稠膏，即为蒲公英有效成分，备用；
(2)将白芍洗净，浸入4～5倍量的体积浓度为75～80％的乙醇溶液浸泡1～2小时，加热提取3小时，回收乙醇，过滤得滤液，将所得滤液浓缩为65℃下相对密度为1.12～1.14的稠膏，即为白芍有效成分，备用；
(3)将香橼洗净，浸入6～8倍量的体积浓度为65～75％的乙醇溶液中，浸泡1～2小时后，粉碎提取3次，10min/次，提取后的药渣再用8～10倍量的热水粉碎提取3次，10min/次，两次提取物合并得到香橼提取液；
(4)将步骤(1)制得的蒲公英有效成分、步骤(2)制得的白芍有效成分以及步骤(3)制得的香橼提取液混合，然后在真空度0.06～0.08MPa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.08～1.10的膏体，经喷雾干燥成粉状，最后按照常规制剂工艺制成颗粒剂，即得所述的治疗黑色素瘤的中药制剂。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(4)中，喷雾干燥采用的喷雾干燥机的进风温度为165～172℃、出风温度为82～83℃。
所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的使用方法为：每日两次，早、晚各一次，每次服用相当于20g生药量的剂量，1个月为一个疗程，连续服用2～3个疗程起效。
所述的中药制剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以清热解毒、消肿散结、利尿通淋的蒲公英为主药，以平肝止痛、养血调经、敛阴止汗的白芍和舒肝理气、宽中、化痰的香橼为辅药，各味药材相互协同，共奏清热解毒、消肿散结、舒肝、理气、养血的功效，对于黑色素瘤的治疗可以显著抑制黑色素瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡，且本发明为纯中药制剂，无明显的不良及毒副作用，适宜开发成黑色素瘤治疗药物。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种治疗黑色素瘤的中药制剂，由以下质量份的原料制成：蒲公英12份、白芍14份、香橼5份。
所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蒲公英洗净，加入8倍量的蒸馏水，浸泡3小时后，武火煮沸，文火煎煮3小时，过滤得第一次提取液和第一次药渣；往第一次药渣中再次加入6倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮2小时，过滤得第二次提取液和第二次药渣；最后，往第二次药渣中加入4倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮1小时，过滤得第三次提取液和第三次药渣，将第三次药渣丢弃；合并三次提取液，过滤得滤液，将所得滤液浓缩成60℃下相对密度为1.16的稠膏，即为蒲公英有效成分，备用；
(2)将白芍洗净，浸入4倍量的体积浓度为80％的乙醇溶液浸泡1小时，加热提取3小时，回收乙醇，过滤得滤液，将所得滤液浓缩为65℃下相对密度为1.14的稠膏，即为白芍有效成分，备用；
(3)将香橼洗净，浸入6倍量的体积浓度为75％的乙醇溶液中，浸泡1小时后，粉碎提取3次，10min/次，提取后的药渣再用8倍量的热水粉碎提取3次，10min/次，两次提取物合并得到香橼提取液；
(4)将步骤(1)制得的蒲公英有效成分、步骤(2)制得的白芍有效成分以及步骤(3)制得的香橼提取液混合，然后在真空度0.06Pa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.10的膏体，经进风温度为165℃、出风温度为82℃的喷雾干燥剂喷雾干燥成粉状，最后按照常规制剂工艺制成颗粒剂，即得所述的治疗黑色素瘤的中药制剂。
实施例2
本发明实施例中，一种治疗黑色素瘤的中药制剂，由以下质量份的原料制成：蒲公英18份、白芍7份、香橼8份。
所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蒲公英洗净，加入8倍量的蒸馏水，浸泡3小时后，武火煮沸，文火煎煮3小时，过滤得第一次提取液和第一次药渣；往第一次药渣中再次加入6倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮2小时，过滤得第二次提取液和第二次药渣；最后，往第二次药渣中加入4倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮1小时，过滤得第三次提取液和第三次药渣，将第三次药渣丢弃；合并三次提取液，过滤得滤液，将所得滤液浓缩成60℃下相对密度为1.16的稠膏，即为蒲公英有效成分，备用；
(2)将白芍洗净，浸入4倍量的体积浓度为80％的乙醇溶液浸泡1小时，加热提取3小时，回收乙醇，过滤得滤液，将所得滤液浓缩为65℃下相对密度为1.14的稠膏，即为白芍有效成分，备用；
(3)将香橼洗净，浸入6倍量的体积浓度为75％的乙醇溶液中，浸泡1小时后，粉碎提取3次，10min/次，提取后的药渣再用8倍量的热水粉碎提取3次，10min/次，两次提取物合并得到香橼提取液；
(4)将步骤(1)制得的蒲公英有效成分、步骤(2)制得的白芍有效成分以及步骤(3)制得的香橼提取液混合，然后在真空度0.06Pa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.10的膏体，经进风温度为165℃、出风温度为82℃的喷雾干燥剂喷雾干燥成粉状，最后按照常规制剂工艺制成颗粒剂，即得所述的治疗黑色素瘤的中药制剂。
实施例3
本发明实施例中，一种治疗黑色素瘤的中药制剂，由以下质量份的原料制成：蒲公英14份、白芍12份、香橼5份。
所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蒲公英洗净，加入10倍量的蒸馏水，浸泡2小时后，武火煮沸，文火煎煮4小时，过滤得第一次提取液和第一次药渣；往第一次药渣中再次加入8倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮3小时，过滤得第二次提取液和第二次药渣；最后，往第二次药渣中加入6倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮2小时，过滤得第三次提取液和第三次药渣，将第三次药渣丢弃；合并三次提取液，过滤得滤液，将所得滤液浓缩成60℃下相对密度为1.15的稠膏，即为蒲公英有效成分，备用；
(2)将白芍洗净，浸入5倍量的体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡2小时，加热提取3小时，回收乙醇，过滤得滤液，将所得滤液浓缩为65℃下相对密度为1.12的稠膏，即为白芍有效成分，备用；
(3)将香橼洗净，浸入8倍量的体积浓度为65％的乙醇溶液中，浸泡2小时后，粉碎提取3次，10min/次，提取后的药渣再用10倍量的热水粉碎提取3次，10min/次，两次提取物合并得到香橼提取液；
(4)将步骤(1)制得的蒲公英有效成分、步骤(2)制得的白芍有效成分以及步骤(3)制得的香橼提取液混合，然后在真空度0.08MPa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.08的膏体，经进风温度为172℃、出风温度为83℃的喷雾干燥剂喷雾干燥成粉状，最后按照常规制剂工艺制成颗粒剂，即得所述的治疗黑色素瘤的中药制剂。
实施例4
本发明实施例中，一种治疗黑色素瘤的中药制剂，由以下质量份的原料制成：蒲公英17份、白芍9份、香橼7份。
所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蒲公英洗净，加入10倍量的蒸馏水，浸泡2小时后，武火煮沸，文火煎煮4小时，过滤得第一次提取液和第一次药渣；往第一次药渣中再次加入8倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮3小时，过滤得第二次提取液和第二次药渣；最后，往第二次药渣中加入6倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮2小时，过滤得第三次提取液和第三次药渣，将第三次药渣丢弃；合并三次提取液，过滤得滤液，将所得滤液浓缩成60℃下相对密度为1.15的稠膏，即为蒲公英有效成分，备用；
(2)将白芍洗净，浸入5倍量的体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡2小时，加热提取3小时，回收乙醇，过滤得滤液，将所得滤液浓缩为65℃下相对密度为1.12的稠膏，即为白芍有效成分，备用；
(3)将香橼洗净，浸入8倍量的体积浓度为65％的乙醇溶液中，浸泡2小时后，粉碎提取3次，10min/次，提取后的药渣再用10倍量的热水粉碎提取3次，10min/次，两次提取物合并得到香橼提取液；
(4)将步骤(1)制得的蒲公英有效成分、步骤(2)制得的白芍有效成分以及步骤(3)制得的香橼提取液混合，然后在真空度0.08MPa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.08的膏体，经进风温度为172℃、出风温度为83℃的喷雾干燥剂喷雾干燥成粉状，最后按照常规制剂工艺制成颗粒剂，即得所述的治疗黑色素瘤的中药制剂。
实施例5
本发明实施例中，一种治疗黑色素瘤的中药制剂，由以下质量份的原料制成：蒲公英16份、白芍10份、香橼6份。
所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蒲公英洗净，加入10倍量的蒸馏水，浸泡3小时后，武火煮沸，文火煎煮4小时，过滤得第一次提取液和第一次药渣；往第一次药渣中再次加入8倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮3小时，过滤得第二次提取液和第二次药渣；最后，往第二次药渣中加入6倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮2小时，过滤得第三次提取液和第三次药渣，将第三次药渣丢弃；合并三次提取液，过滤得滤液，将所得滤液浓缩成60℃下相对密度为1.16的稠膏，即为蒲公英有效成分，备用；
(2)将白芍洗净，浸入5倍量的体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡2小时，加热提取3小时，回收乙醇，过滤得滤液，将所得滤液浓缩为65℃下相对密度为1.14的稠膏，即为白芍有效成分，备用；
(3)将香橼洗净，浸入8倍量的体积浓度为65％的乙醇溶液中，浸泡2小时后，粉碎提取3次，10min/次，提取后的药渣再用10倍量的热水粉碎提取3次，10min/次，两次提取物合并得到香橼提取液；
(4)将步骤(1)制得的蒲公英有效成分、步骤(2)制得的白芍有效成分以及步骤(3)制得的香橼提取液混合，然后在真空度0.06MPa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.10的膏体，经进风温度为172℃、出风温度为82℃的喷雾干燥剂喷雾干燥成粉状，最后按照常规制剂工艺制成颗粒剂，即得所述的治疗黑色素瘤的中药制剂。
对比例1
一种治疗黑色素瘤的中药制剂，仅含有蒲公英和白芍，其余与实施例5完全相同。
对比例2
一种治疗黑色素瘤的中药制剂，仅含有香橼，其余与实施例5完全相同。
本发明中药制剂的动物急性毒性试验
对本发明中药制剂进行动物急性毒性试验，取小鼠和大鼠各140只，分为七组，分别口服给予相当于20g生药量的实施例1～5、对比例1～2制备的中药制剂/kg(该剂量为人服用剂量的20倍以上)，每天一次，持续服用一周。给药后观察两周，没有小鼠和大鼠死亡，说明本发明中药制剂的毒性甚微。
以下为本发明中药制剂治疗黑色素瘤的临床研究资料
本发明中药制剂对黑色素瘤细胞株的抑制作用
1、细胞株的选取：
小鼠黑色素瘤细胞株(B16)，购自中国科学院上海细胞库。
人黑色素瘤细胞株(A375、A875和SK-MEL-2)购自ATCC。
上述细胞株用含有10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、CO2体积分数为5％、完全饱和湿度条件下常规培养，每48小时更换一次培养基，细胞生长达饱合状态时，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化传代，2～3天传代1次，实验选用对数生长期细胞。
2、细胞增殖的检测：
分别调整B16、A375、A875和SK-MEL-2细胞株细胞悬液浓度为1×105/ml，加入96孔培养板内，每孔100μL，置37℃、CO2体积分数为5％的孵箱内培养24h。吸除旧培养基，分别加入含本发明实施例1～5以及对比例1～2制得的中药制剂(药物浓度为100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、5mg/ml)的无血清DMEM培养基，并设空白对照组和调零组，每组均设3复孔，继续培养24h。加入10μLWST～8溶液，培养2h。在490nm处检测各孔的吸光值。细胞增殖抑制率＝[1-(加药组OD平均值-调零孔OD平均值)/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值)]×100％。每个实验进行3次以上的重复实验，以确保实验的准确性。
3、细胞凋亡的检测
分别调整B16、A375、A875和SK-MEL-2细胞株细胞悬液浓度为1×106/ml，加入96孔培养板内，每孔100μL。待细胞生长达融合状态后，吸除旧培养基，分别加入含本发明实施例1～5以及对比例1～2制得的中药制剂(药物浓度为100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、5mg/ml)的无血清DMEM培养基，并设空白对照组，空白对照组加含0.1％DMSO的培养基，药物作用24h后，将细胞上清吸至离心管内，细胞经胰酶消化后，移至与细胞上清相同的离心管内，在4℃温度下以1000rpm的转速离心5min，弃上清，用PBS洗1遍，弃上清，用Bindingbuffer洗1遍，并以19.5μLBindingbuffer重悬，0.5μLAnnexinV～FITC混匀后室温避光孵育10分钟，用Bindingbuffer洗1遍，并以19μLBindingbuffer重悬，加1μLPI混匀后流式细胞仪上机检测。
4、实验结果
表1本发明中药制剂对四种黑色素瘤细胞株细胞增殖影响的检测结果
利用WST～8法对各组的细胞增殖与毒性进行检测，得到本发明中药制剂对四种黑色素瘤细胞株细胞增殖的影响结果如表1所示，结果显示：与对比例1～2相比，本发明实施例1～5制得的中药制剂体外对四种黑色素瘤细胞株(B16、A375、A875和SK-MEL-2)细胞增殖均显示了较强的抑制作用，以25～100mg/ml浓度最为显著；在药物浓度为100mg/ml的培养基中，实施例5制得的中药制剂对B16细胞、A375细胞、A875细胞和SK-MEL-2细胞的抑制率分别达到了81.1％、97.0％、97.9％和88.9％。
表2本发明中药制剂对四种黑色素瘤细胞株细胞凋亡影响的检测结果
采用AnnexinV和PI双染流式细胞术检测，得到本发明中药制剂对四种黑色素瘤细胞株细胞凋亡的影响结果如表2所示，结果显示：与对比例1～2相比，本发明实施例1～5制得的中药制剂对四种黑色素瘤细胞株(B16、A375、A875和SK-MEL-2)细胞凋亡均显示了较强的诱导细胞凋亡作用，以50～100mg/ml浓度最为显著；在药物浓度为50～100mg/ml的培养基中，实施例5制得的中药制剂对B16细胞、A375细胞、A875细胞和SK-MEL-2细胞的凋亡率分别达到了79.0％、93.0％、92.4％和81.7％，从而本发明中药制剂对人黑色素瘤细胞株A375、A875均显示了较强的诱导细胞凋亡作用，适宜开发成黑色素瘤治疗药物。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，由以下质量份的原料制成：蒲公英12～18份、白芍7～14份、香橼5～8份。
2.根据权利要求1所述的治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，由以下质量份的原料制成：蒲公英14～17份、白芍9～12份、香橼5～7份。
3.根据权利要求1所述的治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，由以下质量份的原料制成：蒲公英16份、白芍10份、香橼6份。
4.根据权利要求1～3任一所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将蒲公英洗净，加入8～10倍量的蒸馏水，浸泡2～3小时后，武火煮沸，文火煎煮3～4小时，过滤得第一次提取液和第一次药渣；往第一次药渣中再次加入6～8倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮2～3小时，过滤得第二次提取液和第二次药渣；最后，往第二次药渣中加入4～6倍量的蒸馏水，武火煮沸，文火煎煮1～2小时，过滤得第三次提取液和第三次药渣，将第三次药渣丢弃；合并三次提取液，过滤得滤液，将所得滤液浓缩成60℃下相对密度为1.15～1.16的稠膏，即为蒲公英有效成分，备用；
（2）将白芍洗净，浸入4～5倍量的体积浓度为75～80%的乙醇溶液浸泡1～2小时，加热提取3小时，回收乙醇，过滤得滤液，将所得滤液浓缩为65℃下相对密度为1.12～1.14的稠膏，即为白芍有效成分，备用；
（3）将香橼洗净，浸入6～8倍量的体积浓度为65～75%的乙醇溶液中，浸泡1～2小时后，粉碎提取3次，10min/次，提取后的药渣再用8～10倍量的热水粉碎提取3次，10min/次，两次提取物合并得到香橼提取液；
（4）将步骤（1）制得的蒲公英有效成分、步骤（2）制得的白芍有效成分以及步骤（3）制得的香橼提取液混合，然后在真空度0.06～0.08MPa下减压浓缩至50℃时相对密度为1.08～1.10的膏体，经喷雾干燥成粉状，最后按照常规制剂工艺制成颗粒剂，即得所述的治疗黑色素瘤的中药制剂。
5.根据权利要求4所述的治疗黑色素瘤的中药制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，喷雾干燥采用的喷雾干燥机的进风温度为165～172℃、出风温度为82～83℃。
6.如权利要求1～3任一所述的中药制剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
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