CN105938114B - 一种用于蛋白质顺磁标记的探针及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于蛋白质顺磁标记的探针，所述探针为二乙烯三胺四乙酸的衍生物，化学结构式为本发明的优点是：所述探针体积小，刚性连接，对蛋白质的结构和功能影响小；具有优良的对称性，使得其连接蛋白后的构象简单，更有利于蛋白质动态学的精确解析；探针合成方法，反应简便，步骤简单，时间短。

Description

一种用于蛋白质顺磁标记的探针及其合成方法
技术领域
本发明属于蛋白质顺磁标记领域，具体涉及一种二乙烯三胺四乙酸衍生物的探针及其合成方法。
背景技术
蛋白质的结构和动态学特征是其行使功能的重要基础。获得高分辨的蛋白质结构和动态学特征对了解生命的运动、疾病的机制、药物的开发等有着十分重要的意义。顺磁探针常常被引入到蛋白质体系中，利用顺磁中心的未配对电子与蛋白质分子自旋核的相互作用来提供丰富的长程结构限制信息，如顺磁弛豫增强(paramagnetic relaxationenhancement，PRE)、伪接触化学位移(pseudocontact shifts，PCS)等，利用这些顺磁信息来观察生物大分子的结构和动态学的特征。溶液顺磁弛豫增强(Solvent paramagneticrelaxation enhancement，sPRE)技术是近几年发展起来的一种新方法。它是将顺磁探针均匀地分布在溶液中，通过探针上顺磁中心的未配对电子与蛋白质原子核的偶极一偶极相互作用引起核的弛豫速率加快，即sPRE效应。通过sPRE效应可以用来观察蛋白质上核到蛋白质表面的距离，从而解析蛋白质结构和空间的变化。
已有研究发现通过引入非天然氨基酸可以使得点击化学以及水环境下的多种偶联反应能更好的应用在蛋白质连接上。
发明内容
本发明的目的是基于上述溶液顺磁弛豫增强技术和引入非天然氨基酸的基础上，提供一种用于蛋白质顺磁标记的探针及其合成方法，该探针在结构上具有优良的对称性，使得其连接蛋白质后的构象简单，更加有利于蛋白质动态学的精确解析。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于蛋白质顺磁标记的探针，所述探针为二乙烯三胺四乙酸的衍生物，化学结构式为
其合成路线如图1所示，具体合成方法，包括以下步骤，
a)二乙基三胺四乙酸四叔丁酯，结构式为与4-溴-1-丁炔进行反应，生成结构式为的中间产物II；
b)将中间产物II在三氟醋酸中脱去叔丁基，得到结构式为
的二乙烯三胺四乙酸衍生物。
优选地，步骤a)为1当量的二乙基三胺四乙酸四叔丁酯与2-10当量的4-溴-1-丁炔溶于80-300当量的DMF中，加入1-3当量的KHCO3，60-80℃，用搅拌器进行搅拌反应2天，过滤，收集滤液，旋转蒸发，除去溶剂，硅胶柱层析后，得到中间产物II；所述步骤b)为1当量的中间产物II与50当量的三氟醋酸进行加热回流反应过夜，过滤，旋转蒸发，除去溶剂，用乙醚洗涤，得到结构式为
的最终产物。
优选地，所述硅胶柱层析用体积比为5∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合液洗脱。
优选地，所述搅拌器为磁力温控搅拌器。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1、本发明的探针体积小，刚性连接，对蛋白质的结构和功能影响小。
2、本发明的探针具有优良的对称性，使得其连接蛋白后的构象简单，更有利于蛋白质动态学的精确解析。
3、本发明的探针合成方法，反应简便，步骤简单，时间短。
附图说明
图1为本发明所述的探针合成路线；
图2为本发明所述的探针的质谱图；
图3为本发明所述的探针与非天然氨基酸标记的泛素蛋白Ub18pAzF反应后产物的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例子对本发明做进一步详细说明。
本发明涉及到的术语解释如下：
DMF：富马酸二甲酯；4-Bromo-1-Butyne：4-溴-1-丁炔；TFA：三氟醋酸；TBTA：叔丁基2，2，2-三氯亚氨逐乙酸酯；TCEP：三(2-羧乙基)膦；二乙基三胺四乙酸四叔丁酯：
一种用于蛋白质顺磁标记的探针，该探针为二乙烯三胺四乙酸的衍生物，化学结构式为
实施例1
取1当量二乙基三胺四乙酸四叔丁酯与2当量4-溴-1-丁炔溶于100当量DMF中，加入1.2当量的KHCO3，60-80℃，用搅拌器进行搅拌反应2天，过滤收集滤液，进行旋转蒸发，除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝5∶1洗脱)，得到相应的中间产物II
然后将所得到的1当量的中间产物II与50当量的三氟醋酸中回流反应过夜，过滤，进行旋转蒸发，除去溶剂，再用乙醚洗涤，得到对应的最终产物经过ESI-MS检测，计算值[M-H]＝386.164，实验值386.168。
实施例2
取1当量二乙基三胺四乙酸四叔丁酯与6当量的4-溴-1-丁炔溶于200当量DMF中，加入20当量的KHCO3，用搅拌器进行搅拌反应2天，过滤收集滤液，进行旋转蒸发，除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝5∶1洗脱)，得到中间产物II
将所得到的1当量的中间产物II与50当量的三氟醋酸中回流反应过夜，过滤，进行旋转蒸发，除去溶剂，再用乙醚洗涤，得到对应的最终产物经过ESI-MS检测，计算值[M-H]＝386.164，实验值386.168。
实施例3
取1当量二乙基三胺四乙酸四叔丁酯与10当量的4-溴-1-丁炔溶于150当量DMF中，加入2当量的KHCO3，用搅拌器进行搅拌反应2天，过滤收集滤液，进行旋转蒸发，除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝5∶1洗脱)，得到中间产物II
将所得到的1当量的中间产物II与50当量的三氟醋酸中回流反应过夜，过滤，进行旋转蒸发，除去溶剂，再用乙醚洗涤，得到对应的最终产物经过ESI-MS检测，计算值[M-H]＝386.164，实验值386.168。
应用实施例1
将探针运用于非天然氨基酸标记的泛素蛋白Ub18pAzF中，将探针与100uM的Ub18pAzF蛋白(分子量：8727)，500uM探针、加入1mM CusO4，0.1mM TBTA，1mM TCEP，25℃反应2h。用离子交换柱分离纯化获得标记上探针的Ub18pAzF(分子量：9172)。图3为该反应后产物的质谱图，其去卷积以后的分子量9172与理论分子量9172一致，表明探针以连接在了蛋白上。

Claims (4)

1.一种用于蛋白质顺磁标记的探针的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
a)二乙基三胺四乙酸四叔丁酯，结构式为与4-溴-1-丁炔进行反应，生成结构式为的中间产物II；b)将中间产物II在三氟醋酸中脱去叔丁基，得到结构式为的二乙烯三胺四乙酸的衍生物，即为探针。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质顺磁标记的探针的合成方法，其特征在于：所述步骤a)为1当量的二乙基三胺四乙酸四叔丁酯与2-10当量的4-溴-1-丁炔溶于80-300当量的DMF中，加入1-3当量的KHCO3，60-80℃，用搅拌器进行搅拌反应2天，过滤，收集滤液，旋转蒸发，除去溶剂，硅胶柱层析后，得到中间产物II；所述步骤b)为1当量的中间产物II与50当量的三氟醋酸进行加热回流反应过夜，过滤，旋转蒸发，除去溶剂，用乙醚洗涤，得到结构式为的最终产物。
3.根据权利要求2所述的用于蛋白质顺磁标记的探针的合成方法，其特征在于：所述硅胶柱层析用体积比为5∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合液洗脱。
4.根据权利要求2所述的用于蛋白质顺磁标记的探针的合成方法，其特征在于：所述搅拌器为磁力温控搅拌器。
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