CN107930592B - 一种mof-磁性石墨烯杂化材料及其在手性拆分和体外细胞毒性方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MOF‑磁性石墨烯杂化材料的合成方法：首先制备氧化石墨烯和磁性四氧化三铁微球，并在室温下制备Fe3O4/聚多巴胺复合纳米颗粒；然后采用一步常压合成法，将Fe3O4/聚多巴胺分散在氧化石墨烯溶液中，逐步加入一水合醋酸铜，S‑苹果酸和4,4’‑联吡啶的甲醇/水溶液，制得MOF‑磁性石墨烯杂化材料。该材料具有分散性好，结构性质稳定，合成方法简单快捷等优点。同时本发明研究了该材料对药物盐酸普萘洛尔的手性识别能力，利用材料的可重复使用性能，分别对R‑和S‑盐酸普萘洛尔对映异构体进行制备；并采用CCK‑8法对拆分后的R‑和S‑盐酸普萘洛尔进行肺腺癌细胞A549的毒性检测，比较对映异构体的作用差异。

Description

一种MOF-磁性石墨烯杂化材料及其在手性拆分和体外细胞毒 性方面的应用
技术领域
本发明涉及纳米材料与毒理学交叉领域，尤其是涉及一种MOF-磁性石墨烯杂化材料，本发明还涉及MOF-磁性石墨烯杂化材料在对盐酸普萘洛尔对映体手性拆分和体外细胞毒性方面的应用。
背景技术
手性化合物尤其是手性药物的分离在药物研究和医药工业发展方面具有重要意义。手性药物指的是一些由手性化合物组成的具有药理活性的药物，由于对映体不同的立体构型，其相互作用也大不相同，使得手性药物不同的构型表现出来的药理活性、代谢过程及速率、毒性等动力学特征也大为不同。服用外消旋药物具有极大的潜在危险性，例如沙利度胺作为一种镇定剂，它的R-异构体的代谢物无毒性且有着很好的镇静止呕作用，但是它的S-异构体的两种代谢物却有胚胎毒性以及致畸性，这就是20世纪60年代震惊国际的“反应停”事件。又例如非甾体抗炎镇痛药布洛芬，其药理活性主要是由(S)-布洛芬产生，(R)-布洛芬不仅活性低，而且有毒副作用；所以，国际上一些厂家已经或正在把(S)-布洛芬推向市场，以替代外消旋布洛芬。目前，(S)-布洛芬的制备方法可分为外消旋体拆分和不对称合成法两大类，但均存在手性拆分试剂或手性催化剂价格昂贵、制备路线长、涉及化学物种多、ee%值低等诸多缺点。因此，手性药物的拆分方法，对单一药物对映体的活性研究具有重要意义。
手性化合物的拆分方法有结晶拆分法、动力学拆分、化学拆分法、膜拆分法、酶拆分法、萃取拆分法和色谱拆分法，其中色谱拆分法应用最为广泛，这主要是由于其简便快捷且分离效果好而被认为是手性异构体拆分最有效的方法。磁性固相萃取（MSPE）是用磁性材料或者可以磁化的材料作为吸附剂的一种在外加磁场下能实现被富集物质与基质快速分离的方法。磁性固相萃取与传统的固相萃取相比，萃取时间缩短，有机溶剂用量减少，而且也少了样品过滤离心的过程，因此在样品前处理过程中应用非常广泛。金属有机骨架化合物（MOF）作为一种新型的多孔功能材料，因其具有较高的比表面积、丰富的拓扑结构、稳定的孔结构以及孔道表面可修饰等特点，使得它在气体储存、催化剂、吸附分离等诸多领域都具有非常广泛的应用前景。而手性MOFs由于具有手性官能团或敞开的手性孔穴等特点，使其在手性识别领域有着广泛的应用潜能，并为外消旋体的拆分提供了一个新的有效途径。磁性功能化的手性MOFs不仅具有磁性材料的磁学性能，还有多孔材料的特性，具有手性识别能力，利用磁性固相萃取技术，结合HPLC手段，对其选择富集性能进行评价，可实现对手性药物的富集及与其对映体的直接快速分离、制备，弥补了色谱法中存在的手性柱价格昂贵、流动相成本高等不足。
细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构/生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖或功能紊乱所引发的不良反应。有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度都存在良好的相关性。化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。
CCK-8检测法是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、简便、高灵敏度的检测方法。CCK-8细胞活性检测试剂中含有WST-8，它在电子耦合试剂存在的情况下，能够被活细胞线粒体中的脱氢酶氧化还原成水溶性能溶解在组织培养基中的橙黄色甲臜染料。甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。用酶标仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可以间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种MOF-磁性石墨烯杂化材料，本发明还提供该MOF-磁性石墨烯杂化材料在对盐酸普萘洛尔对映体手性拆分和体外细胞毒性方面的应用。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的MOF-磁性石墨烯杂化材料，其特征在于：其合成方法包括下述步骤：
第一步，制备氧化石墨烯（GO）；实际制备时，可采用改良的Hummers法或其他常规的制备方法；
第二步，采用水热合成法制备磁性四氧化三铁（Fe3O4）微球；
第三步，室温下在碱性缓冲溶液中，多巴胺在Fe3O4微球表面自聚合形成聚多巴胺薄膜，制备出Fe3O4/聚多巴胺（Fe3O4@PDA）复合纳米颗粒；
第四步，合成以S-苹果酸为手性配体的手性金属有机骨架材料；然后采用一步合成法，将Fe3O4@PDA分散在氧化石墨烯溶液中，随后逐步加入一水合醋酸铜，S-苹果酸和4,4’-联吡啶的甲醇/水溶液，制得MOF-磁性石墨烯杂化材料。
其中第四步中氧化石墨烯的添加量为单独合成的手性金属有机骨架材料母体产量的10%；所用的一水合醋酸铜，S-苹果酸和4, 4’-联吡啶的摩尔比为1:2:1；
具体操作顺序为：先将氧化石墨烯超声分散呈均一透明溶液，再加入Fe3O4@PDA超声分散均匀；然后加入一水合醋酸铜溶液超声30 min，再加入S-苹果酸和 4,4’-联吡啶溶液超声30 min；最后，100℃氮气保护下机械搅拌反应24 h。
本发明制备的MOF-磁性石墨烯杂化材料在对盐酸普萘洛尔对映体手性拆分方面的应用，拆分出R-盐酸普萘洛尔和S-盐酸普萘洛尔对映异构体。
本发明制备的MOF-磁性石墨烯杂化材料在对盐酸普萘洛尔对映体的快速选择性吸附所制备的药物在体外细胞毒性方面的应用，通过采用CCK-8法对药物作用后的细胞进行毒性检测，根据细胞存活率比较它们的作用差异。
本发明的优点在于采用水热合成法制得的磁性四氧化三铁微球大小均一、分散性好，所采用的包覆聚多巴胺的磁性微球和MOF-磁性石墨烯杂化材料的合成方法简单，制备成本低，制得的材料具有良好的磁性能且分散性、稳定性好等优点。
本发明制备的MOF-磁性石墨烯杂化材料对盐酸普萘洛尔对映体有较好的手性识别能力，通过优化各种条件，在最优的条件下，该复合材料对盐酸普萘洛尔对映体具有较高的选择性吸附能力，其ee值可达98%，整个磁固相萃取过程不超过8分钟，且材料重复利用7次以上，ee值未见明显降低；利用材料的可重复利用性能，可分别对R-盐酸普萘洛尔和S-盐酸普萘洛尔对映异构体进行制备。
本发明以人肺腺癌A549细胞为模型，采用CCK-8法对盐酸普萘洛尔及其R型与S型作用于人肺腺癌A549的细胞毒性进行评价，探讨盐酸普萘洛尔及其R型与S型对人肺腺癌A549细胞的体外增殖抑制作用及差异。所采用的CCK-8试剂本身对细胞毒性小，避免了本底的影响和实验误差，测试结果重复性好、稳定性强、灵敏度高。
附图说明
图1为本发明MOF-磁性石墨烯杂化材料的扫描电镜和透射电镜图。
图2为本发明MOF-磁性石墨烯杂化材料的红外光谱图。
图3为本发明MOF-磁性石墨烯杂化材料的磁滞回线图。
图4为本发明MOF-磁性石墨烯杂化材料的XRD图。
图5为本发明常压MOF和模拟MOF的XRD对比图。
图6为发明MOF-磁性石墨烯杂化材料的热重分析图。
图7为本发明MOF-磁性石墨烯杂化材料对盐酸普萘洛尔的最优ee值色谱图。
图8为本发明MOF-磁性石墨烯杂化材料的重复次数图。
图9为盐酸普萘洛尔染毒A549细胞毒性测试图。
图10为R-盐酸普萘洛尔染毒A549细胞毒性测试图。
图11为S-盐酸普萘洛尔染毒A549细胞毒性测试图。
图12为Rac-、R-和S-盐酸普萘洛尔染毒A549细胞毒性测试对比图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步详细地说明本发明的技术方案。本实施例中所用的试剂仪器如无特殊说明，均是本行业常用或市售产品。
实施例1 MOF-磁性石墨烯杂化材料的合成
一、本发明MOF-磁性石墨烯杂化材料的合成方法包括下述步骤：
(1)氧化石墨烯(GO)的制备：
分三个阶段进行：
低温反应：称取1 g石墨粉于500 mL三口烧瓶中，在冰浴条件下加入35 mL浓硫酸，搅拌30 min，冷却至4℃以下，称取4 g KMnO4缓慢加入，控制温度不超过10℃；
中温反应：将三口烧瓶移至35 ℃恒温油浴锅中，磁力搅拌12 h；
高温反应：在所得混合液中缓慢加入138 mL的高纯水，保持混合液温度90～95℃反应30 min，期间保持适度搅拌；量取12.5 mL（30 Vol %）的双氧水缓慢加入，搅拌1 h后离心分离，先用5%稀盐酸清洗三次，再用高纯水洗至中性，去除过量的酸及副产物；最后在45℃真空干燥箱内烘干24 h，即得到氧化石墨烯。
(2)磁性四氧化三铁（Fe3O4）微球的制备：
称取2.7 g FeCl3·6H2O固体于100 mL烧杯中，加入80 mL乙二醇，超声使其溶解呈透明溶液。然后加入7.2 g无水醋酸钠和2.0 g聚乙二醇，超声30 min使其混合均匀。再将混合液体转移到100 mL高压反应釜中，在200 ℃下反应12 h。最后将反应釜冷却至室温，对合成的的四氧化三铁用水和无水乙醇交替洗涤几次，即可得到单分散性良好的磁性四氧化三铁（Fe3O4）纳米颗粒。
(3)核壳型Fe3O4@PDA纳米颗粒的制备：
称取40 mg盐酸多巴胺于三口烧瓶中，加入40 mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH = 8.5)缓冲溶液，超声5 min，接着加入10 mg制备的磁性 Fe3O4纳米颗粒，超声分散均匀后，室温下机械搅拌24 h。反应完毕后用磁铁分离，产物用高纯水和无水乙醇充分洗涤，50℃真空干燥即得Fe3O4@PDA纳米颗粒。
(4)MOF-磁性石墨烯杂化材料(Fe3O4@PDA-GO/MOF)的制备：
按照摩尔比1:2:1称取0.3 g一水合醋酸铜，0.42 g S-苹果酸和0.23 g 4, 4’-联吡啶于三口烧瓶中，然后加入30 mL甲醇/水（1:1，V/V），超声混合均匀后，100℃下反应24h，冷却至室温，获得蓝色晶体，用高纯水和无水乙醇洗涤后，40℃真空干燥即得纯MOF；
称取基于纯MOF产量10%的GO于三口烧瓶中，加入15 mL甲醇/水（1:1，V/V），超声分散呈均一透明溶液，接着加入0.1 g Fe3O4@PDA超声分散均匀；然后称取0.3 g一水合醋酸铜，加入5 mL甲醇/水（1:1，V/V）制成溶液，加入三口烧瓶中超声30 min；接着称取0.42 gS-苹果酸和0.23 g 4, 4’-联吡啶，加入10 mL甲醇/水（1:1，V/V）制成溶液，加入三口烧瓶中，超声30 min。最后，100℃氮气保护下机械搅拌反应24 h。反应结束降至室温后，用高纯水和无水乙醇洗涤，40℃真空干燥即得MOF-磁性石墨烯杂化材料。
二、对制得的MOF-磁性石墨烯杂化材料进行表征
1、采用扫描电镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察上述制备的MOF-磁性石墨烯杂化材料(Fe3O4@PDA-GO/MOF)，如图1所示，其中(a)为MOF-磁性石墨烯杂化材料的扫描电镜照片，(b)为MOF-磁性石墨烯杂化材料的透射电镜照片。
2、采用FT-IR光谱仪对上述制备的材料（Fe3O4@PDA,MOF, Fe3O4@PDA-GO/MOF）进行表征，其红外表征图如图2所示，a为Fe3O4@PDA的红外图，在1607 cm-1处出现N-H键特征吸收峰，在1400～1200 cm-1内，1408 cm-1处出现-CH2键弯曲振动，1290 cm-1处出现C-O键不对称伸缩振动，585 cm-1处出现Fe-O键特征吸收峰，这些说明PDA成功包裹在了Fe3O4磁性微球表面；图b为Fe3O4@PDA-GO/MOF的红外图，c为MOF的红外图，通过对比特征吸收峰可知，MOF成功修饰上了磁性材料。
3、采用振动样品磁强计(VSM)表征MOF-磁性石墨烯杂化材料的磁性，其磁滞回线见图3，Fe3O4@PDA-GO/MOF的饱和磁化强度为6.08 emu·g-1，可见复合材料Fe3O4@PDA-GO/MOF具有一定的饱和磁化强度，易被外磁场磁化。在外加磁场的作用下磁性材料可以快速、高效地从溶液中分离出来，当撤掉外界磁场后，材料又可以很快的重新分散到溶液中。
4、利用粉末X-射线衍射仪(XRD)表征磁性纳米粒子的晶体类型。如图4所示，图a为使用7次后，图b为Fe3O4@PDA-GO/MOF，图c为MOF，图d为Fe3O4@PDA，对比制备的Fe3O4@PDA，纯MOF，以及Fe3O4@PDA-GO/MOF的XRD衍射峰均可以看出，复合材料Fe3O4@PDA-GO/MOF不仅有纯MOF的特征峰，而且在2θ位置为30.1°、35.5°、43.2°、56.7°、62.7°处还有Fe3O4@PDA的特征峰，再次证明了MOF成功修饰上了磁性材料，且材料使用7次后的XRD图与使用前对比，未见明显变化，证明了材料较好的可重复利用性。由图5可知，所合成的晶体的主要衍射峰位置与晶体模拟的XRD的衍射峰位置基本一致，可见常压原位合成法未破坏其MOF结构。
5、采用热重分析实验(TGA)表征磁性纳米粒子的稳定性，由图6可知，该材料在200℃以下重量损失不大，说明了该材料具有很好的稳定性。
实施例2 MOF-磁性石墨烯杂化材料对盐酸普萘洛尔对映体的快速选择性吸附性能测试
磁性固相萃取的一大优势是可以利用外加磁场，实现磁性材料和溶液的快速分离。
本发明所做的测试流程为：首先，称取一定量实施例1合成的MOF-磁性石墨烯杂化材料于离心管中，然后加入一定量待分析的盐酸普萘洛尔消旋体储备液和萃取液，超声振荡萃取一定时间，利用磁铁强大的磁场，使磁性材料聚集离心管底部，实现材料和溶液的分离，弃去上清液，向其中加入一定量的洗脱液，超声洗一次弃去上清。再加入一定量的洗脱液，充分超声振荡洗脱后用磁铁分离，收集洗脱液，重复一次，合并两次的洗脱液，过0.22 μm有机滤膜（尼龙）后用温和的氮气流吹干，再用流动相溶解后用HPLC进行分析。按照此流程，对萃取溶剂，洗脱溶剂，萃取和洗脱时间等进行了系统的优化。重复三次取平均值，在以乙醇为萃取溶剂，异丙醇为洗脱溶剂，萃取5min，洗脱3min的条件下，该磁性吸附剂对盐酸普萘洛尔的最佳选择性吸附结果在高效液相色谱仪器上进行分析，得最佳ee值的液相色谱图，如图7所示。由图可见该复合材料对盐酸普萘洛尔的最佳ee值为98%。色谱条件：Chiralpak IC手性柱 (4.6*150 mm, 5 μm)；正己烷/异丙醇/三乙胺(83/17/0.2, v/v/v)；流速0.5mLmin-1；波长254 nm；柱温 25 oC。
实验通过收集吸附后的Fe3O4@PDA-GO/MOF复合材料，用异丙醇充分洗涤后，再次考察Fe3O4@PDA-GO/MOF复合材料对盐酸普萘洛尔的手性选择性吸附情况。重复三次取平均值，如图8所示，结果表明，当材料重复使用7次后，ee值仍不低于85%，说明了材料的稳定性极好，可重复利用，有良好的可再生性。
实施例3盐酸普萘洛尔外消旋体（Rac-Pro）、R-盐酸普萘洛尔（R-Pro）及S-盐酸普萘洛尔（S-Pro）对A549细胞增殖的影响
消化收集对数生长期的A549细胞，调整细胞悬液浓度约为5×104个/mL，在96孔板中每孔加入100 μL的细胞悬液，将培养板置于37℃、5% CO2 培养箱内进行培养约24 h。待细胞贴壁后吸出各孔内培养液，根据实验分组加入含不同浓度的盐酸普萘洛尔，R-盐酸普萘洛尔和S-盐酸普萘洛尔培养液100 μL，实验同时设阴性对照组和空白对照组。阴性对照组为不含药的培养液，每组6 复孔。将培养板继续置于培养箱中孵育24 h。弃上清，用PBS溶液洗2遍。向每孔加入10 μL CCK-8试剂和90 μL培养基，培养1.5 h。用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的OD值。
利用公式计算细胞存活率：
Figure 751202DEST_PATH_IMAGE001
其中，As：实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质）；
Ac：对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质）；
Ab：空白孔（不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8）；
实验结果如图9～12所示，选择不同浓度的Rac-Pro、R-Pro及S-Pro作用于A549细胞，与对照组相比，在5.0～80.0 μg·mL-1范围内，Rac-Pro、R-Pro及S-Pro作用于A549细胞均可抑制细胞增殖，抑制均呈剂量-效应依赖关系。从图12中可看出R-盐酸普萘洛尔对A549细胞的抑制作用最大，在浓度为30.0～60.0 μg·mL-1范围内时，R-盐酸普萘洛尔对A549细胞的抑制作用大于Rac-盐酸普萘洛尔。

Claims (2)

1.一种MOF-磁性石墨烯杂化材料，其特征在于：其合成方法包括下述步骤：
第一步，制备氧化石墨烯；
第二步，采用水热合成法制备磁性四氧化三铁微球；
第三步，室温下在碱性缓冲溶液中，多巴胺在磁性四氧化三铁微球表面自聚合形成聚多巴胺薄膜，制备出Fe3O4/聚多巴胺复合纳米颗粒；
第四步，合成以S-苹果酸为手性配体的手性金属有机骨架材料；然后采用一步合成法，将Fe3O4/聚多巴胺分散在氧化石墨烯溶液中，随后逐步加入一水合醋酸铜，S-苹果酸和4,4’-联吡啶的甲醇/水溶液，制得MOF-磁性石墨烯杂化材料；
其中，所述第四步中氧化石墨烯的添加量为手性金属有机骨架材料母体产量的10%；所述一水合醋酸铜，S-苹果酸和4,4’-联吡啶的摩尔比为1:2:1；
其操作顺序为：先将氧化石墨烯超声分散呈均一透明溶液，再加入Fe3O4/聚多巴胺超声分散均匀；然后加入一水合醋酸铜溶液超声30 min，再加入S-苹果酸和 4,4’-联吡啶溶液超声30 min；最后，100℃氮气保护下机械搅拌反应24 h。
2.权利要求1的MOF-磁性石墨烯杂化材料在对盐酸普萘洛尔对映体手性拆分方面的应用。
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