CN103951613A - 用于蛋白质顺磁标记的dtpa类似物的设计与合成 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质顺磁标记领域，合成了一个用于蛋白质顺磁标记的DTPA类似物。具有八个配位点的DTPA类似物，它是一个用巯基吡啶活化的顺磁标签，可以直接用来标记蛋白质和蛋白质连接，滴加镧系金属离子后，产生很大的PCS和RDC，即使在低pH下，仍然可以使用。

Description

用于蛋白质顺磁标记的 DTPA 类似物的设计与合成
技术领域
本发明属于蛋白质顺磁标记领域，涉及用于蛋白质顺磁标记的DTPA类似物的合成与应用。
背景技术
蛋白质的分子结构是其生物功能的基础，高场液相核磁共振技术（NMR）作为解析具有原子分辨率的蛋白质结构的两大主要手段之一，在近二十多年得到了迅速的发展。另一种主要手段是X-射线晶体衍射，到目前为止，X-射线晶体衍射技术是直观说明生物大分子空间结构信息的最主要技术手段，它为分子生物学的发展做出了非常杰出的贡献。但是这一技术其自身也有一定的局限性：（1）要求样品必须是晶体，但并不是所有的样品都容易结晶，并且晶体状态在生理条件下（pH，盐浓度，温度等）不易得到；（2）蛋白质样品在溶液中的结构其实是一个不断变化的过程，而一旦结晶仅仅是蛋白质的其中一个形态，并不能真实的反映出蛋白质在溶液中的具体形态；（3）虽然X-射线晶体衍射仪测出的温度因子可以反映生物大分子的柔性，但是不能反映出其动态变化的快慢。
随着核磁谱仪硬件技术的不断发展，以及脉冲技术、新的蛋白质标记技术的发现，高场液相核磁共振技术能够研究的蛋白质不断突破分子量的限制，可以达到几万，甚至几十万（波谱学杂志. 2009, 26, 151–172）。多维核磁共振在确定生物大分子的空间构象方面具有独特的优点：（1）：不需要结晶，在更加接近生理条件下研究生物大分子在溶液中的空间结构和功能之间的关系；（2）：可以不用破坏生物大分子的结构，在自然状态下对样品进行研究；（3）：可以研究生物大分子的动态行为（生物大分子多维核磁共振. 中国科学技术大学出版社. 第一版. 1999）。
利用核磁共振研究蛋白质溶液结构及功能的传统方法是奥沃豪斯效应（Nuclear Overhauser Effect，NOE）和二面角等限制性约束条件。当原子间的空间距离足够近时（6 Å），使用特定的NMR脉冲序列能够观测到这些原子间基于偶极耦合作用的相关信号（NOEs）。NOE信号的强度与原子间距离的6次方成反比，基于此可以将观测到的NOE信号转化为空间距离约束条件来测定蛋白质的空间结构。当研究大分子量蛋白质时，由于蛋白质分子具有较强的自旋-自旋弛豫效应而很难归属氨基酸残基的侧链质子，从而不能获得足够多的 NOE 结构限制条件。另外研究蛋白质复合物的结构时，接触面的质子信号由于线宽变宽导致很难观测到足够的 NOE 作为结构约束条件。二面角提供原子间相对取向，只能提供短程的结构信息，不易得到蛋白质内部结构域之间的相对取向。
与传统的核磁共振相比，顺磁核磁共振能够提供长程的结构限制信息，在解决大分子量蛋白质的溶液结构，蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-核酸相互作用等方面具有明显的优势。
物质中具有不成对电子的分子、原子或离子时，存在电子的自旋角动量和轨道角动量，也就存在自旋磁矩和轨道磁矩，在外加磁场的作用下，原来取向杂乱的磁矩将定向，从而表现出顺磁性。顺磁性是一种物质的磁性状态，与顺磁性相反的现象是逆磁性或称抗磁性。具有顺磁性的物质在外磁场条件下产生的磁矩与处在同一磁场中的自旋核相互作用，从而使该自旋核的弛豫时间、化学位移、谱峰宽度等发生变化，这种效应称为顺磁效应。
用顺磁标签位点专一的标记蛋白质和寡核苷酸可以在生物大分子中产生明显的顺磁效应，主要有三种效应可以提供长程的结构信息：（1）顺磁弛豫增强（paramagnetic relaxation enhancement，PRE）；（2）贋接触化学位移（pseudocontact shifts，PCS）；（3）残余偶极耦合（residual dipolar couplings，RDC)。
化学合成的镧系结合标签通过与蛋白质上唯一的活性氨基酸残基（例如半胱氨酸，人工合成的氨基酸）反应，可以对蛋白质进行定点标记。甲基硫代磺酸盐和二巯基吡啶是常用于活化巯基的试剂，用它们活化的标签可以与蛋白质中半胱氨酸的巯基发生二硫键交换反应，生成新的二硫键。镧系金属离子的配位数可以达到8、9，所以含有多氨基多羧基的配体是常用的螯合剂。乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）、三氨基六乙酸（TAHA）、2,6-吡啶二甲氨基-N,N,N´,N´-四乙酸（PyMTA）这些化合物都可以和镧系金属离子形成热力学稳定的络合物，许多化学合成的镧系结合标签是以上述螯合物为骨架，然后接上可以和蛋白质反应的活性基团。
图1中的化合物1和2是已经商业化的标签，很容易由EDTA酸酐制备，它们通过活化的巯基定点标记到目标蛋白质上，加入Co2+和Yb3+后，获得了有价值的PCS和RDC数据（J. Biomol. NMR, 2002, 24: 143–148）。但是1和2存在一个手性氮原子，所以当它们和镧系金属离子配位时，会产生两个对映异构体，造成两套PCS，核磁谱图复杂化，给图谱分析带来困难（J. Biomol. NMR, 2004, 29: 351–361）。
Prudêncio等人（Chem. Eur. J., 2004, 10: 3252–3260）报道的具有两个活性巯基的化合物，即图1中的化合物3，它是由DTPA双酸酐和S-(2-氨乙基)甲基硫代磺酸反应得到的，合成方法简单。化合物3可以和目标蛋白质上距离8-10Å的两个半胱氨酸残基同时反应，生成两个二硫键，增强了标签的刚性，限制了标签相对于蛋白质的运动，避免了PCS的平均化，但是NMR谱图至少有5个顺磁信号峰，1H-15N HSQC谱图非常复杂。但化合物3可以用于PRE的测定，和各向同性的Gd3+（不产生PCS）结合后，获得很好的PRE数据，成功的用于研究大的蛋白质-蛋白质复合物。
Peters等人（J. Biomol. NMR, 2011, 51: 329–337）报道了TAHA类似物，即图1中的化合物4，它含有一个甲基硫代磺酸基团，化合物4和蛋白质ubiquitin连接，滴加镧系金属离子后，1H-15N HSQC谱图中只有一套信号峰，产生较大的PCS和RDC。但是，由于化合物4和镧系金属离子配位后多余三个负电荷，所以顺磁标签的引入，会影响蛋白质表面的电荷分布，可能造成难以预料的实验结果。
Su等人（J. Am. Chem. Soc., 2008, 130: 10486–10487）报道了图1中的化合物5，它的体积小，和镧系金属离子配位没有手性，与蛋白质连接以后对蛋白质的结构影响比较小，目前化合物5已经商业化，但是其配位数较少，只有三个，需要借助蛋白质中的酸性氨基酸协助配位。
顺磁核磁共振由于其独特的性质，近年来在生物大分子的研究中发挥着越来越重要的作用。而顺磁标签的设计则起着举足轻重的作用，一个好的顺磁标签将非常有利于生物顺磁核磁共振的研究。如何把顺磁标签引入到蛋白质中，一般的方法是合成具有双功能团的小分子化合物，一端用于顺磁金属离子的螯合，另一端与蛋白质进行连接，所以选择合适的连接方式与螯合基团显得非常重要。因此在设计顺磁标签时，必须综合考虑以下问题：
（1）与镧系金属离子的结合能力。镧系金属离子有8到9个配位点，一个好的标签需要有多个和镧系金属离子配位的原子。如果结合力不强，部分解离下来的顺磁金属离子会造成非特异性PRE或结合到蛋白质中。
（2）连接的刚性。当标签与蛋白质连接后，若此顺磁标签有较大的柔性，其相对于蛋白质会进行运动，造成PCS和RDC平均化。
（3）光学纯度单一。标签和镧系金属离子配位后，如果产生多个异构体，NMR谱图中会出现多套信号峰，给谱图解析带来困难。
（4）对蛋白质结构与功能的影响。连接到蛋白质中的标签应该尽可能地减小对蛋白质结构和功能的影响，那些体积比较大的标签（如DOTA类似物，多肽）在一定程度上会影响蛋白质的结构与功能。
此外，基于片段的药物筛选与设计在过去10年开始出现并获得了重要的应用，数十种基于片段的药物已经进入临床测试期。源于靶标蛋白和小分子片段本质上的弱相互作用，现代核磁技术在其中发挥着无可替代的作用。近些年来出现的一些核磁新技术，例如顺磁弛豫增强（PRE）、贋接触化学位移（PCS）、残余偶极耦合（RDC）等能够更为准确的提供蛋白/片段之间的取向和距离信息，这些新技术的应用有望为基于片段的药物发现（FBDD）带来新的突破（波谱学杂志. 2012, 29, 163–181）。
发明内容
本发明的目的是提供一个用于蛋白质顺磁研究的标签，及其设计、合成方法与应用，该标签可与蛋白质无手性刚性连接，且只有一套信号峰。本发明提供的标签为S-2-硫代吡啶基-N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸（DTPA-CH2S-SPy），其合成路线如图2所示，具体合成步骤如下：
（1）S-三苯甲基-L-半胱氨酸，即图2中化合物7的合成
按摩尔比1.1：1称取L-半胱氨酸盐酸盐与三苯基氯甲烷，加入到与混合物的质量体积比为1：3的DMF中，室温搅拌20-30h后，加入质量分数为10%的NaOAc溶液混匀静止，待白色固体析出完毕，过滤，去离子水洗涤滤饼，将滤饼加入无水丙酮中重结晶，冷却后过滤，滤饼分别用无水丙酮和无水乙醚洗涤，红外干燥，得白色粉末。
（2）S-三苯甲基-L-半胱氨酸叔丁酯，即图2中化合物8的合成
按照质量体积比1:16将化合物7加入乙酸叔丁酯中，接着滴加70% 的HClO4，滴加完毕后，室温搅拌4-7h，加入体积比为1:20的乙酸乙酯，用1M NaHCO3溶液调pH至8-9，过滤，分去水层，分别用0.5M HCl、饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，得白色泡状固体。
（3）N-(2-溴乙基)亚氨基二乙酸二叔丁酯，即图2中化合物9的合成
将质量体积比为1:3.3:1.2:0.3的溴乙酸叔丁酯，DMF，DIEA，2-溴乙胺氢溴酸盐混合， 20-40℃搅拌18h，旋干溶剂，加入过量的乙酸乙酯，过滤，分别用水、饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得无色油状物。
（4）S-三苯甲基-N,N´-二[2-N,N´-二（叔丁氧羰基甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸叔丁酯，即图2中化合物10的合成
将质量体积比为1:1.4:13.3:2.4的化合物8，化合物9，乙腈，DIEA 混合，加热60-80℃反应48h，旋干溶剂，加入过量的乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得浅黄色油状物。
（5）N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸，即图2中化合物11的合成
将质量体积比为1:11.5:1:11.5的化合物10，二氯甲烷，三乙基硅烷，三氟乙酸混合，室温搅拌12h，旋干溶剂，加入质量体积比为1:11.5的 2M的氯化氢乙醚溶液，室温搅拌5min，旋干溶剂，加入质量体积比为1:12的无水乙醚，搅拌5min，静置，过滤，得白色粉末。
（6）S-2-硫代吡啶基-N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸，即图2中化合物12的合成
将质量体积比为1:170:0.4的2,2’-二巯基吡啶，无水甲醇，化合物11 混合。25-40℃继续搅拌3h，旋干溶剂，得黄色油状物，加入质量体积比为1:5的无水甲醇溶解，再加入质量体积比为1:10的无水乙腈，有沉淀析出，过滤，得白色粉末。1H-NMR（400 MHz，90%H2O+10%D2O）δ ppm：8.52（1H，s），8.22（1H，t，J = 7.8Hz），8.07（1H，d，J = 7.8Hz），7.63（1H，s），3.91（8H，s），3.76（1H，m），3.40（4H，m），3.24（1H，m），3.19（1H，m），3.00（4H，m）；13C-NMR（100 MHz，90%H2O+10%D2O）δ ppm：173.53，169.27，155.51，144.68，143.91，125.44，124.07，62.19，56.38，53.42，45.67，37.45。MS-ESI(–)：547.0。
顺磁标签DTPA-CH2S-SPy的应用
用来连接标签的蛋白质是15N标记的人体泛素蛋白质ubiquitin(Ubi)的突变体：ubiquitin G47C，利用突变体的半胱氨酸巯基与顺磁标签的二硫键进行交换达到连接的目的，图3为蛋白质与顺磁标签的连接方式。具体连接过程如下：
（1）：配置50 mM的DTPA-CH2S-SPy标签溶液：定量称取，加入MQ超纯水，溶解。
（2）：将蛋白质逐渐滴加到五倍量的标签溶液中，保证反应pH为7.0左右，反应1~2h，过PD10脱盐柱，除去小分子，得到最终产物即连上标签的蛋白质溶液，若标签无法除干净，可以通过DEAE阴离子交换柱进行分离。
采集NMR核磁数据的蛋白质样品浓度统一为0.1 mM，其中含10%的氘代水(D2O)溶液，所用缓冲液为pH 6.4的MES，总体积为550 ul。
所有核磁实验都是在温度为25℃下，Bruker-600MHz核磁仪器QCI-超低温探头上采集的。
顺磁标签DTPA-CH2S-SPy可以螯合镧系金属离子生成稳定的络合物，通过二硫键交换的方式定点连接到目标蛋白质上。该标签具有以下几个方面的优势：(1)体积较小；(2)没有手性；(3)与镧系金属有八个配位点；(4) 连接到蛋白质上很刚性；(5) 与蛋白质不存在非特异性作用；(6) 在低pH下仍然可以使用；（7）和蛋白质连接，滴加镧系金属离子后有很大的PCS和RDC。
附图说明
图1为已经报道的顺磁标签的化学结构式；
图2为DTPA-CH2S-SPy的合成路线；
图3为蛋白质与顺磁标签的连接方式；
图4为25℃，pH=6.4条件下，0.1 mM ubiquitin G47C与0.1 mM复合物ubiquitin G47C-DTPA重叠谱图；
图5为25℃，pH=3.0条件下，0.1 mM ubiquitin G47C与0.1 mM复合物ubiquitin G47C-DTPA重叠谱图；
图6为25℃，pH=6.4条件下，1.0倍量的顺磁或逆磁金属离子分别滴加到0.10 mM的复合物ubiquitin G47C-DTPA蛋白质中的1H-15N HSQC重叠谱图；
图7为25℃，pH=3.0条件下，1.0倍量的顺磁或逆磁金属离子分别滴加到0.10 mM的复合物ubiquitin G47C-DTPA蛋白质中的1H-15N HSQC重叠谱图。
具体实施方式
实施例1 合成标签
（1）S-三苯甲基-L-半胱氨酸，即图2中化合物7的合成
将L-半胱氨酸盐酸盐10.0g（63.50mmol），三苯基氯甲烷15.80g（56.68mmol），DMF 75.0ml，加入250ml单口瓶中，室温搅拌20-30h，将其倒入10%的NaOAc溶液中，有白色固体析出，过滤，去离子水洗涤滤饼，将滤饼加入无水丙酮中重结晶，冷却后过滤，滤饼分别用无水丙酮和无水乙醚洗涤，红外干燥，得白色粉末7.21g，产率：34.8%。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ ppm：7.24-7.37（15H，m），2.92（1H，dd，J = 9.2Hz，4.2Hz），2.58（1H，dd，J = 12.5Hz，4.2Hz），2.40（1H，dd，J = 12.5Hz，9.2Hz）。
（2）S-三苯甲基-L-半胱氨酸叔丁酯，即图2中化合物8的合成
将7 1.51g（4.16mmol），乙酸叔丁酯24.5ml加入100ml三口瓶中，滴加70% HClO4 1.2ml，滴加完毕，室温搅拌4-7h，停止反应，加入乙酸乙酯，用1M NaHCO3溶液调pH至弱碱性，上层有白色沉淀析出，过滤，分去水层，分别用0.5M HCl，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，得白色泡状固体1.61g，产率：92.5%。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ ppm：8.50（2H，s），7.20-7.40（15H，m），3.72（1H，t，J = 5.8Hz），2.56（2H，m），1.39（9H，s）。
（3）N-(2-溴乙基)亚氨基二乙酸二叔丁酯，即图2中化合物9的合成
将溴乙酸叔丁酯15.00g（75.00mmol），DMF 25.0ml，DIEA 17.5ml（100.00mmol）加入250ml单口烧瓶中，逐滴滴加溶有2-溴乙胺氢溴酸盐5.00g（25.00mmol）的25.0ml DMF，滴加过程中有白色固体析出，20-40℃搅拌18h，旋干溶剂，加入乙酸乙酯，过滤，分别用水，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得无色油状物7.40g，产率：84.3%。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ ppm：3.42（4H，s），3.38（2H，t，J = 7.6Hz），3.08（2H，t，J = 7.6Hz），1.41（18H，s）.
（4）S-三苯甲基-N,N´-二[2-N,N´-二（叔丁氧羰基甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸叔丁酯，即图2中化合物10的合成
将8 3.00g（7.16mmol），9 4.3g (28.64mmol)，乙腈40.0ml，DIEA 7.2ml（42.96mmol）加入100ml三口瓶中，加热60-80℃48h，旋干溶剂，加入乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得浅黄色油状物1.81g，产率：26.3%。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ ppm：7.14-7.40（15H，m），3.39（8H，s），2.96（1H，m），2.65（4H，m），2.58（4H，m），2.45（1H，m），2.33（1H，m），1.41（36H，s），1.35（9H，s）. 13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ ppm：170.93，170.64，144.98，129.67，127.93，127.84，126.48，81.03，80.70，66.62，64.49，56.14，54.21，50.62，32.05，28.18.
（5）N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸，即图2中化合物11的合成
将101.3g（1.35mmol），二氯甲烷15.0ml，三乙基硅烷1.3ml（8.10mmol）加入100ml三口瓶中，滴加三氟乙酸15.0ml，用时60min，室温搅拌12h，旋干溶剂，加入15.0ml 2M的氯化氢乙醚溶液，室温搅拌5min，旋干溶剂，加入20.0ml无水乙醚，搅拌5min，静置，过滤，用无水乙醚洗涤滤饼，得白色粉末0.50g，产率：84.7%。
（6）S-2-硫代吡啶基-N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸，即图2中化合物12的合成
将2,2’-二巯基吡啶0.75g（3.40mmol）溶于30.0ml无水甲醇中，无色澄清溶液，滴加溶有110.30g（0.68mmol）的无水甲醇100.0ml。滴加完毕后25-40℃继续搅拌3h，旋干溶剂，得黄色油状物，加入无水甲醇溶解，再加入无水乙腈，有沉淀析出，浅黄色浑浊体系，室温搅拌过夜，过滤，无水乙腈，无水乙醚洗涤滤饼，得白色粉末0.36g，产率：97.3%。1H-NMR（400 MHz，90%H2O+10%D2O）δ ppm：8.52（1H，s），8.22（1H，t，J = 7.8Hz），8.07（1H，d，J = 7.8Hz），7.63（1H，s），3.91（8H，s），3.76（1H，m），3.40（4H，m），3.24（1H，m），3.19（1H，m），3.00（4H，m）；13C-NMR（100 MHz，90%H2O+10%D2O）δ ppm：173.53，169.27，155.51，144.68，143.91，125.44，124.07，62.19，56.38，53.42，45.67，37.45。MS-ESI(–)：547.0。
实施例2 顺磁标签DTPA-CH2S-SPy的应用
用来连接标签的蛋白质是15N标记的人体泛素蛋白质ubiquitin(Ubi)的突变体：ubiquitin G47C，利用突变体的半胱氨酸巯基与顺磁标签的二硫键进行交换达到连接的目的，图3为蛋白质与顺磁标签的连接方式。具体连接过程如下：
（1）：配置50 mM的DTPA-CH2S-SPy标签溶液：定量称取，加入MQ超纯水，溶解。
（2）：将蛋白质逐渐滴加到五倍量的标签溶液中，保证反应pH为6.4左右，反应1~2h，过PD10脱盐柱，除去小分子，得到最终产物即连上标签的蛋白质溶液，若标签无法除干净，可以通过DEAE阴离子交换柱进行分离。
采集NMR核磁数据的蛋白质样品浓度统一为0.1 mM，其中含10%的氘代水(D2O)溶液，所用缓冲液为pH 6.4的MES，总体积为550 ul。
所有核磁实验都是在温度为25℃下，Bruker-600MHz核磁仪器QCI-超低温探头上采集的。
实施例3 顺磁标签DTPA-CH2S-SPy的应用
反应pH为3.0，其余步骤同实施例2。
实施例2和实施例3的结果如图4、5、6和7所示：
图4为25℃，pH=6.4条件下0.1 mM ubiquitin G47C与0.1 mM复合物ubiquitin G47C-DTPA的1H-15N HSQC重叠谱图，灰色表示复合物ubiquitin G47C-DTPA的谱图。谱图中所标记的氨基酸残基是蛋白质连接标签后发生化学位移较大的残基，这说明，大部分氨基酸残基重叠良好，只有G47C附近的氨基酸残基有较大的变化，说明顺磁标签的引入，对蛋白质结构没有造成太大的影响。
图5为25℃，pH=3.0条件下0.1 mM ubiquitin G47C与0.1 mM复合物ubiquitin G47C-DTPA的1H-15N HSQC重叠谱图，灰色表示复合物ubiquitin G47C-DTPA的谱图。谱图中所标记的氨基酸残基是蛋白质连接标签后发生化学位移较大的残基，这说明，顺磁标签的引入，对蛋白质结构没有造成太大的影响。
图6和图7分别为在25℃，pH=6.4和pH=3.0条件下向ubiquitin G47C-DTPA复合物中滴加顺磁及逆磁金属离子的1H-15N HSQC重叠谱图，灰色表示加入的逆磁Y3+，黑色表示加入的顺磁Tb3+，每张图上面选择了几个氨基酸残基进行标记，灰色峰和黑色峰在H维的差值即为赝接触化学位移值（PCS）。从谱图中可以看出，不管是在pH=6.4，还是在pH=3.0条件下，都有很大的PCS。

Claims (4)

1.用于蛋白质顺磁标记的DTPA类似物的设计与合成，其特征是，合成的所述DTPA类似物为S-2-硫代吡啶基-N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸，其结构表征如下：1H-NMR（400 MHz，90%H2O+10%D2O）δ ppm：8.52（1H，s），8.22（1H，t，J = 7.8Hz），8.07（1H，d，J = 7.8Hz），7.63（1H，s），3.91（8H，s），3.76（1H，m），3.40（4H，m），3.24（1H，m），3.19（1H，m），3.00（4H，m）；13C-NMR（100 MHz，90%H2O+10%D2O）δ ppm：173.53，169.27，155.51，144.68，143.91，125.44，124.07，62.19，56.38，53.42，45.67，37.45，MS-ESI(–)：547.0。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质顺磁标记的DTPA类似物的设计与合成，其特征是，所述的S-2-硫代吡啶基-N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸的合成步骤为：（1）用三苯基氯甲烷保护L-半胱氨酸盐酸盐的巯基得到S-三苯甲基-L-半胱氨酸，（2）70% HClO4作为催化剂，S-三苯甲基-L-半胱氨酸与乙酸叔丁酯反应得到S-三苯甲基-L-半胱氨酸叔丁酯，（3）2-溴乙胺盐酸盐与溴乙酸叔丁酯反应得到N-(2-溴乙基)亚氨基二乙酸二叔丁酯，（4）S-三苯甲基-L-半胱氨酸叔丁酯与N-(2-溴乙基)亚氨基二乙酸二叔丁酯反应生成S-三苯甲基-N,N´-二[2-N,N´-二（叔丁氧羰基甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸叔丁酯，（5）用三氟乙酸将S-三苯甲基-N,N´-二[2-N,N´-二（叔丁氧羰基甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸叔丁酯水解脱保护得到N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸，（6）用2,2’-二巯基吡啶将N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸巯基进行活化得到S-2-硫代吡啶基-N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的用于蛋白质顺磁标记的DTPA类似物的设计与合成，其特征是，所述的化合物S-2-硫代吡啶基-N,N´-二[2-N,N´-二（羧甲基）氨基乙基]-L-半胱氨酸可以应用于蛋白质顺磁标记。
4.根据权利要求2所述的用于蛋白质顺磁标记的DTPA类似物的设计与合成，其特征是，所述的步骤（1）为将L-半胱氨酸盐酸盐10.0g（63.50mmol），三苯基氯甲烷15.80g（56.68mmol），DMF 75.0ml，加入250ml单口瓶中，室温搅拌20-30h，将其倒入10%的NaOAc溶液中，有白色固体析出，过滤，去离子水洗涤滤饼，将滤饼加入无水丙酮中重结晶，冷却后过滤，滤饼分别用无水丙酮和无水乙醚洗涤，红外干燥，得白色粉末；所述步骤（2）为将7 1.51g（4.16mmol），乙酸叔丁酯24.5ml加入100ml三口瓶中，滴加70% HClO4 1.2ml，滴加完毕，室温搅拌4-7h，停止反应，加入乙酸乙酯，用1M NaHCO3溶液调pH至弱碱性，上层有白色沉淀析出，过滤，分去水层，分别用0.5M HCl，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，得白色泡状固体；所述步骤（3）为将溴乙酸叔丁酯15.00g（75.00mmol），DMF 25.0ml，DIEA 17.5ml（100.00mmol）加入250ml单口烧瓶中，逐滴滴加溶有2-溴乙胺氢溴酸盐5.00g（25.00mmol）的25.0ml DMF，滴加过程中有白色固体析出，20-40℃搅拌18h，旋干溶剂，加入乙酸乙酯，过滤，分别用水，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得无色油状物；所述步骤（4）为将8 3.00g（7.16mmol），9 4.3g (28.64mmol)，乙腈40.0ml，DIEA 7.2ml（42.96mmol）加入100ml三口瓶中，加热60-80℃48h，旋干溶剂，加入乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得浅黄色油状物；所述步骤（5）为将10 1.3g（1.35mmol），二氯甲烷15.0ml，三乙基硅烷1.3ml（8.10mmol）加入100ml三口瓶中，滴加三氟乙酸15.0ml，用时60min，室温搅拌12h，旋干溶剂，加入15.0ml 2M的氯化氢乙醚溶液，室温搅拌5min，旋干溶剂，加入20.0ml无水乙醚，搅拌5min，静置，过滤，用无水乙醚洗涤滤饼，得白色粉末；所述步骤（6）为将2,2’-二巯基吡啶0.75g（3.40mmol）溶于30.0ml无水甲醇中，无色澄清溶液，滴加溶有11 0.30g（0.68mmol）的无水甲醇100.0ml，滴加完毕后25-40℃继续搅拌3h，旋干溶剂，得黄色油状物，加入无水甲醇溶解，再加入无水乙腈，有沉淀析出，浅黄色浑浊体系，室温搅拌过夜，过滤，无水乙腈，无水乙醚洗涤滤饼，得白色粉末。
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