CN104610138A - 用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法，所述乙二胺四乙酸类探针的化学名称为4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）- N,N′, N′-三乙酸，化学结构式为。本发明的优点是：具有六个配位点的EDTA系列探针，通过苯砜基与蛋白质巯基的反应连接，可直接用于蛋白质标记，如图4。此外，该探针齿合度高、螯合性好、体积较小、刚性稳定、水溶性好，与顺磁金属离子配位后整体呈现电中性，避免了与蛋白质的一些非特异性静电相互作用的发生。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质顺磁标记领域，特别是一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法。
背景技术
近年来，高分辨顺磁核磁共振在生物大分子等结构生物学的研究中发挥的作用日益重要。此技术通过顺磁中心的未配对电子与蛋白质分子自旋核的相互作用来提供丰富的长程结构限制信息，如顺磁弛豫增强（paramagnetic relaxation enhancement，PRE）、贋接触化学位移（pseudocontact shifts，PCS）、残余偶极耦合（residual dipolar couplings，RDC)，利用这些顺磁信息，我们可以进一步研究生物大分子的空间结构、生物功能以及分子之间的相互作用（(a) J. Biomol. NMR, 2010, 46: 101-112. (b) Annu Rev Biophys, 2010, 39:
387-405. (c) Chem Rev, 2009, 109(9): 4108-4139. (d) Prog NMR Spectr, 2002, 40: 249-273）。
由于大多数蛋白质没有顺磁中心，为获得上述顺磁信息就需要借助合适的双功能顺磁探针，并通过与蛋白质定点连接来实现。连接后，由于顺磁效应，顺磁中心附近氨基酸残基的化学环境会发生较大的变化，导致核磁共振谱峰的化学位移亦发生明显改变，进而得到PCS、PRE或RDC等相关顺磁数据。由此看来，双功能顺磁探针的设计与合成在蛋白质顺磁研究中尤为重要（Chinese J Magn Reson, 2014, 31(2), 155-171）。
通过有机化学手段合成的双功能顺磁探针通常由以下两个不同的单元构成：1）一个具有很强金属离子螯合性能的基团；2）一个可与蛋白质定点连接的活性反应基团。前者可以螯合具有不同顺磁物理特性的金属离子（如镧系金属离子，过渡金属离子），即顺磁中心；后者与蛋白质上唯一的活性氨基酸残基（如半胱氨酸、非天然氨基酸）反应，可达到对蛋白质定点选择性标记的目的，从而进一步用于蛋白质顺磁研究。
为获得良好的顺磁数据，在设计探针时，含有多氨基多羧基的螯合配体常被用作为理想顺磁探针的基本骨架。从探针的骨架结构出发，又可将其划分为两大类，一类以非环状结构的乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、2,6-吡啶二甲氨基-N,N,N´,N´-四乙酸（PyMTA）等衍生物为主，另一类以环状结构的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）等衍生物为主，这些探针均可与顺磁金属离子配位形成热力学稳定的配合物。图1中列出了已报道的部分代表性的顺磁探针。
Gaponenko等人（J. Biomol. NMR, 2002, 24: 143–148）将已商业化的EDTA系列探针，即图1中的化合物L-1，通过活化巯基的方法定点标记到目标蛋白质。其中，EDTA作为配位化学中应用广泛的有机螯合配体，可与金属离子稳定结合。他们使用此探针在滴加Co2+和Yb3+后，成功获得了PCS和RDC数据，并得到溶液中对称二聚体蛋白质中每个单体的结构信息。
Prudêncio等人（Chem. Eur. J., 2004, 10: 3252–3260）报道了DTPA系列探针，即图1的化合物L-2，此类探针具有8个螯合位点且与顺磁金属离子形成非常稳定的配合物。此外，它包含两个活性巯基，由DTPA双酸酐与S-(2-氨乙基)甲基硫代磺酸反应得到，可以和目标蛋白质上距离8~10Å的两个半胱氨酸残基同时反应，生成两个二硫键，从而增强了探针的刚性，限制了探针与蛋白质间的相对运动，避免了PCS平均化，但两个半胱氨酸残基的位置需仔细斟酌，含有多个半胱氨酸的蛋白质在表达和纯化过程中也有可能二聚或沉淀。在与蛋白质连接，滴加顺磁金属离子后，其NMR谱图至少有5套信号峰，HSQC谱图非常复杂，难于分析。故此探针常用于获得PRE作为限制条件来研究蛋白质结构。
Graham等人（Bioconjugate Chem. 2011, 22, 2118–2125）报道了DOTA大环类探针，即图1中的化合物L-3，这种大环化合物具有较为特殊的空间构象，可与顺磁金属离子形成高配位化合物，对称性高，结合紧密，具有高度热力学稳定性，可有效减少非特异性反应发生，获得较大的PCS，但形成配合物的过程较为缓慢，通常需要长时间的加热或回流才能制备。相比之前的DOTA类探针，它在氮原子上引入了手性官能团，可获得更好的动力学惰性和更少的非对映异构体，即环上氮原子与金属离子配位后不会表现出手性问题，避免出现多套峰而造成NMR谱图复杂化。
Su等人（Chem . Eur . J . 2013,
19, 1097–1103）报道了化合物4VPyMTA，即图1中的化合物L-4。此探针自身具有高化学稳定性，通过活性双键与蛋白质中的巯基选择性反应连接。它具有七个螯合位点，可与顺磁金属离子形成七配位化合物，结合非常紧密。尽管它与巯基的反应速率较慢，但在多数情况下，它更具有选择性，且连接后非常稳定，可用于原位分析蛋白结构。此外，它刚性强，与金属离子配位后构象单一，不存在手性问题，可获得干净和高品质的顺磁核磁谱图，便于数据分析。
综上，在设计与合成一个性能优越的双功能顺磁探针时，需综合考虑以下几方面：
1）对顺磁金属离子具有很强的螯合能力。顺磁金属离子一般可形成多配位化合物，其中镧系金属离子的配位数高达8-9个，因此顺磁探针需要有多个螯合位点与之结合，使顺磁中心刚性增强，提高NMR谱图的分辨率。此外，被螯合金属离子应接近蛋白质表面，距离太远将不利于蛋白质顺磁核磁研究。
2）体积较小，刚性连接。若顺磁探针体积较大，会因空间位阻等原因造成连接效率低或无法连接，在一定程度上也会影响蛋白质的结构与功能；若与蛋白质连接后刚性不强，对蛋白质会出现相对运动，则会造成PCS和RDC明显降低。
3）没有手性，构象单一。顺磁探针和顺磁金属离子配位后若产生多个非对映异构体，NMR谱图中会因出现多套峰，导致谱图复杂而难以分析。
4）水溶性良好。水溶性好的顺磁探针能更好的在生理条件下对蛋白质进行定点修饰。
当然，对顺磁探针而言，与蛋白质连接一端活性基团的优化也极为重要，在以往的研究中，通过二硫键将含有活化巯基的探针与蛋白质连接的方法应用最为广泛（J. Am. Chem. Soc., 2009, 131: 14761–14767）。此外，巯基与缺电子烯烃的硫醇烷基化也能达到很好的连接效果，同时也突破了二硫键连接时连接产物在还原条件下不稳定的限制（Chem. Eur. J. 2013, 19, 1097 – 1103）。非天然氨基酸的引入使得点击化学（Bioconjugate Chem., 2013, 24: 260–268）以及水环境下的多种偶联反应（J. Am. Chem. Soc., 2013, 135, 13612−13615）能更好的应用于蛋白质连接，为蛋白质连接技术注入新鲜活力。图2为部分已报道的蛋白连接方式。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法，该探针具有六个配位点的EDTA系列探针，通过苯砜基与蛋白质巯基的反应连接，齿合度高、螯合性好、体积较小、刚性稳定、水溶性好；与顺磁金属离子配位后整体呈现电中性，可直接用于蛋白质标记。
本发明的技术方案：
一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法，所述乙二胺四乙酸类探针的化学名称为4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）-
N,N´, N´-三乙酸，化学结构式为
，
其合成步骤如下：
1）2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
将2,6-二甲基吡啶、双氧水和冰乙酸按用量比1g:1.8mL:5mL混合，在60-90℃下反应5-10h，旋干溶剂，冰水浴下用饱和碳酸钾溶液调pH至9-10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色油状液体2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
2）4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
将上述2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、浓度为98wt%的硫酸和浓度为98wt%的硝酸按用量比1g:3mL:3.5mL混合，加热回流反应5-10h，按2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在水浴下用无水碳酸钾调pH至9-10，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色粉末状固体4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
3）4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
将上述4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、乙酰溴和冰乙酸按用量比1g:10mL:14.5mL混合，在60℃-90℃下反应6-13h，按4-硝基-2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在冰水浴下用无水碳酸钾调pH至9-10，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色固体4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
4）4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶的合成
将上述4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、三氟乙酸酐和二氯甲烷按用量比1g:4.5mL:13mL混合，加热回流反应15-20h，旋干溶剂，按4-溴-2-甲基吡啶-N-氧化物与饱和碳酸钾溶液用量比为1g:18mL加入饱和碳酸钾溶液，室温下搅拌2-5h，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色固体4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶；
5）4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐的合成
将上述4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶、氯化亚砜和二氯甲烷按用量比1g:1mL:10mL混合，加热回流反应3-6h，旋干溶剂，用无水乙醚洗涤残留物，红外干燥后，得到黄绿色粉末状固体4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐；
6）N-（4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶）乙二胺的合成
将上述4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐、乙二胺和无水乙腈按质量体积比1g:4.3mL:35.7mL混合，接干燥管，室温搅拌下反应20-30h，过滤并旋干溶剂，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和碳酸钾溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得棕黄色油状液体N-(4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶)乙二胺；
7）4-溴-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶的合成
将上述N-（4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶）乙二胺、无水碳酸钾、溴乙酸乙酯和无水乙腈按用量比1g:4.5g:4mL:43.8mL混合，氩气保护下室温搅拌反应20-30h，经过滤并将滤液浓缩至干，柱分离后，得到红棕色油状物液体4-溴-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶；
8）4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶的合成
将上述4-溴-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶、苯亚磺酸钠、四丁基溴化铵和无水乙腈按用量比1g:1.3g:0.08g:33.3mL混合，氩气保护下在60-80℃下反应13-20h，溶剂旋干，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离后，得到淡黄色油状液4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶；
9）4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）-
N,N´, N´-三乙酸的合成
将上述4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶、氢氧化钠、无水乙醇和蒸馏水按用量比1g:0.43g:7.3mL:7.3mL混合，室温下搅拌反应5-10h，分批少量加入H+离子交换树脂调pH至3-4，用无水甲醇洗涤树脂至无荧光，过滤后将滤液浓缩至干，得乳白色固体4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）-
N,N´, N´-三乙酸。
本发明的优点是：具有六个配位点的EDTA系列探针，通过苯砜基与蛋白质巯基的反应连接，可直接用于蛋白质标记，如图4。此外，该探针齿合度高、螯合性好、体积较小、刚性稳定、水溶性好，与顺磁金属离子配位后整体呈现电中性，避免了与蛋白质的一些非特异性静电相互作用的发生。
附图说明
图1为部分已报道顺磁探针的化学结构式。
图2为部分已报道的蛋白连接方式。
图3为25℃，pH=7.2条件下，该探针与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR 谱图。
图4为25℃，pH=7.2条件下，该探针1H-NMR峰强度随时间变化曲线图，即T2的动力学反应曲线。
图5为人体泛素蛋白-T22C/G47C（T和C均为蛋白质中氨基酸的编号）双突变体与探针T2连接前后的1H-15N
HSQC重叠图。
图6为人体泛素蛋白-T22C-T2/G47C-T2复合物与Gd3+滴定前后的1H-15N HSQC重叠图。
图7为人体泛素蛋白-T22C-T2/G47C-T2复合物与Mn2+滴定前后的1H-15N HSQC重叠图。
具体实施方式
实施例：
一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法，所述乙二胺四乙酸系列探针的化学名称为4-苯砜基-2-甲基-6-亚甲基吡啶-（N-乙二胺基）- N,N´，N´-三乙酸，化学结构式为
，
其合成步骤如下：
1）2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
在250mL三口瓶中，将10 g 2,6-二甲基吡啶、9mL双氧水和50mL冰乙酸混合，在70℃下反应4h，随后立即加入另一半9mL H2O2，继续反应6h，呈现淡黄色透明体系，旋干溶剂，冰水浴下用饱和碳酸钾溶液调pH至9，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色油状液体2,6-二甲基吡啶-N-氧化物7.25g。产率：63.10 %。1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：8.31（1H，d，J=7.08 Hz），8.17（1H，d，J=3.02 Hz），7.95（1H，dd，J=7.08 Hz，J=3.02 Hz），2.61（6H，s）。
2）4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
在250mL三口瓶中加入20mL浓度为98wt%的硫酸，冰水浴降温，逐滴滴加7.30g上述2,6-二甲基吡啶-N-氧化物，然后继续滴加25mL浓度为98wt%的硝酸混合，加热回流（T=120℃）反应6h，按2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在水浴下用无水碳酸钾调pH至9，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色粉末状固体4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物7.40g。产率：74.22
%。1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：8.07（2H，s），2.58（6H，s）。
3）4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
在250mL三口瓶中加入35mL冰乙酸和2.40g上述4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物，升温至60℃，逐滴滴加35mL乙酰溴，滴毕，接尾气吸收装置，继续升温至80℃加热，反应6h，体系呈现红棕色，自然冷却至室温。然后按4-硝基-2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在冰水浴下用无水碳酸钾调pH至9，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色固体4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物2.00g。产率：69.44%。1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：7.41（2H，s），2.53（6H，s）。
4）4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶的合成
在250mL三口瓶中加入25mL二氯甲烷，2.00g上述4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物，冰水浴降温，控制体系温度不高于5℃，逐滴滴加8mL三氟乙酸酐，加热回流（T=40℃）15h，体系呈现橙黄色，自然冷却至室温。将反应液浓缩至干，向残余物中加入10mL饱和碳酸钾溶液，室温搅拌2h，体系中有淡黄色固体析出，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩至干，柱分离，得淡黄色固体4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶1.20g。产率：63.16%。1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：7.33（1H，s），7.29（1H，s），4.74（2H，s），2.58（3H，s）。
5）4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐的合成
在250mL三口瓶中将1.20g上述4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶、1.2 mL氯化亚砜和12 mL二氯甲烷在冰水浴降温下混合，撤冰水浴，体系呈现淡黄色浑浊，（T=40℃）4h，旋干溶剂，用无水乙醚洗涤残留物，红外干燥后，得到黄绿色粉末状固体4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐1.40g。产率：93.33%。1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：7.37（1H，s），7.20（1H，s），3.81（2H，s），2.55（3H，s）。
6）N-（4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶）乙二胺的合成
将上述1.40g 4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐、6.00mL乙二胺和50mL无水乙腈在250mL三口瓶中混合，接干燥管，室温搅拌下反应20h，过滤并旋干溶剂，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和碳酸钾溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得棕黄色油状液体N-(4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶)乙二胺0.80g，产率：60.15%。1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：7.57（2H，s），3.91（2H，s），2.85（2H，t，J=5.62 Hz），2.73（2H，t，J=5.62 Hz），2.56（3H，s）。
7）4-溴-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶的合成
将0.80g上述N-（4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶）乙二胺、3.60g无水碳酸钾、3.2mL溴乙酸乙酯和32mL无水乙腈在250mL三口瓶中混合，氩气保护下室温搅拌反应22h，体系呈现淡黄色浑浊，经过滤并将滤液浓缩至干，柱分离后，得到红棕色油状物液体4-溴-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶1.40g。产率：83.84%。1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：7.48（1H，d，J=63.72 Hz），7.13（1H，d，J=69.72 Hz），4.18-4.15（6H，m），3.90（2H，s），3.58（4H，s），3.48（2H，s），2.91-2.86（4H，m），2.51（3H，s），1.30-1.25（9H，m）。
8）4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶的合成
将1.20g上述4-溴-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶、1.56g苯亚磺酸钠、96mg四丁基溴化铵和40mL无水乙腈在100mL三口瓶中混合，氩气保护下在65℃下反应17h，体系颜色变为橙黄色，溶剂旋干，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离后，得到淡黄色油状液4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶0.68g。产率：50.75%。1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ ppm：7.99（2H，d，J=8.64 Hz），7.86（1H，s），7.66-7.64（1H，m），7.58-7.55（2H，m），7.48（1H，s），4.19-4.13（6H，m），4.01（2H，s），3.56（4H，s），3.48（2H，s），2.88-2.85（4H，m），2.60（3H，s），1.29-1.26（9H，m）。
9）4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）-
N,N´, N´-三乙酸的合成
将1.10g上述4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´,
N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶、0.47g氢氧化钠、8.03mL无水乙醇和8.03mL蒸馏水在100ml单口瓶中混合，室温下搅拌反应8h，分批少量加入H+离子交换树脂调pH至3，用无水甲醇洗涤树脂至无荧光，过滤后将滤液浓缩至干，得乳白色固体4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）-
N,N´, N´-三乙酸0.85g。产率：90.73%。1H-NMR（400 MHz，90%H2O+10%D2O）δ ppm：7.89（3H，t，J=7.84 Hz），7.82（H，s），7.64（H，t，J=7.44 Hz），7.53（2H，t，7.80 Hz），4.21（2H，s），3.65（4H，s），3.45（2H，s），3.32-3.22（4H，m），2.55（3H，s）；13C-NMR（100 MHz，90%H2O+10%D2O）δ ppm：173.00，170.68，160.53，154.97，151.83，137.04，135.33，130.00，128.14，121.48，118.95，57.22，56.29，55.08，51.55，50.01，36.69，22.12；MS-ESI（–）：478.0。
该乙二胺四乙酸类探针的合成路线如下：
该乙二胺四乙酸类探针的动力学研究：
该乙二胺四乙酸类探针可以螯合顺磁金属离子生成稳定的络合物，并通过吡啶对位的苯砜基与蛋白质中的巯基选择性反应连接，此种连接方式刚性强，且顺磁中心距离蛋白质表面更近，便于顺磁研究，可得到高分辨的核磁谱图。同时，与顺磁金属离子配位后整体呈现电中性，避免了一些与蛋白质的非特异性静电相互作用的发生。为了研究此类探针与蛋白质的连接效果，我们先采用L-半胱氨酸与探针在接近生理条件下进行反应，并用核磁手段来检测其反应动力学。
该乙二胺四乙酸类探针与蛋白质的连接方式如下：
。
该乙二胺四乙酸类探针与L-半胱氨酸的连接方式如下：
。
为了研究此类探针与蛋白质的连接效果，我们先采用L-半胱氨酸与探针在接近生理条件下进行反应连接，并用核磁手段来检测其反应动力学，具体操作过程如下：
1）配制100.0mM，pH为7.2的L-半胱氨酸溶液1mL（用磷酸盐缓冲液配制）；
2）配制50.0mM的4-苯砜基-2-甲基-6-亚甲基吡啶-（N-乙二胺基）- N,N´, N´-三乙酸探针溶液（用磷酸盐缓冲液配制，含20%D2O），并稀释成1.0mM的溶液，调节pH为7.2，核磁采样，接着加入100.0mM，pH为7.2的L-半胱氨酸溶液（6 equiv）充分混合，间隔5min核磁采样。
上述所有核磁实验都是在温度为25℃下，Bruker-400MHz超导核磁共振谱仪采样。实验数据均用Origin和Corel DRAW软件处理完成。
图3为25℃，pH=7.2条件下，探针与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR 谱图。反应条件：0.45mL 1mM/L的T2，30μL
100mM/L的L-半胱氨酸，pH7.2的磷酸盐缓冲液。（A）1mM/L的T2；（B）混合5min后；（C）混合10 min后；（D）混合15min后；（E）混合20min后；（F）混合25 min后。从谱图中可以看出，随着反应的进行，吡啶环上氢（1H-NMR δ ppm：7.91）的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢（1H-NMR δ ppm：7.16）的峰强度逐渐增强，25min后，反应基本完全。
图4为25℃，pH=7.2条件下，探针1H-NMR峰强度随时间变化曲线图，即动力学反应曲线。I0为反应未开始时的峰强度，It为t时刻的峰强度；
通过动力学研究，我们得到了探针与L-半胱氨酸的连接速率以及对比情况，但仍旧无法确定是否与蛋白质中的半胱氨酸选择性连接。为验证此问题，我们将探针与模式蛋白人体泛素蛋白的双突变体T22C/G47C连接，连接条件均为蛋白质样品，还原剂三(2-羧乙基)膦，探针按浓度比例1:3:8混合，将酸碱度调整为pH 8.0，室温静置反应24小时，使用脱盐柱除去未反应的三(2-羧乙基)膦和探针，得到纯化的蛋白质-探针连接复合物。具体操作过程如下：
1）配制0.1mM的pH为6.4的人体泛素蛋白-T22C/G47C溶液（用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液配制，含10%D2O），采集1H-15N HSQC谱图；
2）配制1.0mM的人体泛素蛋白-T22C/G47C溶液（用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液配制），加入100mM的三(2-羧乙基)膦溶液（3 equiv）充分混合，再加入100.0mM的4-苯砜基-6-甲基2-亚甲基吡啶-（N-乙二胺基）- N,N´, N´-三乙酸探针溶液（8 equiv）充分混合，调节pH为8.0，室温静置反应24小时，使用脱盐柱除去未反应的三(2-羧乙基)膦和探针T2，得到纯化的蛋白质-探针连接复合物。用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（含10%D2O）将连接产物人体泛素蛋白-T22C-T2/G47C-T2稀释至0.1mM ，调节pH为6.4，采集1H-15N HSQC谱图；
3）配制0.1mM，pH为6.4的人体泛素蛋白-T22C-T2/G47C-T2溶液（用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液配制），加入10mM的硝酸钆溶液（1 equiv）充分混合，采集1H-15N HSQC谱图。
4）配制0.1mM，pH为6.4的人体泛素蛋白-T22C-T2/G47C-T2溶液（用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液配制），加入10mM的氯化锰溶液（1 equiv）充分混合，采集1H-15N HSQC谱图。
上述所有核磁实验都是在温度为25℃下，Bruker-600MHz超导核磁共振谱仪采样。实验数据均用Topspin、Sparky和Corel
DRAW软件处理完成。
图5为蛋白质人体泛素蛋白-T22C/G47C双突变体与探针连接前后的1H-15N HSQC重叠图。黑色为连接前0.1mM 人体泛素蛋白-T22C/G47C的1H-15N HSQC谱图，灰色为连接后0.1mM 人体泛素蛋白-T22C-T2/G47C-T2的1H-15N HSQC谱图。
图中表明：半胱氨酸残基T22C和G47C对应的谱峰均发生了非常明显的化学位移变化，其他观察到一定化学位移变化的残基也都位于上述两个半胱氨酸残基附近，表明探针能够位点特异性地与蛋白质分子中的半胱氨酸残基连接。
图6为人体泛素蛋白-T22C-T2/G47C-T2复合物与Gd3+滴定前后的1H-15N HSQC重叠图。黑色为0.1mM 人体泛素蛋白-T22C-T1/G47C-T1的1H-15N HSQC谱图，灰色为0.1mM 人体泛素蛋白-T22C-T1-Gd3+/G47C-T1-Gd3+的1H-15N HSQC谱图。
图中表明：金属离子Gd3+能产生顺磁弛豫增强效应，使空间结构中位于其附近的残基的谱峰线宽变宽，峰强减弱，且与距离正相关。谱峰强度减弱的残基位于T22C和G47C附近，这表明探针能够与顺磁离子特异性螯合，形成稳定的蛋白-探针-金属复合物，应用于顺磁核磁和电子磁共振等研究。
图7为人体泛素蛋白-T22C-T2/G47C-T2复合物与Mn2+滴定前后的1H-15N HSQC重叠图。黑色为0.1mM 人体泛素蛋白-T22C-T1/G47C-T1的1H-15N HSQC谱图，灰色为0.1mM 人体泛素蛋白-T22C-T1-Mn2+/G47C-T1-Mn2+的1H-15N HSQC谱图。
图中表明：金属离子Mn2+均能产生顺磁弛豫增强效应，使空间结构中位于其附近的残基的谱峰线宽变宽，峰强减弱，且与距离正相关。谱峰强度减弱的残基位于T22C和G47C附近，这表明探针能够与过渡金属离子特异性螯合，形成稳定的蛋白-探针-金属复合物，应用于顺磁核磁和电子磁共振等研究。
Claims (1)
1.一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法，其特征在于：所述乙二胺四乙酸类探针的化学名称为4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）- N,N´, N´-三乙酸，化学结构式为
，
其合成步骤如下：
1）2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
将2,6-二甲基吡啶、双氧水和冰乙酸按用量比1g:1.8mL:5mL混合，在60-90℃下反应5-10h，旋干溶剂，冰水浴下用饱和碳酸钾溶液调pH至9-10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色油状液体2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
2）4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
将上述2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、浓度为98wt%的硫酸和浓度为98wt%的硝酸按用量比1g:3mL:3.5mL混合，加热回流反应5-10h，按2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在水浴下用无水碳酸钾调pH至9-10，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色粉末状固体4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
3）4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的合成
将上述4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、乙酰溴和冰乙酸按用量比1g:10mL:14.5mL混合，在60℃-90℃下反应6-13h，按4-硝基-2-甲基吡啶-N-氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在冰水浴下用无水碳酸钾调pH至9-10，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色固体4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；
4）4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶的合成
将上述4-溴-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、三氟乙酸酐和二氯甲烷按用量比1g:4.5mL:13mL混合，加热回流反应15-20h，旋干溶剂，按4-溴-2-甲基吡啶-N-氧化物与饱和碳酸钾溶液用量比为1g:18mL加入饱和碳酸钾溶液，室温下搅拌2-5h，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色固体4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶；
5）4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐的合成
将上述4-溴-2-羟甲基-6-甲基吡啶、氯化亚砜和二氯甲烷按用量比1g:1mL:10mL混合，加热回流反应3-6h，旋干溶剂，用无水乙醚洗涤残留物，红外干燥后，得到黄绿色粉末状固体4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐；
6）N-（4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶）乙二胺的合成
将上述4-溴-2-氯甲基-6-甲基吡啶盐酸盐、乙二胺和无水乙腈按质量体积比1g:4.3mL:35.7mL混合，接干燥管，室温搅拌下反应20-30h，过滤并旋干溶剂，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和碳酸钾溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得棕黄色油状液体N-(4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶)乙二胺；
7）4-溴-2-氨甲基-[N,N´, N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶的合成
将上述N-（4-溴-2-氨甲基-6-甲基-吡啶）乙二胺、无水碳酸钾、溴乙酸乙酯和无水乙腈按用量比1g:4.5g:4mL:43.8mL混合，氩气保护下室温搅拌反应20-30h，经过滤并将滤液浓缩至干，柱分离后，得到红棕色油状物液体4-溴-2-氨甲基-[N,N´, N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶；
8）4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´, N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶的合成
将上述4-溴-2-氨甲基-[N,N´, N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶、苯亚磺酸钠、四丁基溴化铵和无水乙腈按用量比1g:1.3g:0.08g:33.3mL混合，氩气保护下在60-80℃下反应13-20h，溶剂旋干，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离后，得到淡黄色油状液4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´, N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶；
9）4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）- N,N´, N´-三乙酸的合成
将上述4-苯砜基-2-氨甲基-[N,N´, N´-三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]-6-甲基吡啶、氢氧化钠、无水乙醇和蒸馏水按用量比1g:0.43g:7.3mL:7.3mL混合，室温下搅拌反应5-10h，分批少量加入H+离子交换树脂调pH至3-4，用无水甲醇洗涤树脂至无荧光，过滤后将滤液浓缩至干，得乳白色固体4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）- N,N´, N´-三乙酸。
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- 2015-01-09 CN CN201510010417.0A patent/CN104610138A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
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