CN104193673A - 一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针 - Google Patents

一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针 Download PDF

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Abstract

一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针，为4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸，其化学结构式为；所述以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针可利用顺磁荧光双功能探针与人体泛素蛋白质的连接产物，用于核磁共振的荧光光谱和顺磁标记。本发明的优点是：该顺磁荧光双功能探针可与蛋白质的特定位点进行选择性连接，而且连接具有一定刚性，只有一套顺磁信号峰，而且在激发光照射下可发出明显的金属离子（Eu3+和Tb3+）的特征荧光；该探针的刚性可以从核磁共振来衡量，并应用到荧光光谱和电子自旋共振中。

Description

一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针
技术领域
 本发明属于生物学研究中高性能探针，特别是一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针。
背景技术
蛋白质的分子结构是其生物功能的基础，因此，研究蛋白质的分子结构和动态变化将有助于我们更深入的了解蛋白质如何行使其功能。X射线晶体衍射和高 分辨核磁共振是目前获得高分辨率蛋白质结构的两种主要技术手段，而相对于X射线晶体衍射，核磁共振、荧光光谱和电子自旋共振在研究蛋白质动态学方面具有非常重要的作用。另外，核磁共振可以在溶液中研究生物大分子的空间结构和功能之间的关系，并且测定条件更加接近生理条件，可不破坏生物大分子的结构，得到的结果更加接近实际。
蛋白质的化学修饰提供了研究其功能和动态变化的新技术，这种技术可以广泛应用到核磁共振、电子顺磁共振和荧光光谱的研究中，借助小分子基团及其金属配合物的磁学性质和光谱特性，可以获得大分子蛋白质的动态行为、结构变化和作用机制。但是化学修饰蛋白质需要强调位点单一并且刚性的问题是目前顺磁技术和荧光能量共振转移研究中亟需解决的问题，另外蛋白质-探针链接的稳定性也是研究中的关键问题。
生物大分子与顺磁探针定点连接以后，由于顺磁效应，顺磁中心附近的氨基酸残基的化学环境会产生较大的变化，导致其核磁共振谱峰的化学位移产生明显变化。人们就可以借助采集PCS、PRE或RDC等顺磁数据来研究生物大分子的结构、功能以及生物大分子之间的相互作用，参见：J. Biomol. NMR, 2010, 46: 101-112。
Nguyen等人，参见Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 692–694，将非天然氨基酸类化合物，如图1中化合物L-1，引入NS2B-NS3蛋白酶中，分别取代NS3中的Q86， H87和 K88，他们发现只有在H87BpyAla突变体中滴加Co2+，才有明显的PCS，Q86BpyAla，K88BpyAla突变体滴加Co2+只有PRE，这说明在这两个位点，顺磁标签的柔性比较大。但由于L-1只能和过渡金属离子配位，而在过渡金属离子中也只有Co2+等少数金属离子才能测得明显的PCS，可得数据较少，所以在一定程度上限制了L-1的应用。
Stephan Grzesiek等人，参见J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14761–14767，报道了镧系金属离子螯合探针DOTA-M8，由于其骨架及臂上都增加了手性诱导基团，克服了如图1中化合物L-2等DOTA类似物骨架和臂的震动，参见Inorg. Chem. 2003, 42, 2342?2349，使其与镧系金属离子的螯合物具有单一构象，从而使DOTA-M8成为一个有效的通过顺磁标记来研究生物分子的结构与功能的探针。
Su等人，参见Chem. Eur. J.  2013, 19, 1097-1103，报道了化合物4VPyMTA，即图1中化合物L-3，它的体积小，与镧系金属离子有很强的结合能力，并且与镧系金属离子结合后具有单一的构象，能够与蛋白表面选择性连接，而且连接后的产物非常稳定，可在原位分析蛋白的结构。
利用荧光探针与生物分子相互作用前后光谱信号的变化，人们可以在不破坏生物分子结构与功能的条件下对生物分子的结构和生物过程进行定性及定量的研究。因此，荧光测定术作为一种目前发展比较成熟的技术，其在生物体系研究领域也有着很好的应用前景。虽然传统的有机荧光探针具有合成简单，荧光量子产率较高和易于进入细胞等优点，却因为它们水溶性差、Stokes位移较小、荧光寿命短以及容易被荧光背景干扰等缺陷限制了它们在生物体系中的应用。而镧系荧光探针具有水溶性好、Stokes位移大、荧光寿命长以及谱峰窄等诸多优势，因而可以排除生理环境中荧光背景的干扰，提高测定分析灵敏度，从而弥补了传统有机荧光探针的不足。
Barbara Imperiali等人，参见J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 7346-7352，报道了一种可用来研究蛋白质-蛋白质相互作用的含有15-20个天然氨基酸并结合有金属离子Tb(Ⅲ)的多肽探针。借助荧光共振能量转移等手段，他们通过应用此探针来监测SH2区域和不同磷酸肽之间的相互作用以及测量蛋白质-多肽的离解常数。但此探针的合成需借助固相合成的手段，合成难度较大。
Tetsuo Nagano等人，参见J. Am. Chem. Soc. 2006,128, 6938-6946，报道了一系列镧系荧光探针，如图1中化合物Ln-1-Ln-12，这些探针具有较长的荧光寿命，利用时间分辨荧光实验，可通过观测探针与亮氨酸氨基肽酶（LAP）反应前后荧光的变化来研究亮氨酸氨基肽酶的活性。
顺磁荧光双功能探针是指特定的有机配体，它可与顺磁金属离子形成特定的螯合物，其中镧系金属离子起到顺磁中心的作用，在探针与生物大分子连接后，顺磁中心可对其附近的生物大分子的残基产生影响，使这些残基的化学位移值发生较大的变化，而且在激发光的照射下，双功能探针可产生顺磁金属离子的特征发射峰。
在将顺磁荧光双功能探针应用于生物体系中时，镧系金属离子螯合物在激发光的照射下可发射出镧系金属离子特征的荧光谱峰，而且可同时提供顺磁中心，那些靠近顺磁中心的氨基酸残基可产生较大的PCS。由于生物体系中没有天然的镧系金属离子的结合位点，所以即使有过量镧系金属离子的存在，也不会产生明显的顺磁效应和荧光噪音。因此，顺磁荧光双功能探针在研究生物大分子的结构和功能的过程中，兼有顺磁探针和荧光探针的优点，可获得更全面的数据。
Saha等人，参见Helv. Chim. Acta., 1993, 76, 1361-1378、Mukkala等人，参见J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 11032-11033、Takalo等人，参见Helv. Chim. Acta., 1997,80, 372-387和Nicolas Maindron等人，参见Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 2357–2370分别报道了如图1中的荧光标签L-4、L-5、L-6和L-7，它们的镧系金属离子（Eu3+）螯合物均有较好的荧光特性，可有效的对蛋白质或多肽进荧光行研究。但这些标签有一个共同的特点，就是它们与蛋白质或多肽的连接有较大的柔性，不适合作为蛋白质或多肽顺磁研究的标签。
Su等人，参见Chem. Eur. J.  2013, 19, 17141 – 17149，报道了图1中的化合物L-8，它与镧系金属离子有较强的结合能力，可与蛋白定点连接，且连接后，只有一套顺磁峰，而且可以得到大的PCS和RDC值，并且在340nm的激发下可以发出明显的Tb3+的特征荧光。他们运用顺磁荧光双功能探针来解析蛋白质的生物结构与功能，能够同时得到顺磁数据和荧光数据，在研究蛋白质的结构与功能的过程中，比单一功能的探针具有更加明显的优势。
为了将顺磁荧光双功能标签引入蛋白中，一般是将此标签设计为具有双功能团的小分子化合物，一端能够螯合顺磁金属离子，另一端可与蛋白质连接。合适的连接方式与螯合基团在探针发挥其作用的过程中非常重要，因此，在设计顺磁荧光双功能探针的过程中，必须综合考虑以下几个方面：
1）与镧系金属离子有较强的结合能力。最好具有较高的齿合度，从而阻止水分子参与配位，阻止发生由配体到溶剂的无辐射能量转移所导致的荧光淬灭；
2）能够与蛋白的特定位点选择性连接，而且连接要有一定的刚性。如果连接刚性不强，标签会相对蛋白进行运动，造成PCS和RDC的平均化；
3）具有单一的构象。如果存在多种构象，核磁谱图中会出现多套信号峰，对核磁谱图的分析带来困难；
4）具有较长的激发波长和较高的荧光量子产率。较低的激发波长容易对生物样品造成损伤。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针及其制备方法，该顺磁荧光双功能探针可与蛋白质的特定位点进行选择性连接，而且连接具有一定刚性，只有一套顺磁信号峰，而且在激发光照射下可发出明显的金属离子（Eu3+和Tb3+）的特征荧光；该探针的刚性可以从核磁共振来衡量，并应用到荧光光谱和电子自旋共振中。
本发明的技术方案：
一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针，为4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸，其化学结构式为
。
 
一种所述以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针的制备方法，步骤如下：
1）吡啶-2,6-二甲酸二乙酯的合成
将吡啶-2,6-二甲酸和SOCl2混合，回流3-12h，蒸出SOCl2，然后在冰浴下滴加无水乙醇，室温搅拌8h后浓缩至干，在残余物中加入水，然后在冰浴下用碳酸钾中和，用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥,经过滤、旋干，得土黄色晶状固体吡啶-2,6-二甲酸二乙酯；
2）1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮的合成
将氢化钠和四氢呋喃混合后，氩气保护下，升温至40-50℃，然后滴加吡啶-2,6-二甲酸二乙酯、丙酮和四氢呋喃的混合液，反应2-8h，冷却至室温，倒入冰水中，6M盐酸溶液调pH至7，然后浓缩至体积的3/5，冰水冷却并趁冷过滤，将滤饼干燥，得橘红色固体1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮；
3）4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯的合成
将1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮、乙酸铵和无水乙醇混合，回流2-10h，冷却至室温，浓缩至干，将残余物加入水清洗，过滤后将残余物溶于二氯甲烷，有机相分别用水，0.5 M的稀盐酸和饱和食盐水清洗，有机相用无水硫酸钠干燥，经过滤、旋干、柱分离，得黄色固体粉末4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯； 
4）4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯的合成
将4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、五溴化磷和DMF混合，氩气保护下，40-80℃反应6-12h，冷却至室温后蒸出DMF，在残余物中加入水后用饱和碳酸氢钠中和，用氯仿萃取后合并有机相，有机相分别用水和饱和食盐水清洗，然后用无水硫酸钠干燥，经过滤、旋干、柱分离，得白色固体粉末状4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯； 
5）4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇的合成
将4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、四氢呋喃和无水乙醇混合，然后加入硼氢化钠，室温下反应15-30h，加水使反应淬灭，旋出有机溶剂浓缩，过滤后将滤饼用红外干燥，得到白色固体粉末状4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇； 
6）4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶的合成
将4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇和氯仿混合，搅拌下滴加三溴化磷，回流2-8h，用饱和碳酸氢钠溶液中和后用二氯甲烷萃取，合并有机层，有机层分别用水和饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，得白色固体粉末状4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶；
7）4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯的合成
将4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶、无水碳酸钾、碘化钾、亚氨基二乙酸二乙酯和无水乙腈混合，回流2-8h后浓缩至干，加入水，然后用二氯甲烷萃取，有机相分别用水和饱和食盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，经过滤、旋干，得淡黄色油状物，静置后变为淡黄色固体4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯； 
8）4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯的合成
将4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、苯亚磺酸钠、碘化亚铜、喹啉和NMP混合，氩气保护下，100-140℃反应5-12h，冷却至室温后加入水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相分别用水和饱和食盐水清洗有机层，再用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干、柱分离，得淡黄色油状物4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯； 
9）4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸的合成
将4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、氢氧化钠、THF和水混合，室温下反应2-8h，用浓度为4 M的盐酸溶液调pH至2~3，浓缩后过滤，用水清洗滤饼后用红外干燥，得到白色固体粉末状目标物4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸。
所述步骤1）中吡啶-2,6-二甲酸、SOCl2、无水乙醇与水的用量比为1g:4.2mL：5mL：5mL；
步骤2）中氢化钠与四氢呋喃的用量比为1g:20mL，吡啶-2,6-二甲酸二乙酯、丙酮与四氢呋喃的用量比为6.6g:1mL:22mL；
步骤3）中1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮、乙酸铵、无水乙醇、水与二氯甲烷的用量比为1g:1.3g：18mL：25ml：37.5mL；
步骤4）中4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、五溴化磷、DMF与水的用量比为1g: 3g：23mL：30mL；
步骤5）中4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、四氢呋喃、无水乙醇、硼氢化钠与水的用量比为1g:50mL：12mL：0.4g：15mL；
步骤6）中的4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇、三溴化磷和氯仿的用量比为1g:1mL：37.5mL；
步骤7）中4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶、无水碳酸钾、碘化钾、亚氨基二乙酸二乙酯、无水乙腈与水的用量比为1g:1.2g:0.5g：0.8mL：50mL：50mL；
步骤8）中4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、苯亚磺酸钠、碘化亚铜、喹啉、NMP与水的用量比为1g:0.35g:0.023g:0.02mL:16.7mL：150mL；
步骤9）中4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、氢氧化钠、THF与水的用量比为1g:0.41g:80mL:80mL。
一种所述以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针的应用，利用顺磁荧光双功能探针与人体泛素蛋白质的连接产物，用于核磁共振的荧光光谱和顺磁标记，所述顺磁荧光双功能探针与人体泛素蛋白质的连接方法如下：
1）配制10 mM的4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸标签溶液；
2）采集人体泛素蛋白质 G47C在三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液pH=8.0时的1H-15N HSQC谱图作为空白对照；
3）在人体泛素蛋白质 G47C中加1.0倍量的三(2-羧基乙基)膦（TCEP）；
4）将人体泛素蛋白质 G47C加入5倍量的4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸中，此时pH为8.0；
5）通过采集混合物在不同时刻的1H-15N HSQC谱图来监测反应，直至反应完全；
6）反应完全后，通过PD10脱盐柱分离产物，将剩余的标签和新生成的小分子出去，最后得到人体泛素蛋白质 G47C与4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸的连接产物。
本发明的优点是：该顺磁荧光双功能探针可与蛋白质的特定位点进行选择性连接，而且连接具有一定刚性，只有一套顺磁信号峰，而且在激发光照射下可发出明显的金属离子（Eu3+和Tb3+）的特征荧光；该探针的刚性可以从核磁共振来衡量，并应用到荧光光谱和电子自旋共振中。
附图说明
图1为已报道的顺磁和荧光探针的合成。
图2为所述顺磁荧光双功能探针的合成路线。
图3为蛋白质与顺磁荧光双功能探针的连接方式。
图4为0.1 mM 人体泛素蛋白质 G47C与0.1 mM 人体泛素蛋白质 G47C-T1复合物在25℃，pH=6.4的20 mM的MES缓冲液中的1H-15N HSQC重叠谱图。
图5为不同金属离子Eu3+含量时人体泛素蛋白质 G47C-T1-Eu3+复合物在pH=7.6的20 mM的Tris缓冲液中的时间分辨荧光发射谱图。
图6为不同金属离子Tb3+含量时人体泛素蛋白质 G47C-T1-Tb3+复合物在pH=7.6的20 mM的Tris缓冲液中的时间分辨荧光发射谱图。
具体实施方式
实施例：
一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针，为4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸，其化学结构式为
。
 
所述以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针的制备方法，如图2所示，步骤如下：
1）吡啶-2,6-二甲酸二乙酯的合成，即图2中化合物2
将60g（359.02mmol）吡啶-2,6-二甲酸和250mL (3446.54mmol) SOCl2加入1000mL圆底瓶中混合，回流8h，蒸出SOCl2，然后在冰浴下滴加300mL（5140.76mmol）无水乙醇，室温搅拌8小时后浓缩至干，在残余物中加入300mL水清洗，然后在冰浴下用碳酸钾调pH至7，然后用150mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用200mL饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥,经过滤、旋干，得66g（295.66 mmol）土黄色晶状固体吡啶-2,6-二甲酸二乙酯, 产率82.35%；
2）1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮的合成，即图2中化合物3
将5.6g（60%，140.00 mmol）氢化钠和140mL四氢呋喃加入500mL三口瓶中，在氩气保护下升温至45℃，然后滴加30g （134.39 mmol）吡啶-2,6-二甲酸二乙酯、4.52mL（62.26 mmol）丙酮和100mL四氢呋喃的混合液并在2h内滴完，反应6h，冷却至室温，倒入300mL冰水中，用6M盐酸溶液调pH至7，然后浓缩至体积的3/5，冰水冷却并趁冷过滤，滤饼用冷水洗涤后红外干燥，得21g（50.92 mmol）橘红色固体1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮，产率81.79%；1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：14.63（2H，s），8.21（4H，t，J=7.12 Hz，6.04 Hz），8.06-7.96（2H，m），7.01（2H，s），4.55（4H，q，J=7.18 Hz），1.51（6H，t，J=7.26 Hz）；
3）4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯的合成，即图2中化合物4
将4.0g 9.70 mmol1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮、5.2g（67.96 mmol）乙酸铵和70mL无水乙醇加入250ml三口瓶中混合，回流6h冷却至室温，浓缩至干，在残余物中加入100mL水清洗，过滤后将残余物溶于150mL二氯甲烷，有机相分别用40mL 0.5 M的稀盐酸和40mL饱和食盐水清洗，用无水硫酸钠干燥，经过滤、旋干、柱分离，得1.65g（4.20 mmol）黄色固体粉末4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯，产率43.24%；1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：12.07（1H，s），8.27（2H，d，J=7.12 Hz），8.17-8.06（4H，m），7.17（2H，s），4.16（4H，q，J=7.12 Hz），1.51（6H，t，7.12 Hz）。13C-NMR（100MHz,CDCl3）δ ppm：181.6，164.3，149.1，148.3，143.9，138.8，126.1，123.2，114.7，62.2，14.3； 
4）4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯的合成，即图2中化合物5
将1.7g（4.32 mmol）4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、5g（11.61 mmol）五溴化磷和40mL DMF加入100ml三口瓶中混合，氩气保护、60℃下反应10h，冷却至室温后蒸出DMF，在残余物中加入50mL水后用饱和碳酸氢钠调至中性，用40mL氯仿萃取三次后合并有机相，有机相分别用水和饱和食盐水清洗，并用无水硫酸钠干燥，经过滤、旋干、柱分离，得1.73g（3.79 mmol）白色固体粉末状4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯，产率87.74%；1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：8.83（2H，s），8.80（2H，d，J=7.92 Hz），8.21（2H，d，J=7.60 Hz），8.05（2H，t，J=7.80 Hz），4.56（4H，q，J=7.12 Hz），1.53（6H，t，J=7.12 Hz）。13C-NMR（100MHz,CDCl3）δ ppm：165.2，155.6，155.0，148.0，138.0，135.4，125.5，125.2，124.4，62.1，14.4；
5）4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇的合成，即图2中化合物6
将6.6g（14.75 mmol）4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、350mL四氢呋喃和80mL无水乙醇加入1000mL圆底瓶中混合，然后加入2.64g（69.71 mmol）硼氢化钠，室温下反应24h，加入100mL水使反应淬灭，旋出有机溶剂浓缩，过滤后将滤饼用红外干燥，得到5.32g（14.29 mmol）白色固体粉末状4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇，产率98.81%；1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：8.66（2H，s），8.53（2H，d，J=7.72 Hz），7.90（2H，t，J=7.84 Hz），7.34（2H，d，J=7.48 Hz），4.90（4H，s），3.84（2H，s）。13C-NMR（100MHz,CDCl3）δ ppm：131.7，124.2，121.1，120.1，64.1；
6）4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶的合成，即图2中化合物7
将0.8g（1.61 mmol）4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇和30mL氯仿加入100mL三口瓶中混合，搅拌下滴加0.7mL（7.37 mmol）PBr3，回流7h，用饱和碳酸氢钠溶液中和后分别用30mL二氯甲烷萃取三次，合并有机层，有机层分别用30mL水清洗两次和30mL饱和食盐水清洗一次，然后用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，得0.82g（1.15 mmol）白色固体粉末状4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶，产率76.61%；1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：8.73（2H，s），8.53（2H，d，J=7.84 Hz），7.90（2H，t，J=7.76 Hz），7.55（2H，d，J=7.72 Hz），4.69（4H，s）。13C-NMR（100MHz,CDCl3）δ ppm：155.4，155.0，153.5，137.0，134.0，123.5，123.0，119.5，32.9；
7）4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯的合成，即图2中化合物8
将0.4g（0.80 mmol）4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶、0.48g（3.47 mmol）无水碳酸钾、0.2g（1.20mmol）碘化钾、0.310ml亚氨基二乙酸二乙酯和20mL无水乙腈加入100mL三口瓶中混合，回流6h，TLC监测至反应原料反应完毕，将体系旋干，在残余物中加入20mL水，然后分别用20mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相分别用20mL水清洗两次和20mL饱和食盐水清洗一次，用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，得淡黄色油状物，静置后得到0.56g（0.78 mmol）淡黄色固体4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯，产率97.56%；1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：8.55（2H，s），8.40（2H，d，J=7.72 Hz），7.78（2H，t，J=7.84 Hz），7.58（2H，d，J=7.60 Hz），4.13（8H，q，J=7.02 Hz），3.61（4H，s），3.40（8H，s），1.21（12H，t，J=7.12 Hz）；
8）4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯的合成，即图2中化合物9
将0.6g（0.84 mmol）4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、210mg（1.49 mmol）苯亚磺酸钠、14.3mg CuI（10% mol）碘化亚铜、0.012mL（10% mol）喹啉和10mL NMP加入50mL三口瓶中混合，在氩气保护下、140℃反应12h，用TCL监测反应至原料基本反应完毕，冷却至室温后加入100mL水，然后分别用50mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，有机相分别用50mL水清洗三次和50mL饱和食盐水清洗一次，再用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，柱分离，得0.51g（0.66 mmol）淡黄色油状物4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯，产率78.31%；1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：8.94（2H，s），8.47（2H，d，J=7.24 Hz），8.15（2H，d，J=6.52 Hz），7.88（2H，t，J=7.04 Hz），7.73（2H，d，J=7.68 Hz），7.65-7.59（3H，m），4.24（8H，q，J=6.96 Hz），4.21（4H，s），3.72（8H，s），1.28（12H，t，J=7.12 Hz）。13C-NMR（100MHz,CDCl3）δ ppm：171.3，158.9，157.4，155.3，153.8，137.7，133.8，129.5，128.4，124.1，124.0，119.8，117.9，60.7，55.1，29.7，14.3； 
9）4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸的合成，即图2中目标化合物10
将37mg（47.69 μmol）4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、15.3mg氢氧化钠3mL THF和3mL水加入25mL圆底瓶中混合，室温下反应6h，用浓度为4 M的盐酸溶液调pH至2.5，浓缩后过滤，用水清洗滤饼后用红外干燥，得到21.5mg（32.40 μmol）白色固体粉末状目标物4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸，产率：67.37%；1H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ ppm：8.77（2H，s），8.51（2H，d，J=7.76），8.15（2H，d，J=7.84），8.03（2H，t，J=7.76），7.79-7.67（5H，m），4.11（4H，s），3.54（8H，s）。13C-NMR（100MHz, DMSO-d6）δ ppm：173.4，159.9，157.5，153.0，152.2，139.5，138.7，135.2，130.7，128.6，124.6，120.2，117.1，59.7，55.9。MS（ESI-）：662.4(M-1)-。
所述以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针的应用，利用顺磁荧光双功能探针与人体泛素蛋白质的连接产物，用于核磁共振的荧光光谱和顺磁标记，如图3所示，所述顺磁荧光双功能探针与人体泛素蛋白质的连接方法如下：
1）配制10 mM的4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸标签溶液；
2）采集人体泛素蛋白质 G47C在三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液pH=8.0时的1H-15N HSQC谱图作为空白对照；
3）在人体泛素蛋白质 G47C中加1.0倍量的三(2-羧基乙基)膦（TCEP）；
4）将人体泛素蛋白质 G47C加入5倍量的4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸中，此时pH为8.0；
5）通过采集混合物在不同时刻的1H-15N HSQC谱图来监测反应，直至反应完全；
6）反应完全后，通过PD10脱盐柱分离产物，将剩余的标签和新生成的小分子出去，最后得到人体泛素蛋白质 G47C与4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸的连接产物。
图4为0.1 mM人体泛素蛋白质G47C与0.1 mM人体泛素蛋白质 G47C---T1复合物在25℃，pH=6.4的20 mM的MES缓冲液中的1H-15N HSQC重叠谱图，黑色表示人体泛素蛋白质G47C的谱图，灰色表示复合物人体泛素蛋白质G47C--T1的谱图。图中表明：连接前后化学位移有明显的变化，图上所标记的氨基酸残基因接近连接位点，化学环境显著改变，导致其对应的峰消失
图5和图6分别为金属离子Eu3+（图5）和Tb3+（图6）在不同含量时人体泛素蛋白质G47C-T1-M3+复合物在pH=7.6的20 mM的Tris缓冲液中的时间分辨荧光发射谱图。图中表明：到随着金属离子的滴加，人体泛素蛋白质G47C-T1与金属离子（Eu3+和Tb3+）的复合物可产生明显的金属离子的特征荧光发射峰，而且荧光强度逐渐增加，当金属离子浓度与人体泛素蛋白质G47C-T1为1:1时，配位达到饱和，荧光强度不再随金属离子浓度的增加而变化。
上述顺磁荧光双功能探针与蛋白质上的巯基发生亲核取代反应，生成具有硫醚键的稳定的连接产物，该探针的优势体现在以下几个方面：1）体积较小； 2）没有手性；3）与镧系金属有多个配位点；4）连接产物刚性强；5）与蛋白质不存在非特异性作用；6）连接产物稳定；7）连接产物与金属离子（Eu3+和Tb3+）的复合物有较明显的荧光。

Claims (4)

1.一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针，其特征在于：为4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸，其化学结构式为
。
2.一种如权利要求1所述以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针的制备方法，其特征在于步骤如下：
1）吡啶-2,6-二甲酸二乙酯的合成
将吡啶-2,6-二甲酸和SOCl2混合，回流3-12h，蒸出SOCl2，然后在冰浴下滴加无水乙醇，室温搅拌8h后浓缩至干，在残余物中加入水，然后在冰浴下用碳酸钾中和，用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥,经过滤、旋干，得土黄色晶状固体吡啶-2,6-二甲酸二乙酯；
2）1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮的合成
将氢化钠和四氢呋喃混合后，氩气保护下，升温至40-50℃，然后滴加吡啶-2,6-二甲酸二乙酯、丙酮和四氢呋喃的混合液，反应2-8h，冷却至室温，倒入冰水中，6M盐酸溶液调pH至7，然后浓缩至体积的3/5，冰水冷却并趁冷过滤，将滤饼干燥，得橘红色固体1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮；
3）4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯的合成
将1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮、乙酸铵和无水乙醇混合，回流2-10h，冷却至室温，浓缩至干，将残余物加入水清洗，过滤后将残余物溶于二氯甲烷，有机相分别用水，0.5 M的稀盐酸和饱和食盐水清洗，有机相用无水硫酸钠干燥，经过滤、旋干、柱分离，得黄色固体粉末4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯； 
4）4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯的合成
将4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、五溴化磷和DMF混合，氩气保护下，40-80℃反应6-12h，冷却至室温后蒸出DMF，在残余物中加入水后用饱和碳酸氢钠中和，用氯仿萃取后合并有机相，有机相分别用水和饱和食盐水清洗，然后用无水硫酸钠干燥，经过滤、旋干、柱分离，得白色固体粉末状4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯； 
5）4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇的合成
将4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、四氢呋喃和无水乙醇混合，然后加入硼氢化钠，室温下反应15-30h，加水使反应淬灭，旋出有机溶剂浓缩，过滤后将滤饼用红外干燥，得到白色固体粉末状4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇； 
6）4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶的合成
将4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇和氯仿混合，搅拌下滴加三溴化磷，回流2-8h，用饱和碳酸氢钠溶液中和后用二氯甲烷萃取，合并有机层，有机层分别用水和饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，得白色固体粉末状4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶；
7）4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯的合成
将4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶、无水碳酸钾、碘化钾、亚氨基二乙酸二乙酯和无水乙腈混合，回流2-8h后浓缩至干，加入水，然后用二氯甲烷萃取，有机相分别用水和饱和食盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥，经过滤、旋干，得淡黄色油状物，静置后变为淡黄色固体4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯； 
8）4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯的合成
将4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、苯亚磺酸钠、碘化亚铜、喹啉和NMP混合，氩气保护下，100-140℃反应5-12h，冷却至室温后加入水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相分别用水和饱和食盐水清洗有机层，再用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干、柱分离，得淡黄色油状物4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯； 
9）4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸的合成
将4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、氢氧化钠、THF和水混合，室温下反应2-8h，用浓度为4 M的盐酸溶液调pH至2~3，浓缩后过滤，用水清洗滤饼后用红外干燥，得到白色固体粉末状目标物4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸。
3.根据权利要求2所述以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中吡啶-2,6-二甲酸、SOCl2、无水乙醇与水的用量比为1g:4.2mL：5mL：5mL；
步骤2）中氢化钠与四氢呋喃的用量比为1g:20mL，吡啶-2,6-二甲酸二乙酯、丙酮与四氢呋喃的用量比为6.6g:1mL:22mL；
步骤3）中1,5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1,3,5-戊三酮、乙酸铵、无水乙醇、水与二氯甲烷的用量比为1g:1.3g：18mL：25ml：37.5mL；
步骤4）中4′-羟基-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、五溴化磷、DMF与水的用量比为1g: 3g：23mL：30mL；
步骤5）中4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲酸乙酯、四氢呋喃、无水乙醇、硼氢化钠与水的用量比为1g:50mL：12mL：0.4g：15mL；
步骤6）中的4′-溴-2,2′:6′,2′′-三联吡啶-2,6′′-二甲醇、三溴化磷和氯仿的用量比为1g:1mL：37.5mL；
步骤7）中4′-溴-6，6′′-二溴甲基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶、无水碳酸钾、碘化钾、亚氨基二乙酸二乙酯、无水乙腈与水的用量比为1g:1.2g:0.5g：0.8mL：50mL：50mL；
步骤8）中4′-溴-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、苯亚磺酸钠、碘化亚铜、喹啉、NMP与水的用量比为1g:0.35g:0.023g:0.02mL:16.7mL：150mL；
步骤9）中4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸四乙酯、氢氧化钠、THF与水的用量比为1g:0.41g:80mL:80mL。
4.一种如权利要求1所述以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针的应用，其特征在于：利用顺磁荧光双功能探针与人体泛素蛋白质的连接产物，用于核磁共振的荧光光谱和顺磁标记，所述顺磁荧光双功能探针与人体泛素蛋白质的连接方法如下：
1）配制10 mM的4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸标签溶液；
2）采集人体泛素蛋白质 G47C在三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液pH=8.0时的1H-15N HSQC谱图作为空白对照；
3）在人体泛素蛋白质 G47C中加1.0倍量的三(2-羧基乙基)膦（TCEP）；
4）将人体泛素蛋白质 G47C加入5倍量的4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸中，此时pH为8.0；
5）通过采集混合物在不同时刻的1H-15N HSQC谱图来监测反应，直至反应完全；
6）反应完全后，通过PD10脱盐柱分离产物，将剩余的标签和新生成的小分子出去，最后得到人体泛素蛋白质 G47C与4′-苯砜基-2,2′:6′,2′′-联三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸的连接产物。
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