CN113520945A - 蒲公英根提取物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蒲公英根提取物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。蒲公英根提取物的制备方法包括如下步骤：新鲜蒲公英根经榨汁，收集榨汁液，制得蒲公英根提取物；榨汁的过程中不添加溶剂，榨汁的温度为50～60℃，榨汁的时间为10～15min。本发明制得的蒲公英根提取物的制备工艺简单，具有快速补水保湿、修复皮肤屏障、抗炎、抗氧化和美白等功效，且安全性佳，对皮肤温和不刺激；在制备过程中不添加任何外来溶剂，大大提高了使用安全性；采用其制得的精华液和舒缓水也同样具有上述功效，效果理想，可被广泛应用于皮肤外用剂领域。

Description

蒲公英根提取物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，尤其涉及一种蒲公英根提取物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着生活节奏的加快，人们所处的环境极易导致皮肤氧化应激和炎症等反应，最终加快皮肤衰老。因此开发绿色、天然、安全的植物原料已经成为化妆品领域研究热点。
蒲公英味苦、甘、性寒、归肝、胃二经，具有清热解毒、消肿、和胃、疏通气机之功效。赋有“天然抗生素”的美称，蒲公英富含各类维生素及矿物质，如钾、镁、铁、钙、铜等，还含有多种活性成分，如蒲公英甾醇、生物碱类、有机酸类化合物及黄酮类化合物等，报道其具有抗肿瘤、降血糖、降血脂等药理功效。
因此，基于药食同源的蒲公英活性成分开发的护肤品，不仅能够满足消费者对化妆品功效性和安全性的双重要求，而且符合现代化妆品行业绿色环保、天然安全的发展趋势，具有广阔的应用前景。目前，制备蒲公英根提取物时，普遍采用有机溶剂回流提取的工艺，该工艺有效活性成分损耗大，能耗高，且引入对肌肤有刺激作用的有机溶剂，例如，乙醇或甲醇等。
因此，如何从众多植物提取工艺中筛选出一种制备工艺简单，有效活性成分损失小，可应用于皮肤外用剂领域，使用安全，对敏感肌肤温和不刺激，并具有理想多重美容功效的蒲公英根提取物是本领域亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中蒲公英根提取物在制备过程中引入对肌肤有刺激作用的有机溶剂，有效活性成分损耗高，能耗高等缺陷，而提供一种蒲公英根提取物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。本发明蒲公英根提取物和皮肤外用剂的制备工艺简单，制备过程中不引入外来有机溶剂，制得的产品安全，对皮肤温和不刺激，且具有理想的快速补水保湿、修复皮肤屏障、抗炎、抗氧化和美白等功效，可被广泛应用于皮肤外用剂领域。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
本发明提供一种蒲公英根提取物的制备方法，具体包括如下步骤：新鲜蒲公英根经榨汁，收集榨汁液，制得所述蒲公英根提取物；所述榨汁的过程中不添加溶剂，所述榨汁的温度为50～60℃，所述榨汁的时间为10～15min。
本发明中，所述新鲜蒲公英根可为本领域技术人员常规认为的未经干燥处理的蒲公英根，较佳地为新鲜山东菏泽蒲公英根。
本发明中，所述新鲜蒲公英根在使用前还可进一步包括水洗的操作。
本发明中，所述榨汁的温度较佳地为55～60℃。
本发明中，所述榨汁的时间较佳地为10～13min。
本发明中，所述收集的条件和方法可为本领域常规，一般可包括过滤和/或离心。
其中，所述过滤的条件和方法可为本领域常规，一般可去除大部分残渣即可，例如采用纱布过滤。
其中，所述离心的转速可为本领域该类操作常规的转速，一般可使所述榨汁后的固体和液体有效分离即可，一般可为3000～10000r/min，较佳地为3000～8000r/min，更佳地为4000～6000r/min，进一步更佳地为5000～5500r/min。
其中，所述离心的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为15～30min，更佳地为15～20min。
本发明中，所述收集的操作后还可进一步包括脱色除味、过滤和除菌中任意一种或多种的操作。
其中，所述脱色除味的条件和方法可为本领域常规，一般包括如下步骤：与脱色除味剂混合，静置吸附，除所述脱色除味剂，即可。
所述脱色除味过程中，所述脱色除味剂可为本领域常规使用的脱色除味剂，一般可包括活性炭、膨润土和硅藻土中的一种或多种，较佳地为活性炭。
所述脱色除味过程中，所述脱色除味剂与所述榨汁液的质量体积比可为本领域常规，较佳地为5～20g/L，更佳地为6～15g/L，进一步更佳地为10～15g/L。
所述脱色除味过程中，所述静置吸附的时间可为本领域该类操作常规的时间，一般达到吸附平衡即可，较佳地为12～48h，更佳地为24～48h。
所述脱色除味过程中，除所述脱色除味剂的条件和方法可为本领域常规，一般可包括离心。其中，所述离心的转速可为4000～8000r/min，较佳地为5000～5800r/min，例如5500r/min。所述离心的时间可为20～35min，较佳地为25～30min。
其中，所述过滤的目的为进一步去除所述榨汁液中的固体杂质，提高所述榨汁液的澄清度。
所述过滤的条件和方法可为本领域常规，一般可为采用支撑板、精滤板和澄清板中任意一种或多种进行所述过滤，较佳地为依次采用支撑板和精滤板进行所述过滤。所述支撑板的厚度可为本领域常规，一般可为3.3～4mm，较佳地为3.3～3.7mm，更佳地为3.5～3.7mm。所述支撑板的孔径可为本领域常规，一般可为35～60μm，较佳地为35～40μm。所述精滤板的孔径可为本领域常规，一般可为0.3～1μm，较佳地为0.3～0.45μm。
其中，所述除菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为滤膜过滤法。所述滤膜的孔径大小可为本领域常规，较佳地为0.22～0.45μm。
本发明还提供一种蒲公英根提取物，其由如上所述的蒲公英根提取物的制备方法制得。
本发明还提供一种如上所述的蒲公英根提取物在皮肤外用剂中的应用，所述蒲公英根提取物可作为所述皮肤外用剂中的保湿活性成分、修复皮肤屏障活性成分、舒缓活性成分、抗氧化活性成分和美白活性成分中的任意一种或多种。
本发明中，所述修复皮肤屏障活性成分可为具有降低水分散失作用的修复皮肤屏障活性成分。
本发明中，所述舒缓活性成分可为具有抗炎作用的舒缓活性成分。
本发明中，所述抗氧化活性成分可为具有清除DPPH自由基作用的抗氧化活性成分。
本发明中，所述美白活性成分可为具有抑制黑色素生成和/或抑制络氨酸酶活性作用的美白活性成分。
本发明还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的蒲公英根提取物。
本发明中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括且不限于面膜、精华液、爽肤水或舒缓水。
本发明中，所述蒲公英根提取物占所述皮肤外用剂的质量百分比可为30％～100％，较佳地为66％～99％，更佳地为80％～97.8％。
本发明中，按照本领域常规，所述皮肤外用剂中还可进一步包括保湿剂、稳定剂、表面活性剂、脂肪酸和粘度调节剂中的任意一种或多种，较佳地包括保湿剂。
其中，所述保湿剂可为本领域常规使用的保湿剂，较佳地包括丙二醇、甘油、高分子透明质酸钠、透明质酸钠和低分子透明质酸钠中任意一种或多种；所述高分子透明质酸钠的数均分子量可为大于180万；所述透明质酸钠的数均分子量可为100～180万；所述低分子透明质酸钠的数均分子量可为20～40万。
其中，当所述皮肤外用剂中含有所述保湿剂时，所述保湿剂占所述皮肤外用剂的质量百分比可为0.1％～5％，较佳地为2.2％～5％。
本发明一较佳实施方案中，当所述皮肤外用剂为舒缓水时，所述皮肤外用剂可包括1份所述蒲公英根提取物和0～3份所述水，较佳地包括1份所述蒲公英根提取物和0～0.5份所述水。
本发明另一较佳实施方案中，当所述皮肤外用剂为精华液时，所述皮肤外用剂包括如下重量份数的各组分：90～98份所述蒲公英根提取物和1～6份所述保湿活性成分。
本发明一更佳实施方案中，当所述皮肤外用剂为精华液时，所述皮肤外用剂包括如下重量份数的各组分：90～98份所述蒲公英根提取物、1～5份甘油、0.01～0.1份高分子透明质酸钠、0.01～0.1份透明质酸钠和0.01～0.1份低分子透明质酸钠，更佳地，所述皮肤外用剂包括如下重量份数的各组分：97.8份所述蒲公英根提取物、2份所述甘油、0.1份所述高分子透明质酸钠、0.05份所述透明质酸钠和0.05份所述低分子透明质酸钠。
其中，所述精华液的制备方法可为本领域常规，一般包括如下步骤：步骤(1)：所述高分子透明质酸钠、所述透明质酸钠和所述低分子透明质酸钠分别与所述蒲公英根提取物混合，分别制得混合液A、混合液B和混合液C；步骤(2)：将所述混合液A、所述混合液B和所述混合液C混合，再与所述甘油混合，即可。步骤(1)中，所述混合可按照本领域常规在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速可为600～800r/min，较佳地为750～800r/min。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明采用药食同源的新鲜蒲公英根为植物原料，经过简单的提取工艺，将新鲜蒲公英根中的活性成分提取出来，制得一种具有快速补水保湿、修复皮肤屏障、抗炎、抗氧化和美白等功效，且安全性佳，对皮肤温和不刺激的蒲公英根提取物。在制备过程中不添加任何外来溶剂(例如，乙醇等提取剂)，大大提高了使用安全性。采用其制得的精华液和舒缓水也同样具有上述功效，效果理想，可被广泛应用于皮肤外用剂领域。
附图说明
本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：
图1为采用本发明实施例1、对比例1、对比例2和对比例4制得的产品分别处理敏感肌肤后，敏感肌肤水合率随时间变化试验结果对比图；
图2为采用本发明实施例2和对比例3制得的产品分别处理敏感肌肤后，敏感肌肤水合率随时间变化试验结果对比图；
图3为采用本发明实施例1、对比例1、对比例2和对比例4制得产品分别处理敏感肌肤后，敏感肌肤经皮失水率随时间变化试验结果对比图；
图4为采用本发明实施例2和对比例3制得产品分别处理敏感肌肤后，敏感肌肤经皮失水率随时间变化试验结果对比图；
图5为采用本发明实施例1、对比例1制得产品、空白对照组、模型组和阳性对照组分别处理HaCat细胞后，HaCat细胞IL-6炎症因子释放水平对比图；
图6为采用不同浓度本发明实施例1制得产品分别处理HaCat细胞后细胞存活率变化图；
图7为采用本发明实施例1、对比例1～2制得的产品分别处理B16细胞后，对黑色素产生抑制率的对比图；
图8为采用本发明实施例1、对比例1～2制得的产品分别处理B16细胞后对络氨酸酶活性抑制率的对比图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中新鲜蒲公英根采摘于山东菏泽。
下述实施例中，数均分子量大于180万的高分子透明质酸钠、数均分子量为100-180万的透明质酸钠、数均分子量为20-40万的低分子透明质酸钠和甘油均采购于山东焦点福瑞达生物股份有限公司。
下述实施例中，活性炭的生产厂家为平顶山市绿之原活性炭有限公司(食品级制糖工业氨基酸糖液焦糖经脱色、除胶质、提纯、精制得木质粉状活性炭)。
下述效果实施例中，HaCaT细胞和B16细胞购自中科院干细胞库，其培养基为DMEM培养基。
下述效果实施例中，采用的酶联免疫检测仪购自Thermo Fisher Scientific OY公司，型号为1510-00662C；均质机购自IKA公司，型号为T25；医用离心机购自无锡市瑞江分析仪器有限公司；榨汁机为荣升食品机械有限公司生产的大型工业破壁制浆机。
实施例1蒲公英根提取物的制备
1、原料处理
将新鲜蒲公英根洗净，空干表面水分，备用；
2、将新鲜蒲公英根转移到榨汁机中，在不加溶剂，温度为55℃的条件下榨汁10min，用纱布过滤去除大部分残渣，再转移到离心机中，在5500r/min条件下离心15min，取上清液，即榨汁液；
3、在250mL的锥形瓶中装入200mL步骤2制得的榨汁液，加入3g活性炭静置吸附24h，脱色除味后转移到离心机中，在转速为5500r/min的条件下离心25min，去除活性炭；依次用厚度为3.5mm，孔径为35μm的支撑板和孔径为0.45μm的精滤板过滤，再用孔径为0.22μm的滤膜进行除菌处理，得到蒲公英根提取物。
实施例2蒲公英根精华液的制备
蒲公英根精华液的原料种类和重量份数见表1。将高分子透明质酸钠、透明质酸钠和低分子透明质酸钠分别与等量的蒲公英根提取物混合，用JJ-1A数显测速电动搅拌器在搅拌转速为750r/min条件下搅拌至完全溶解，然后混合三种混合液，均质，最后加入甘油搅拌均匀，制得蒲公英根精华液。
表1
原料 重量份数(份)
实施例1制得的蒲公英根提取物 97.8
高分子透明质酸钠，>180W 0.1
透明质酸钠，100-180W 0.05
低分子透明质酸钠，20-40W 0.05
甘油 2
实施例3蒲公英根舒缓水
(1)以新鲜蒲公英根为原料，采用实施例1的方法制得蒲公英根提取物；
(2)用水对步骤(1)制得的蒲公英根提取物进行稀释，新鲜蒲公英根与水的质量比为2：1。
对比例1
与实施例1相比区别仅在于步骤2为将新鲜蒲公英根和水转移到榨汁机中浸泡1h，新鲜蒲公英根和水的质量比为2：1，在温度为55℃的条件下榨汁10min，用纱布过滤去除大部分残渣，再转移到离心机中，在5500r/min条件下离心15min，取上清液，即榨汁液；其他步骤同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于步骤2中榨汁温度为35℃，其他条件参数同实施例1。
对比例3
与实施例2相比，区别仅在于将蒲公英根提取物替换为等量的纯净水，其他条件参数同实施例2。
对比例4
与实施例1相比，区别仅在于步骤2中榨汁时间为20min，其他条件参数同实施例1。
对比例5
与实施例1相比，区别仅在于步骤2中榨汁的温度为70℃。测试发现该对比例制得的蒲公英根提取物与实施例1制得的蒲公英根提取物相比，在体外自由基清除能力以及抑制炎症因子表达方面效果较差。
效果实施例1
规范性引用《化妆品安全技术规范》2015年版，探究蒲公英根提取物的即时补水和修复皮肤屏障作用，筛选出10名敏感肌肤的志愿者，在温度为22±2℃，湿度为40％～60％的环境中，测试实施例1～2、对比例1～4制得产品对志愿者的即时补水和修复皮肤屏障效果。
其中，测试方法如下：
清洁皮肤20min后，测定脸颊本底值，脸颊分别喷实施例1～2或对比例1～4制得的产品，轻轻按摩至吸收，使用MPA580(德国CK公司)多探头仪器分别在5min、20min、60min下测定脸颊的皮肤水分含量和皮肤经皮水分散失量，再利用下述公式计算皮肤水合率(结果见表2和图1～2)和皮肤失水率(结果见表2和图3～4)；
水合率＝(Tn-T0)/T0×100％；其中，Tn表示不同时间下测得皮肤水分含量的实际值；T0表示皮肤水分含量的本底值；水合率越高补水效果越明显；
失水率＝(T’n—T’0)/T’0×100％，其中，T’n为不同时间下测得皮肤经皮水分散失量的实际值，T’0为皮肤经皮水分散失量的本底值；失水率越低锁水效果越好，修复皮肤屏障功能越好；
表2
Figure BDA0003188492430000081
Figure BDA0003188492430000091
从表2数据结果可看出，与实施例1相比，使用对比例1、对比例2和对比例4的产品处理人体皮肤后，水合率效果不如实施例1，且人体皮肤的失水率均高于实施例1，因此，可以认为本发明制得的蒲公英根提取物具有很好的补水效果和修护皮肤屏障功效。对比例3与实施例2相比，水合率较低且失水率较高，说明本发明制得的蒲公英根精华液与高分子透明质酸钠、低分子透明质酸钠、透明质酸钠和甘油复配对人体皮肤的补水和修护皮肤屏障效果远强于单独使用高分子透明质酸钠、低分子透明质酸钠、透明质酸钠和甘油。
效果实施例2
取对数期HaCat细胞(人类永生化表皮细胞)，以2×106个/mL的密度将细胞悬浊液接种于6孔细胞培养板上，每孔加入1mL细胞悬液，孵箱培养24h，小心吸去上清；
空白组和模型组分别加入1mL DMEM溶液；实施例1组加入1mL含有实施例1制得的蒲公英根提取物的DMEM溶液，即加入实施例1制得的蒲公英根提取物原液经DMEM稀释10倍后的溶液；阳性对照组加入1mL含地塞米松(50μg/mL)的DMEM溶液；对比例1组中加入1mL对比例1制得的产品经DMEM稀释10倍后的溶液；
加入后继续培养6h，模型组、实施例1组、阳性对照组和对比例1组各孔均采用紫外光(UVA)照射，光照功率为9J/cm2，照射时间1.5h，空白对照组不光照。光照后继续培养24h，每组样品重复3个平行，每个平行样品检测3次。处理细胞，收集细胞裂解液，具体为破碎细胞，在10000r/min，4℃条件下离心10min，取上清，得到细胞裂解上清液。取20μL细胞裂解液用BCA试剂盒检测样品中的总蛋白含量；
测试空白对照组、模型组、阳性对照组、实施例1组和对比例1组IL-6炎症因子释放水平；
测试方法：IL-6炎症因子的测定按照ELISA试剂盒说明书进行实验操作后，于450nm处测定各OD值，根据OD值，计算IL-6炎症因子释放水平，IL-6炎症因子的释放量需要BCA含量校正，通过下述公式计算得到IL-6炎症因子的相对表达量，结果见表3和图5；
IL-6炎症因子相对表达量＝实验组炎症因子的表达量/空白对照组炎症因子的表达量。
表3
空白对照组 模型组 阳性对照组 实施例1 对比例1
IL-6 1 3.31 1.20 0.93 1.40
结果表明，与空白对照组相比模型组中IL-6的表达量显著增加，经50μg/mL的地塞米松、实施例1待测液和对比例1待测液处理细胞处理后，细胞中IL-6的表达量显著降低，且实施例1制得的蒲公英根提取物的抑制作用最强，说明实施例1制备得到的蒲公英根提取物具有很好的抗炎效果。
从上述数据可看出，本发明实施例1制备得到的蒲公英根提取物具有很好的抗炎效果，有望成为舒缓类产品的一种天然原料。
效果实施例3 DPPH自由基清除能力
分别对实施例1和对比例1制得的蒲公英根提取物进行稀释，配置成不同浓度的待测液；
A1管：取3mL上述实施例1待测液(或对比例1待测液)和3mL浓度为2×10-4mol/L的DPPH溶液，混匀；
A2管：取3mL水和3mL浓度为2×10-4mol/L的DPPH溶液，混匀；
A3管：取3mL无水乙醇和3mL上述实施例1待测液(或对比例1待测液)，混匀；
上述A1管、A2管和A3管中混匀后，反应30min，利用酶联免疫检测仪在517nm波长处检测吸光度，结果分别记为A1、A2和A3，利用下述公式计算上述实施例1待测液(或对比例1待测液)的DPPH自由基清除率；利用SPSS软件对上述测试得到的数据进行分析，计算得IC50，即对DPPH自由基清除率达到50％时，实施例1待测液(或对比例1待测液)中蒲公英根提取物的质量百分比，结果见表4。
DPPH自由基清除率＝[(A1+A3)-A1]/A2×100％；
表4
编号 DPPH自由基清除率IC<sub>50</sub>
实施例1 38.02％
对比例1 45.19％
从表4数据可知，与对比例1相比，本发明实施例1制得的蒲公英根提取物具有更理想的DPPH自由基清除能力。
效果实施例4
取实施例1制得的蒲公英根提取物，分别采用无血清的DMEM培养液将其稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍和108倍，得待测液。
实验组和空白对照组加细胞，计数Hacat细胞(人类永生化表皮细胞)，稀释细胞，最终加入96孔培养板中的细胞密度为1×104个/孔，在37℃，5％CO2环境下培养过夜，吸弃旧培养基，实验组中分别添加上述制得的不同浓度待测液，空白对照组添加DMEM培养基，添加后培养24h；培养后用MTT法检测培养后Hacat细胞的活性，结果见表5和图6，具体为弃旧培养基，用PBS洗板，向PBS洗后的板中添加MTT溶液，每孔加入100μL的MTT溶液(1g/L)，放入细胞培养箱中孵育4h；弃MTT溶液后每孔加入150μL的DMSO，培养箱中放置10min，采用infinite M200 PRO荧光酶标仪测定各孔OD490值，每组设置5个副孔，取平均值。设置空白孔，空白孔指培养板中不进行任何操作，只添加等量DMSO。
Hacat细胞存活率(％)＝(样品孔OD值-空白孔OD值)/(空白对照组OD值-空白孔OD值)×100％。
表5
Figure BDA0003188492430000111
Figure BDA0003188492430000121
Hacat细胞毒性检测结果可看出，不同浓度实施例1制得的蒲公英根提取物处理细胞后，细胞活力均在70％以上，说明本发明制得的蒲公英根提取物对Hacat细胞无明显毒性，且低浓度的蒲公英根提取物对Hacat细胞的生长还具有良好的促进作用。
效果实施例5
取对数生长期状态良好的B16细胞计数并接种于6孔板中，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养过夜；弃掉旧培养基，用含浓度为50μg/mL组胺的无血清培养基将实施例1、对比例1和对比例2制得的蒲公英根提取物分别稀释10倍，制得实验组待测液，每个样品做五个平行，(每个平行样品检测一次结果)，空白模型组只加培养基，组胺刺激组加50μg/mL组胺的无血清培养基，阳性对照组加入1mg/mL的α熊果苷溶液，培养48h后吸弃旧培养基；使用PBS洗涤后加入250μL胰酶消化4min，加入1mL含血清培养液终止消化，1500rmp离心3min，吸弃上清液，加入0.5mL含10％DMSO的1M氢氧化钠溶液，超声分散3min，取20μL上述溶液测定BCA试剂盒，剩余溶液80℃水浴30min；振荡混匀，10000rmp离心2min，吸取上清液200μL至96孔板于405nm读取吸光度值。设置空白孔，即指培养板中不进行任何操作，只添加等量10％DMSO的1M氢氧化钠溶液。
黑色素抑制率＝1-(实验组OD值-空白孔OD值)/(组胺刺激组OD值-空白孔OD值)×100％，每一组成分重复5个样本，计算结果取平均值，结果见表6和图7，黑色素含量需要BCA含量校正。
表6
Figure BDA0003188492430000122
Figure BDA0003188492430000131
结果表明，本发明实施例1制得的蒲公英根提取物对黑色素的生成具有理想的抑制作用，且效果明显优于对比例1和对比例2。
效果实施例6
取对数生长期状态良好的B16细胞计数并接种于6孔培养板中，在37℃，5％CO2环境下培养过夜；弃掉培养基，用含浓度为50μg/mL组胺的无血清培养基分别稀释实施例1、对比例1和对比例2制得的蒲公英根提取物，制得实验组待测液，蒲公英根提取物占实验组待测液的质量百分比为10％，每个样品做五个平行，(每个平行样品检测一次结果)，空白模型组只加培养基，组胺刺激组加50μg/mL组胺的无血清培养基，阳性对照组为加入1mg/mL的α熊果苷溶液，培养48h后吸弃培养基，使用PBS洗涤后加入250μL胰酶消化4min，加入1mL培养液终止消化，1500rmp离心3min，吸弃上清液，加入300μL的1％TritonX-100震荡超声5min，取20μL上述溶液测定BCA试剂盒，取200μL剩余溶液至0.5mL EP管中，37℃预温5min，再加入200μL的0.25％左旋多巴溶液，37℃孵育1小时后于490nm读取吸光度值。设置空白孔，即指培养板中不进行任何操作，只添加等量的0.25％左旋多巴溶液。
酪氨酸酶抑制率＝1-(实验组OD值-空白孔OD值)/(组胺刺激组OD值-空白孔OD值)×100％，每一组成分重复5个样本，计算结果取平均值，结果见表7和图8，酪氨酸酶含量需要BCA含量校正。
表7
酪氨酸酶抑制率(％)
对照组 -1.09101
组胺刺激组 0
阳性对照组(α熊果苷) 3.033171
实施例1 39.57272
对比例1 13.7247
对比例2 9.522551
结果表明，本发明实施例1制得的蒲公英根提取物对络氨酸酶的活性具有理想的抑制作用，且效果明显优于对比例1～2和阳性对照组。可见，本发明实施例1制得的蒲公英根提取物具有理想的美白功效。
效果实施例7
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1制得的产品进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象：
严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、实验方法
分别将0.02mL上述实施例1制得的产品滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。样品均设置空白对照，即在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应，接着于24h后观察皮肤的反应。体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表8。
表8 皮肤不良反应分级标准
Figure BDA0003188492430000141
3、试验结果
结果参见表9，从表中可以看出；本发明实施例1制得的蒲公英根提取物试敏结果都是阴性反应，说明本发明制得的蒲公英根提取物具有安全性，不会给人体带来不良反应。
表9
Figure BDA0003188492430000151
最后，还需要说明的是，在本发明中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种蒲公英根提取物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：新鲜蒲公英根经榨汁，收集榨汁液，制得所述蒲公英根提取物；所述榨汁的过程中不添加溶剂，所述榨汁的温度为50～60℃，所述榨汁的时间为10～15min。
2.如权利要求1所述的蒲公英根提取物的制备方法，其特征在于，所述榨汁的温度为55～60℃；
和/或，所述榨汁的时间为10～13min；
和/或，所述收集的方法包括过滤和/或离心；所述离心的转速较佳地为3000～10000r/min，更佳地为3000～8000r/min，进一步更佳地为4000～6000r/min，再进一步更佳地为5000～5500r/min；所述离心的时间较佳地为15～30min，更佳地为15～20min。
3.如权利要求1或2所述的蒲公英根提取物的制备方法，其特征在于，所述收集的操作后还进一步包括脱色除味、过滤和除菌中任意一种或多种的操作。
4.如权利要求3所述的蒲公英根提取物的制备方法，其特征在于，所述脱色除味的方法包括如下步骤：与脱色除味剂混合，静置吸附，除所述脱色除味剂，即可；
和/或，所述过滤为采用支撑板、精滤板和澄清板中任意一种或多种进行所述过滤，较佳地为依次采用支撑板和精滤板进行所述过滤；
和/或，所述除菌的方法为滤膜过滤法。
5.如权利要求4所述的蒲公英根提取物的制备方法，其特征在于，所述脱色除味的过程中，所述脱色除味剂包括活性炭、滑石粉和硅藻土中的任意一种或多种，较佳地为活性炭；
和/或，所述脱色除味过程中，所述脱色除味剂与所述榨汁液的质量体积比为5～20g/L，较佳地为6～15g/L，更佳地为10～15g/L；
和/或，所述脱色除味的过程中，所述静置吸附的时间为12～48h，较佳地为24～48h；
和/或，所述脱色除味的过程中，除所述脱色除味剂的方法包括离心；较佳地，所述离心的转速为4000～8000r/min，更佳地为5000～5800r/min；较佳地，所述离心的时间为20～35min，更佳地为25～30min；
和/或，所述过滤的过程中，所述支撑板的厚度为3.3～4mm，较佳地为3.3～3.7mm，更佳地为3.5～3.7mm；
和/或，所述过滤的过程中，所述支撑板的孔径为35～60μm，较佳地为35～40μm；
和/或，所述过滤的过程中，所述精滤板的孔径为0.3～1μm，较佳地为0.3～0.45μm；
和/或，所述除菌的过程中，所述滤膜的孔径大小为0.22～0.45μm。
6.一种蒲公英根提取物，其特征在于，其由如权利要求1～5中任意一项所述的蒲公英根提取物的制备方法制得。
7.一种如权利要求6所述的蒲公英根提取物在皮肤外用剂中的应用，其特征在于，所述蒲公英根提取物作为所述皮肤外用剂中的保湿活性成分、修复皮肤屏障活性成分、舒缓活性成分、抗氧化活性成分和美白活性成分中的任意一种或多种；
较佳地，所述修复皮肤屏障活性成分为具有降低水分散失作用的修复皮肤屏障活性成分；
较佳地，所述舒缓活性成分为具有抗炎作用的舒缓活性成分；
较佳地，所述抗氧化活性成分为具有清除DPPH自由基作用的抗氧化活性成分；
较佳地，所述美白活性成分为具有抑制黑色素生成和/或抑制络氨酸酶活性作用的美白活性成分。
8.一种皮肤外用剂，其特征在于，其包括如权利要求6所述的蒲公英根提取物；
较佳地，所述皮肤外用剂包括面膜、精华液、爽肤水或舒缓水；
较佳地，所述蒲公英根提取物占所述皮肤外用剂的质量百分比为30％～100％，更佳地为66％～99％，进一步更佳地为80％～97.8％；
较佳地，所述皮肤外用剂中还进一步包括保湿剂、稳定剂、表面活性剂、脂肪酸和粘度调节剂中的任意一种或多种，更佳地包括保湿剂。
9.如权利要求8所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述保湿剂包括丙二醇、甘油、高分子透明质酸钠、透明质酸钠和低分子透明质酸钠中任意一种或多种；
和/或，当所述皮肤外用剂中含有所述保湿剂时，所述保湿剂占所述皮肤外用剂的质量百分比为0.1％～5％，较佳地为2.2％～5％；
和/或，当所述皮肤外用剂为舒缓水时，所述皮肤外用剂包括1份所述蒲公英根提取物和0～3份所述水，较佳地包括1份所述蒲公英根提取物和0～0.5份所述水；
和/或，当所述皮肤外用剂为精华液时，所述皮肤外用剂包括如下重量份数的各组分：90～98份所述蒲公英根提取物和1～6份所述保湿活性成分；较佳地，当所述皮肤外用剂为精华液时，所述皮肤外用剂包括如下重量份数的各组分：90～98份所述蒲公英根提取物、1～5份甘油、0.01～0.1份高分子透明质酸钠、0.01～0.1份透明质酸钠和0.01～0.1份低分子透明质酸钠，更佳地，所述皮肤外用剂包括如下重量份数的各组分：97.8份所述蒲公英根提取物、2份所述甘油、0.1份所述高分子透明质酸钠、0.05份所述透明质酸钠和0.05份所述低分子透明质酸钠。
10.如权利要求9所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述精华液的制备方法包括如下步骤：步骤(1)：所述高分子透明质酸钠、所述透明质酸钠和所述低分子透明质酸钠分别与所述芍药根提取物混合，分别制得混合液A、混合液B和混合液C；步骤(2)：将所述混合液A、所述混合液B和所述混合液C混合，再与所述甘油混合，即可；较佳地，步骤(1)中，所述混合在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速为600～800r/min，更佳地为750～800r/min。
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