CN113856573B - 一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在奇异变形杆菌检测中的应用 - Google Patents

一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在奇异变形杆菌检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在奇异变形杆菌检测中的应用，通过将四氧化三铁磁性纳米颗粒和氧化石墨烯纳米片层黏连，再沉积二氧化硅于外表面，制得具有高效近红外光产热和磁响应特性复合纳米材料；将它与低熔点琼脂糖预混在PCR反应液中，再通过微流控芯片乳化制备复合凝胶微球从而获得具备光热响应和磁响应的dPCR微载体。通过调控光响应性凝胶微球添加量和标定近红外光强程序，实现PCR的温度循环过程。扩增反应后微球凝固成球能储存单分子的信息。本发明制备的智能微球阵列成本低，仪器和操作简单，适宜推广，此检测方法可有效、方便应用在健康卫生和公共安全等多领域，具有深刻的社会和临床价值。

Description

一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在奇异变 形杆菌检测中的应用
技术领域：
本发明属于分子生物学及微流控技术领域，具体涉及一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在奇异变形杆菌检测中的应用。
背景技术：
奇异变形杆菌为肠杆菌科变形杆菌属的一员，是典型的革兰氏阴性杆菌。奇异变形杆菌在自然界中分布广泛，主要存在于土壤、粪便、污水中，是常见的人畜共患病致病菌，主要存在于泌尿生殖道、消化道、呼吸道，感染可引起尿路感染、肠炎、肺炎、膀胱炎、肾结石等疾病。
目前的典型检测方式是培养法和荧光实时PCR方法，但它们存在耗时长、灵敏度有待提高等不足，这不利于及时诊断病因和控制病情蔓延。数字聚合酶链式反应(dPCR)因高灵敏度特点给现状带来转机，目前该技术需要依赖复杂的设备，尤其是精密的温控模块，这成为限制其推广的壁垒。一套简单方便的配套设备亟待开发，去推动新技术的普及。本发明的目的在于克服现有检测方式的不足，提供一种可用于奇异变形杆菌的数字PCR诊断手段，具有检测仪器简单、操作方便、灵敏度高、成本低、结果易判读的特点。
因此，基于纳米材料的优异物理化学特性和智能响应，本发明将光热材料和纳米微球引入水凝胶网状结构，赋予它热和光学等优势，打破水凝胶作为微滴载体在传统dPCR的范式束缚，探索这种优势在dPCR领域的应用价值。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球及其在奇异变形杆菌检测中的应用，通过制备载涂敷氧化石墨烯的磁性纳米微球的琼脂糖微滴，以实现整体能光控变温，最终用它标定组装PCR温度循环过程，用以dPCR扩增和检测奇异变形杆菌的DNA分子。
为实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，制备方法包括以下步骤：
步骤一、制备四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料
通过水热方法合成直径在几十纳米到几百纳米之间的四氧化三铁纳米微球；将四氧化三铁纳米微球与多巴胺、盐酸、Tris碱混合搅拌六个小时，直至溶液变为棕色，四氧化三铁纳米微球表面负载了聚多巴胺层；将上述溶液置换为单层氧化石墨烯分散液，常温共混搅拌六个小时，生成表面粘有少层氧化石墨烯的四氧化三铁纳米粒子；将表面粘有氧化石墨烯的四氧化三铁纳米粒子经过乙醇、去离子水反复清洗后，在60℃、碱性条件下与正硅酸乙酯共混一个小时，即生成四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料；经过乙醇、去离子水反复清洗后，分散于水中待用；
步骤二、制备近红外光响应变温的凝胶微球
通过光刻工艺加工汇聚流结构的微滴生成微流控芯片，将步骤一所制备的四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料、微滴原材料溶液、PCR试剂和待测样品混合作为内相，以含有2％含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相；通过注射泵分别将内相和外相注入芯片，内相在芯片内被外相切割，得到油包水微球，即为光响应可变温凝胶微球。
进一步的，步骤一中，四氧化三铁纳米粒子表面修饰聚多巴胺层和少层氧化石墨烯的过程可以选择磁力搅拌或者机械搅拌。
进一步的，步骤一中，所述石墨烯分散液可替换为MXene溶液、黑磷片层溶液、碳纳米管溶液中的一种。
进一步的，步骤一中，氧化石墨烯分散液浓度为0.1、0.5、1、1.5或2mg/mL。
进一步的，步骤二中，内相溶液中，四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅的浓度大于1μg/μL，具体为2～6μg/μL，以保证能提供高效地加热效率。
进一步的，步骤二中，PCR试剂包括：引物：F：5’-GAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGG，R：5’-TGTTATGTGCAGTGCTCACA；荧光Taqman探针：5'-AGGGCGCTTACCACTTTGT，浓度可为100、200、300、400、500nM。
进一步的，步骤二中，微流控芯片内相通道深度为50-80μm，内、外相交汇处通道的宽度为60-80μm；可通过调节内相和外相注入芯片的速度，来调节光响应可变温凝胶微球的大小。
进一步的，步骤二中，微滴原材料溶液选自琼脂糖溶液、明胶溶液、壳聚糖溶液中的一种或多种；微滴原材料溶液为琼脂糖溶液时，琼脂糖的浓度为0.25～1.5％，避免高浓度的琼脂糖阻碍DNA分子的反应扩散。
进一步的，所述四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料当量粒径可以为800～2000纳米；所制备的近红外光响应变温的凝胶微球直径可以为80～300微米。
本发明还提供了以上所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球在检测奇异变形杆菌中的应用，检测方法为：将光响应性可相变复合凝胶微球施加程序化近红外光照，进行凝胶微球的温度调节，最终通过荧光显微镜读取凝胶微球的荧光信号，统计荧光比例，从而估算初始奇异变形杆菌核酸分子的含量。
进一步的，程序化近红外光照过程为：95℃3min，(95℃30s，55℃60s，68℃60s)*32个循环。
本发明的有益效果：
1)本发明制备的光响应性可相变复合凝胶微球可用于dPCR法核酸检测，不需要依赖复杂、昂贵的设备，成本可控，易于推广，仅靠开启程序化近红外光源就能实现PCR热循环反应，过程简单，可靠。
2)本发明制备的光响应性可相变复合凝胶微球具有良好的生物相容性和分散性，不会干扰核酸分子扩散、扩增、荧光基团发光等过程。
3)本发明所制备的光响应性可相变复合凝胶微球具有磁响应，能够调控实现磁牵引运动，为下游智能筛选提供可能。
4)本发明制备的光响应性可相变复合凝胶微球具有优良的保水性，常温转为凝胶态等特性克服了水微滴易蒸发、不易保存的局限。
附图说明：
图1为本发明所制备的复合纳米材料合成流程图；
图2为本发明微流控芯片结构示意图；
图3为本发明实施例1光响应性可相变凝胶微球SEM图；
图4为本发明实施例1所制备的光响应性可相变凝胶微球群在近红外光介导dPCR后的荧光图。
附图标记为：
1、光响应可变温凝胶微球；2、四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料；2-1、四氧化三铁纳米微球；2-2、表面涂敷聚多巴胺的四氧化三铁纳米微球；2-3、表面粘有少层氧化石墨烯的四氧化三铁纳米微球；3、外相；4、内相。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，按照如下方法制备：
(1)制备四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料
通过水热方法合成四氧化三铁纳米微球，然后将它与多巴胺、盐酸、Tris碱混合搅拌六个小时，当溶液变为棕色，即代表纳米球表面负载了聚多巴胺层。
然后将上述溶液置换为单层氧化石墨烯分散液，常温共混搅拌六个小时，生成表面粘有少层氧化石墨烯的四氧化三铁纳米粒子。
经过乙醇、去离子水反复清洗后，将表面粘有少层氧化石墨烯的四氧化三铁纳米粒子在60℃、碱性条件下与正硅酸乙酯共混一个小时，即生成四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料(如图1所示)。经过乙醇、去离子水反复清洗后，分散于水中待用。
(2)制备近红外光响应性可相变复合凝胶微球：
通过光刻工艺加工汇聚结构的液滴生成微流控芯片，关键结构参数为：通道深度控制在50-80μm，水相、油相通道的宽度设计为60-80μm(如图2所示)。
选用琼脂糖作为水凝胶基底，将步骤(1)所制备的四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料(2μg/μL)、琼脂糖溶液(0.5％)、PCR试剂和待测样品(已知DNA浓度)混合作为内相，以含有2％含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相。其中，PCR试剂包括：引物：F：5’-GAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGG，R：5’-TGTTATGTGCAGTGCTCACA；荧光Taqman探针：5'-AGGGCGCTTACCACTTTGT，浓度为100nM。
通过注射泵将外相和内相注入芯片，内相在芯片内被外相切割成微球，通过调控二者流量(50-200μL/h)可以生成直径在150μm的光响应性可相变复合凝胶微球，如图3所示，所得到的的微球粒径均匀、球形度好、表面能看见参杂的复合材料。
实施例2
本实施例提供用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，按照如下方法制备：
(1)制备四氧化三铁@MXene@二氧化硅复合材料
通过水热方法合成四氧化三铁纳米微球，然后将它与多巴胺、盐酸、Tris碱混合搅拌六个小时，当溶液变为棕色，即代表纳米球表面负载了聚多巴胺层。
然后将上述溶液置换为少层MXene分散液(浓度为1mg/mL)，常温共混搅拌六个小时，生成表面粘有少层MXene的四氧化三铁纳米粒子。
经过乙醇、去离子水反复清洗后，将表面粘有少层氧化石墨烯的四氧化三铁纳米粒子在60℃、碱性条件下与正硅酸乙酯共混一个小时，即生成四氧化三铁@MXene@二氧化硅复合材料。经过乙醇、去离子水反复清洗后，分散于水中待用。
(2)制备近红外光响应性可相变复合凝胶微球：
通过光刻工艺加工汇聚结构的液滴生成微流控芯片，关键结构参数为：通道深度控制在50-80μm，水相、油相通道的宽度设计为60-80μm(如图2所示)。
选用琼脂糖作为水凝胶基底，将步骤(1)所制备的四氧化三铁@MXene@二氧化硅复合材料(2μg/μL)、琼脂糖溶液(0.5％)、PCR试剂和待测样品混合作为内相，以含有2％含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相。其中，PCR试剂包括：引物：F：5’-GAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGG，R：5’-TGTTATGTGCAGTGCTCACA；荧光Taqman探针：5'-AGGGCGCTTACCACTTTGT，浓度为100nM。
通过注射泵将外相和内相注入芯片，内相在芯片内被外相切割成微球，通过调控二者流量(50-200μL/h)可以生成直径在110μm的光响应性可相变复合凝胶微球。
实施例3
将实施例1所制备的光响应性可相变复合凝胶微球进行奇异变形杆菌的检测。
将光响应性可相变复合凝胶微球进行程序化近红外光刺激，以实现温度经历过程；程序化近红外光照过程为：95℃3min，(95℃30s，55℃60s，68℃60s)*32个循环。
最终通过荧光显微镜读取微球群的荧光信号(如图4所示)，随着奇异变形杆菌的DNA分子浓度增加，统计荧光微球比例增大，与样品中核酸分子的理论数值一致。此方法可用于估算初始奇异变形杆菌核酸分子的含量。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
步骤一、制备四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料
通过水热方法合成四氧化三铁纳米微球；
将四氧化三铁纳米微球与多巴胺、盐酸、Tris碱混合搅拌六个小时，直至溶液变为棕色，四氧化三铁纳米微球表面负载了聚多巴胺层；
将上述溶液置换为单层氧化石墨烯分散液，常温共混搅拌六个小时，生成表面粘有少层氧化石墨烯的四氧化三铁纳米粒子；
将表面粘有氧化石墨烯的四氧化三铁纳米粒子经过乙醇、去离子水反复清洗后，在60℃、碱性条件下与正硅酸乙酯共混一个小时，即生成四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料；
经过乙醇、去离子水反复清洗后，分散于水中待用；
步骤二、制备近红外光响应变温的凝胶微球
制备微流控芯片，将步骤一所制备的四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅复合材料、微滴原材料溶液、PCR试剂和待测样品混合作为内相，以含有含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相；
通过注射泵分别将内相和外相注入芯片，内相在芯片内被外相切割，得到微滴，即为光响应可变温凝胶微球。
2.根据权利要求1所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，其特征在于，步骤一中，四氧化三铁纳米粒子表面修饰聚多巴胺层和少层氧化石墨烯的过程选择磁力搅拌或者机械搅拌。
3.根据权利要求1所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，其特征在于，步骤一中，所述氧化石墨烯分散液替换为MXene溶液、黑磷片层溶液、碳纳米管溶液中的一种。
4.根据权利要求1所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，其特征在于，步骤一中，氧化石墨烯分散液浓度为0.1、0.5、1、1.5或2 mg/mL。
5.根据权利要求1所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，其特征在于，步骤二中，内相溶液中，四氧化三铁@氧化石墨烯@二氧化硅的浓度大于1μg/μL，以保证能提供高效地加热效率。
6.根据权利要求1所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，其特征在于，步骤二中，PCR试剂包括：引物：F：5’- GAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGG，R：5’-TGTTATGTGCAGTGCTCACA；荧光Taqman探针：5'- AGGGCGCTTACCACTTTGT。
7.根据权利要求1所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，其特征在于，步骤二中，微流控芯片内相通道深度为50-80μm，内、外相交汇处通道的宽度为60-80μm；可通过调节内相和外相注入芯片的速度，来调节光响应可变温凝胶微球的大小。
8.根据权利要求1所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球，其特征在于，步骤二中，微滴原材料溶液选自琼脂糖溶液、明胶溶液、壳聚糖溶液中的一种或多种；微滴原材料溶液为琼脂糖溶液时，琼脂糖的浓度为0.25~1.5%，避免高浓度的琼脂糖阻碍DNA分子的反应扩散。
9.权利要求1~8任意一项所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球在检测奇异变形杆菌中的应用，检测方法为：将光响应性可相变复合凝胶微球施加程序化近红外光照，进行凝胶微球的温度调节，最终通过荧光显微镜读取凝胶微球的荧光信号，统计荧光比例，从而估算初始奇异变形杆菌核酸分子的含量。
10.根据权利要求9所述的用于dPCR法核酸检测的光响应性凝胶微球在检测奇异变形杆菌中的应用，其特征在于，程序化近红外光照过程为：95 °C 3 min, （95 °C 30s, 55 °C60s, 68 °C 60 s）*32个循环。
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