CN106243020A - 一种用于蛋白质标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针 - Google Patents
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Abstract
一种用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针，其化学名称为4‑苯砜基‑6‑甲基‑2‑[N,N‑二(乙二氨基)氨甲基]吡啶‑N′,N′,N″,N″‑四乙酸，化学结构式为：该探针具有八个配位点，含四个羧基、三个氮原子和一个吡啶氮，并通过吡啶环对位的苯砜基与蛋白质巯基在水溶液中的亲核取代反应进行刚性连接；所述用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针直接用于蛋白质标记。本发明的优点是：该探针具有八个配位点，含四个羧基、三个氮原子和一个吡啶氮，通过苯砜基与蛋白质巯基的反应刚性连接，齿合度高、螯合性好(多个配位点)、构象单一、水溶性好，可直接用于蛋白质标记。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质顺磁标记领域，特别是一种用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针。
背景技术
高分辨顺磁核磁共振在在蛋白质的结构生物学及动态学方面的研究中发挥着重要作用。此技术通过顺磁中心的未配对电子与蛋白质分子自旋核的相互作用来提供有价值的长程结构限制信息，包括顺磁弛豫增强(paramagnetic relaxation enhancement，PRE)、贋接触化学位移(pseudocontact shifts，PCS)、残余偶极耦合(residual dipolarcouplings，RDC)等，利用这些顺磁信息，我们可研究生物大分子的空间结构、生物功能以及分子之间的相互作用。此外，由于此种方法能够充分模拟蛋白质所处的生理环境(如温度、pH、盐浓度、拥挤程度等)，并可在接近生理条件下测定蛋白质分子的溶液结构和动态学信息，因此更有利于真实地了解蛋白质的实际状态和行为，参见：a)J.Biomol.NMR,2010,46:101-112；b)Annu RevBiophys,2010,39:387-405；c)Chem Rev,2009,109:4108-4139；d)Prog NMR Spectr,2002,40:249-273。
大多数蛋白质并不含天然的顺磁中心，为准确获取上述信息需借助合适的功能有机小分子探针。此类探针通常包含一个具有很强金属离子(如镧系金属离子和过渡金属离子)螯合性能的基团和一个可参与蛋白质定点修饰的活性反应基团(如与蛋白质表面半胱氨酸反应)。连接后，由于顺磁效应，顺磁中心附近氨基酸残基的化学环境会发生较大的变化，导致核磁共振谱峰的化学位移亦发生明显改变，进而获取相关的顺磁数据。也就是说，双功能有机小分子顺磁探针的设计与合成在蛋白质的顺磁研究中有着举足轻重的地位，参见：ChineseJMagn Reson,2014,31,155-171。
一个性能良好的有机小分子顺磁探针，通常含有多氨基多羧基的亲水结构。这些亲水结构通常又由一些常见的有机螯合配体衍生而来，如非环状结构的乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、吡啶-2,6-二甲酸(DPA)、2,6-吡啶二甲氨基-N,N,N′,N′-四乙酸(PyMTA)等，环状结构的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)等。由上述配体衍生而来的顺磁探针均可与顺磁金属离子配位形成热力学稳定的配合物。图1中列出了已报道的部分代表性的顺磁探针。
Leonov(Chem.Eur.J.,2005,11:3342-3348)和Haberz(Org.Lett.,2006,8:1275-1278)等人以EDTA为骨架，在乙二胺骨架上直接引入手性中心并导入活性连接基团，分别报道了立体化学纯的探针T1和T2，其实验结果表明：T1、T2与各项异性的顺磁金属离子配位后在1H-15N HSQC谱图上只呈现出一套顺磁峰，充分限制了新手性中心的产生，避免了谱图的复杂化，可很好地用于获取蛋白质的顺磁信息，但上述化合物也有一定的弊端，它们需通过严格的手性拆分才能得到，其制备过程繁琐、费时。
Prudêncio等人(Chem.Eur.J.,2004,10:3252-3260)基于DTPA设计并报道了含有更多配位点的探针T3，且此探针具有两个活性巯基，可同时与蛋白质表面上距离为的两个半胱氨酸残基反应(这里应注意：含多个半胱氨酸残基的蛋白在表达及纯化中可能形成二聚或沉淀)，增加连接刚性，有效限制探针与蛋白质表面的相互运动，避免PCS平均化。然而T3与Ln3+螯合后会产生多种对映异构体，导致1H-15N谱图出现至少五套顺磁峰，难以指认，因此多用于PRE研究。
Su等人(Chem.Commun.,2015,51:2824-2827)创新性地将苯砜基引入吡啶环对位，报道了探针T4、T5，此项改进极大限度的缩短了探针与目的蛋白间的距离，刚性也较二硫键或双键等连接方式有显著提升，探针骨架具有很强的螯合金属离子的能力，产物无手性，探针-蛋白复合物在滴加Ln3+后也仅呈现出一套PCS，从而更有利于PCS数据的分析处理。
Graham等人(Bioconjugate Chem.2011,22,2118-2125)报道了DOTA大环类探针，即图1中的化合物T6，这种大环化合物较为特殊的空间构象，可与顺磁金属离子形成高配位化合物，对称性高，结合紧密，具有高度的热力学稳定性，可获取较大的PCS，但形成配合物的过程较为缓慢，通常需要长时间的加热或回流才能制备。相比之前的DOTA类探针，它在氮原子上引入了手性官能团，可获得更好的动力学惰性和更少的非对映异构体，从而避免出现多套峰而造成PCS复杂化。
因此，在设计与合成一个性能优越的功能有机小分子顺磁探针时，需综合考虑以下几方面：
1)被螯合的顺磁金属离子应接近蛋白质表面。距离太远将不利于顺磁信息的准确获取。
2)体积小，与蛋白质刚性连接。若探针体积过大，会因空间位阻等原因造成连接效率低下甚至无法连接，同时，在一定程度上也会影响溶液中蛋白质的三维结构及功能；若探针与蛋白质连接后刚性不强，则会对蛋白质表面发生相对运动，造成PCS和RDC明显降低。
3)无手性中心，构象单一。探针与顺磁金属离子配位后若产生多个非对映异构体，NMR谱图中会出现多套顺磁峰，导致谱图复杂而难以分析。
4)水溶性良好。一个水溶性好的探针才能更方便快捷地在生理条件下对蛋白质进行定点修饰。
探针与蛋白质的化学连接主要依赖于蛋白质的表面活性残基，半胱氨酸残基中的巯基常被用于连接修饰，其主要原因有以下两点：1)蛋白质中表面活性巯基的含量相对较少(1-2％)，可达到蛋白质单一定点修饰的目的(Protein.Eng.,2002,15:353-358.)；2)巯基化学发展已较为成熟，巯基的亲核性也远强于蛋白质中的其他亲核基团，这使其具有较高的反应活性，可参与多种连接反应。除此之外，在蛋白质指定位点通过基因突变技术单一引入半胱氨酸残基的简便性也使此种手段的应用更加广泛，参见Bioconjug.Chem.,2008,19:2527-2534。在以往的研究中，通过二硫键将含有活化巯基的探针与蛋白质连接的方法应用最为广泛，参见J.Am.Chem.Soc.,2009,131:14761-14767。此外，巯基与缺电子烯烃的硫醇烷基化也能达到很好的连接效果，同时也突破了二硫键连接时连接产物在还原条件下不稳定的限制，参见Chem.Eur.J.2013,19,1097-1103。之后，将苯砜基代替双键，前者作为离去基与蛋白质巯基发生亲核取代反应，反应条件温和，可选择性与单一巯基连接，产物稳定，连接效果较双键而言更加刚性，参见Chem.Commun.,2015,51:2824-2827；非天然氨基酸的引入使得点击化学，参见Bioconjugate Chem.,2013,24:260-268以及水环境下的多种偶联反应，参见J.Am.Chem.Soc.,2013,135,13612-13615能更好的应用于蛋白质连接，为蛋白质连接技术注入新鲜活力。图2为部分已报道的蛋白连接方式。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针，该探针具有八个配位点，通过苯砜基与蛋白质巯基的反应刚性连接，齿合度高、螯合性好、构象单一、水溶性好，可直接用于蛋白质标记。
本发明的技术方案：
一种用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针，其化学名称为4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸，化学结构式为：
该探针具有八个配位点，含四个羧基、三个氮原子和一个吡啶氮，并通过吡啶环对位的苯砜基与蛋白质巯基在水溶液中的亲核取代反应进行刚性连接。
一种所述用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针的制备方法，步骤如下：
1)2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制备
将2,6-二甲基吡啶、双氧水和冰乙酸按用量比1g:1.8mL:5mL混合，在60-90℃下反应5-10h，旋干溶剂，冰水浴下用饱和碳酸钾溶液调pH至8-9，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色油状液体2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
2)4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制备
将上述2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、浓度为98wt％的硫酸和浓度为98wt％的硝酸按用量比1g:3mL:3.5mL混合，加热回流反应5-10h，按2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在水浴下用无水碳酸钾调pH至8-9，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色粉末状固体4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
3)4-硝基-2-羟甲基-6-甲基吡啶的制备
将上述4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、三氟乙酸酐和二氯甲烷按用量比1g:4.5mL:13mL混合，加热回流反应15-20h，旋干溶剂，按4-硝基-2-甲基吡啶-N-氧化物与饱和碳酸钾溶液用量比为1g:18mL加入饱和碳酸钾溶液，室温下搅拌2-5h，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色固体4-硝基-2-羟甲基-6-甲基吡啶；
4)4-苯砜基-2-羟甲基-6-甲基吡啶的制备
将上述4-硝基-2-羟甲基-6-甲基吡啶、硫代苯亚磺酸钠和无水乙腈按用量比1g:1.6g:40mL混合，加热回流反应15-20h，旋干溶剂，加入乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到乳白色粉末状固体4-苯砜基-2-羟甲基-6-甲基吡啶；
5)4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶的制备
将上述4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶、三溴化磷和三氯甲烷按质量体积比1g:1.1mL:30mL混合，加热回流反应3-6h，旋干溶剂，然后按质量体积比1g:25mL加入冰水，用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8-9，依次用二氯甲烷萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色油状液体-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶；
6)N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)二乙基三胺的制备
将二乙基三胺、邻苯二甲酰亚胺、冰乙酸按用量比1mL:2.9g:13mL混合，加热回流3-5h，旋出冰乙酸，用饱和碳酸钾溶液调pH至8-9，过滤，水洗，真空干燥，得乳白色固体N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)二乙基三胺；
7)4-苯砜基-2-[N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶的制备
将上述4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶、邻苯二甲酰亚胺保护后的二乙烯三胺、无水碳酸钾和无水乙腈按质量体积比1g:1.65g:3.2g:70mL混合，氩气保护下加热回流反应5-10h，过滤并旋干溶剂，柱分离，得乳白色固体4-苯砜基-2-[N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶；
8)4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶的制备
将上述4-苯砜基-2-[N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶、80wt％水合肼、无水甲醇按质量体积比1g:1mL:30mL混合，剧烈回流反应20-30h，经过滤并将滤液浓缩至干，用二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，得到黄色粘稠液体4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶；
9)4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶的制备
将上述4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶、溴乙酸乙酯、无水碳酸钾和无水乙腈按用量比1g:5mL:9g:55mL混合，氩气保护、室温条件下反应40-50h，经过滤并将滤液浓缩至干，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离后，得到棕黄色油状液4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶；
10)4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸的制备
将上述4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶、氢氧化钠、无水乙醇和蒸馏水按用量比1g:0.48g:10mL:10mL混合，室温下搅拌反应5-10h，分批少量加入H+离子交换树脂调pH至3-4，用无水甲醇洗涤树脂至无荧光，过滤后将滤液浓缩至干，得乳白色固体4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸，即目标探针产物二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针。
一种所述用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针的应用，直接用于蛋白质标记。
本发明的优点是：该探针具有八个配位点，含四个羧基、三个氮原子和一个吡啶氮，通过苯砜基与蛋白质巯基的反应刚性连接，齿合度高、螯合性好(多个配位点)、构象单一、水溶性好，可直接用于蛋白质标记。
附图说明
图1为部分已报道顺磁探针的化学结构式。
图2为部分已报道的蛋白连接方式。
图3探针4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶与目的蛋白的连接方式。
图4 25℃，pH 6.4条件下，2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液。0.10mM的蛋白-探针复合物与1.0倍量的顺磁金属离子Tm3+(铥)滴定前后的1H-15N HSQC重叠谱图，灰色表示未滴加金属离子，黑色表示滴加顺磁Tm3+(铥)。
图5为二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针的合成路线图。
具体实施方式
实施例：
一种用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针，其化学名称为4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸，化学结构式为：
该探针具有八个配位点，含四个羧基、三个氮原子和一个吡啶氮，并通过吡啶环对位的苯砜基与蛋白质巯基在水溶液中的亲核取代反应进行刚性连接；
其合成步骤如下：
1)2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制备
在250mL三口瓶中，将10g 2,6-二甲基吡啶、9mL双氧水和50mL冰乙酸混合，在70℃下反应4h，随后立即加入另一半9mL双氧水，继续反应6h，呈现淡黄色透明体系，旋干溶剂，冰水浴下用饱和碳酸钾溶液调pH至8-9，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色油状液体2,6-二甲基吡啶-N-氧化物7.25g。产率：63％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm：8.31(1H，d，J＝7.08Hz)，8.17(1H，d，J＝3.02Hz)，7.95(1H，dd，J＝7.08Hz，J＝3.02Hz)，2.61(6H，s)。
2)4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制备
在250mL三口瓶中，加入20mL浓度为98wt％的硫酸，冰水浴降温，逐滴滴加7.30g上述2,6-二甲基吡啶-N-氧化物，然后继续滴加25mL浓度为98wt％的硝酸混合，加热回流(T＝120℃)反应6h，按2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在水浴下用无水碳酸钾调pH至8-9，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色粉末状固体4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物7.40g。产率：74％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm：8.07(2H，s)，2.58(6H，s)。
3)4-硝基-2-羟甲基-6-甲基吡啶的制备
在250mL单口瓶中，加入35mL二氯甲烷，4g 4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物，冰水浴降温，逐滴滴加9mL三氟乙酸酐，滴毕，加热回流(T＝40℃)21h，体系呈现橙红色，并随反应时间的延长颜色逐渐加深。反应结束，将反应液浓缩至干，向残余物中加入20mL饱和碳酸钾溶液，室温搅拌4h，体系中有橙红色固体析出。乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩至干，柱分离，得淡黄色固体2.90g。产率：73％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.87(1H,s),7.81(1H,s),4.89(2H,d,J＝5.16Hz),2.74(3H,s)。
4)4-苯砜基-2-羟甲基-6-甲基吡啶的制备
在250mL三口瓶中，将2g 4-硝基-2-羟甲基-6-甲基吡啶、3.2g硫代苯磺酸钠，0.20g四丁基溴化铵和80mL无水乙腈混合，抽真空，氩气保护，加热回流(T＝80℃)15h，体系呈现淡黄色，且反应过程中伴随有淡红棕色气体产生，反应结束。过滤，滤液浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，饱和氯化钠溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液再次浓缩至干，柱分离，得乳白色固体1.75g。产率：56％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.98(2H,d,J＝6.88Hz),7.65(2H,d,J＝6.80Hz),7.56(3H,d,J＝10.28Hz),4.80(2H,s),2.64(3H,s)。
5)4-苯砜基-2-溴甲基-6-甲基吡啶的制备
在100mL单口瓶中，加入20mL氯仿，0.70g 4-苯砜基-2-羟甲基-6-甲基吡啶，冰水浴降温，逐滴滴加溶有三溴化磷的氯仿溶液(0.80mL三溴化磷/10mL氯仿)，加毕，撤冰水浴，加热回流(T＝60℃)4.5h，由乳白色浑浊变为淡黄色澄清体系，反应结束。将反应液倒入20mL冰水中，用饱和碳酸氢钠溶液调水相pH至8-9，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥有机相。过滤，滤液浓缩至干，得淡黄色油状液体，放置若干小时后变为淡黄色固体0.60g。产率：69％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.00(1H,s),7.98(1H,d,J＝1.32Hz),7.73(1H,s),7.68(1H,t,J＝7.36Hz),7.59(2H,t,J＝7.24Hz),7.54(1H,s),4.55(2H,s),2.64(3H,s)。
6)N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)二乙基三胺的制备
在500mL三口瓶中，加入150mL冰乙酸，35.25g邻苯二甲酰亚胺，滴加12.20mL二乙烯三胺，滴毕，呈现淡黄色浑浊体系，加热回流(T＝120℃)3.5h，体系逐渐变为暗红色，停止加热，反应结束。将体系中的冰乙酸蒸出，用饱和碳酸钾溶液调pH至9-10，有大量淡黄色固体析出，过滤并洗涤，真空干燥滤渣，得乳白色粉末状固体38.90g。产率：89％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm：7.77-7.69(8H,m),3.81(4H,t,J＝5.96Hz),2.99(4H,t,J＝5.96Hz)。
7)4-苯砜基-2-[N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶的合成制备
在100mL单口瓶中，将0.50g 4-苯砜基-2-溴甲基-6-甲基吡啶、0.83gN,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)二乙基三胺、1.60g无水碳酸钾和35mL无水乙腈混合，氩气保护，加热回流(T＝80℃)8h，变为橘黄色体系，反应结束。过滤，滤液浓缩至干，柱分离，得乳白色蓬松状固体0.85g。产率：91％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.98(2H,d,J＝7.88Hz),7.77-7.70(8H,m),7.63(1H,s),7.59(1H,t,J＝7.04Hz),7.53(2H,t,J＝7.12Hz),7.36(1H,s),3.92(2H,s),3.78(4H,t,J＝6.36Hz),2.90(4H,t,J＝6.20Hz),2.55(3H,s)。
8)4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶的制备
在100mL单口瓶中，加入30mL甲醇，1.00g 4-苯砜基-2-[N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶，搅拌下滴加0.95mL 80％的水合肼，滴毕，加热剧烈回流(T＝70℃)20h，随着反应的进行瓶壁有土黄色固体附着，反应结束。过滤，滤液浓缩至干，得淡黄色粘稠状固体，二氯甲烷固相萃取，过滤，再次将滤液浓缩至干，重复萃取至最终浓缩物不再出现固体，得淡黄色粘稠油状液体0.40g。产率：70％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.95(2H,d,J＝7.56Hz),7.70(1H,s),7.61(1H,t,J＝7.24Hz),7.52(2H,t,J＝7.40Hz),7.47(1H,s),3.78(2H,s),2.77(4H,t,J＝5.80Hz),2.60(4H,t,J＝5.74Hz),2.57(3H,s)。
9)4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶的制备
在100mL单口瓶中，将0.40g 4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶，4.40g无水碳酸钾和25mL无水乙腈混合，冰水浴降温，逐滴滴加溶有溴乙酸乙酯的无水乙腈溶液(2.20mL溴乙酸乙酯/20mL无水乙腈)，滴毕，撤冰水浴，氩气保护，室温搅拌48h，颜色逐渐变黄，反应结束。过滤，滤液浓缩至干，柱分离，得棕黄色油状液体0.40g。产率：50％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.01(2H,d,J＝7.32Hz),7.82(1H,s),7.64(1H,t,J＝7.24Hz),7.57(2H,t,J＝7.12Hz),7.46(1H,s),4.15(8H,q,J＝7.08Hz),3.83(2H,s),2.86(4H,t,J＝6.44Hz),2.67(4H,t,J＝7.64Hz),2.59(3H,s),1.26(12H,t,7.12Hz)；MS-ESI(+):693.3。
10)4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸的制备
在100mL单口瓶中，加入0.38g 4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶，4mL无水乙醇，6mL蒸馏水，逐滴滴加氢氧化钠溶液(0.18g氢氧化钠/3mL蒸馏水)，室温搅拌8h，分批少量加入H+离子交换树脂调pH至3-4，无水甲醇多次洗涤H+离子交换树脂，过滤，滤液呈现棕黄色透明状，浓缩至干。将残留物溶于10mL丙酮中，室温搅拌0.5h，过滤，红外干燥滤渣，得淡黄色粉末状固体0.26g，即为目标产物二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针，产率：82％。1H-NMR(400MHz,90％H2O+10％D2O)δppm:7.96(2H,d,J＝7.92Hz),7.86(1H,s),7.74(1H,s),7.66(1H,t,J＝7.52Hz),7.56(2H,t,J＝8.12Hz),3.83(2H,s),3.59(8H,s),3.27(4H,t,J＝6.96Hz),2.86(4H,t,J＝6.88Hz),2.53(3H,s)；13C-NMR(100MHz,90％H2O+10％D2O)δppm:169.72,160.91,157.70,151.91,150.98,137.40,135.23,130.00,128.16,121.61,118.72,57.30,56.67,52.10,48.09,22.66；MS-ESI(–):579.2。
该二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针的合成路线如图5所示。
所制备的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针直接用于蛋白质标记。
该二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针的应用研究：
高分辨顺磁核磁共振在结构生物学的研究中发挥着重要的作用。此部分研究主要通过获取贋接触化学位移来验证探针的相关性能是否优良，并旨利用上述信息研究生物大分子的空间结构、动态变化及分子间的相互作用。
该二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针含有多个配位点，可以螯合顺磁金属离子生成稳定的络合物，并通过吡啶对位的苯砜基与蛋白质中的巯基选择性反应连接，与目的蛋白连接后，由于顺磁效应，连接位点附近氨基酸残基的化学环境会发生较大变化，进而导致核磁谱峰的化学位移也发生明显改变，最终获取PCS数据。此种连接方式刚性强，且顺磁中心距离蛋白质表面更近，便于顺磁研究，可得到理想的高分辨核磁谱图。
该二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针与蛋白质的连接方式如图3所示。
为了研究此类探针的顺磁性能是否良好，我们将其与目的蛋白—人体泛素蛋白-S57C突变体在接近生理条件下进行反应连接，并用核磁手段来获取相关顺磁数据，具体操作过程如下：
1)配置50mM的4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸探针溶液，定量称取，加入超纯水和适量盐酸溶解；
2)采集人体泛素蛋白-S57C在三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液pH 7.6时的1H-15NHSQC谱图作为空白对照；
3)在人体泛素蛋白-S57C中加0.5倍量的三(2-羧基乙基)膦(TCEP)，室温放置20min；
4)再向3)中加入5倍量的已配制好的探针溶液，调节体系pH为7.6；
5)通过采集混合物在不同时刻的1H-15N HSQC谱图来监测反应进程，直至反应完全；
6)反应完全后，将反应混合物经超滤浓缩并用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液洗涤2-3次，去除多余的游离探针和少量的盐，之后进一步使用Mini Q柱进行纯化，分离蛋白-探针复合物与未连接的蛋白和探针。
7)配制0.1mM，pH 6.4的蛋白-探针复合物溶液(用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液配制)，加入10mM的硝酸铥溶液(1equiv)充分混合，采集1H-15N HSQC谱图。
我们将滴加硝酸铥前后的两张1H-15N HSQC谱图重叠，如图4(灰色：未滴加硝酸铥；黑色：滴加硝酸铥)所示。之后我们发现，人体泛素蛋白-S57C突变体的探针复合物与镧系金属离子三价铥作用后表现为单一顺磁信号峰，并产生较大的PCS，这表明无论从连接刚性还是结合金属离子强弱程度的方面考虑，我们设计并合成的有机功能小分子顺磁探4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸具有良好的顺磁性能，是一个在蛋白质顺磁研究中颇有前景的一个探针。
上述所有核磁实验都是在温度为25℃下，Bruker-600MHz超导核磁共振谱仪采样。实验数据均用Topspin、Sparky和Corel DRAW软件处理完成。
Claims (3)
1.一种用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针，其特征在于化学名称为4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸，化学结构式为：
该探针具有八个配位点，含四个羧基、三个氮原子和一个吡啶氮，并通过吡啶环对位的苯砜基与蛋白质巯基在水溶液中的亲核取代反应进行刚性连接。
2.一种如权利要求1所述用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制备
将2,6-二甲基吡啶、双氧水和冰乙酸按用量比1g:1.8mL:5mL混合，在60-90℃下反应5-10h，旋干溶剂，冰水浴下用饱和碳酸钾溶液调pH至8-9，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色油状液体2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
2)4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制备
将上述2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、浓度为98wt％的硫酸和浓度为98wt％的硝酸按用量比1g:3mL:3.5mL混合，加热回流反应5-10h，按2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在水浴下用无水碳酸钾调pH至8-9，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色粉末状固体4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
3)4-硝基-2-羟甲基-6-甲基吡啶的制备
将上述4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、三氟乙酸酐和二氯甲烷按用量比1g:4.5mL:13mL混合，加热回流反应15-20h，旋干溶剂，按4-硝基-2-甲基吡啶-N-氧化物与饱和碳酸钾溶液用量比为1g:18mL加入饱和碳酸钾溶液，室温下搅拌2-5h，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色固体4-硝基-2-羟甲基-6-甲基吡啶；
4)4-苯砜基-2-羟甲基-6-甲基吡啶的制备
将上述4-硝基-2-羟甲基-6-甲基吡啶、硫代苯亚磺酸钠和无水乙腈按用量比1g:1.6g:40mL混合，加热回流反应15-20h，旋干溶剂，加入乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到乳白色粉末状固体4-苯砜基-2-羟甲基-6-甲基吡啶；
5)4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶的制备
将上述4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶、三溴化磷和三氯甲烷按质量体积比1g:1.1mL:30mL混合，加热回流反应3-6h，旋干溶剂，然后按质量体积比1g:25mL加入冰水，用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8-9，依次用二氯甲烷萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色油状液体-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶；
6)N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)二乙基三胺的制备
将二乙基三胺、邻苯二甲酰亚胺、冰乙酸按用量比1mL:2.9g:13mL混合，加热回流3-5h，旋出冰乙酸，用饱和碳酸钾溶液调pH至8-9，过滤，水洗，真空干燥，得乳白色固体N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)二乙基三胺；
7)4-苯砜基-2-[N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶的制备
将上述4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶、邻苯二甲酰亚胺保护后的二乙烯三胺、无水碳酸钾和无水乙腈按质量体积比1g:1.65g:3.2g:70mL混合，氩气保护下加热回流反应5-10h，过滤并旋干溶剂，柱分离，得乳白色固体4-苯砜基-2-[N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶；
8)4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶的制备
将上述4-苯砜基-2-[N,N-二(2-邻苯二甲酰亚胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶、80wt％水合肼、无水甲醇按质量体积比1g:1mL:30mL混合，剧烈回流反应20-30h，经过滤并将滤液浓缩至干，用二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，得到黄色粘稠液体4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶；
9)4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶的制备
将上述4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶、溴乙酸乙酯、无水碳酸钾和无水乙腈按用量比1g:5mL:9g:55mL混合，氩气保护、室温条件下反应40-50h，经过滤并将滤液浓缩至干，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离后，得到棕黄色油状液4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶；
10)4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸的制备
将上述4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亚甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶、氢氧化钠、无水乙醇和蒸馏水按用量比1g:0.48g:10mL:10mL混合，室温下搅拌反应5-10h，分批少量加入H+离子交换树脂调pH至3-4，用无水甲醇洗涤树脂至无荧光，过滤后将滤液浓缩至干，得乳白色固体4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸，即目标探针产物二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针。
3.一种如权利要求1所述用于蛋白质顺磁标记的二乙烯三胺四乙酸类顺磁探针的应用，其特征在于：直接用于蛋白质标记。
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- 2016-07-07 CN CN201610528252.0A patent/CN106243020A/zh active Pending
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