CN101270119B - 一种从豆科棘豆属或黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物提取工艺技术领域，具体涉及一种从豆科棘豆属或黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺。本发明针对现有技术中存在的提取周期较长、易对环境造成污染、提取成本高和纯度偏低的缺陷和不足，提出的技术方案是：一种从豆科棘豆属和黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺，依次包括下述步骤：一、纯水超声提取，获得大极性有机成分水提取液；二、用极性大孔吸附树脂分离，获得苦马豆素粗提取物；三、分步升华，获得苦马豆素纯品。与现有发明技术相比，本发明具有以下优点：1、提取周期短；2、降低了对环境的污染；3、提取成本低；4、提取率与纯度提高；5、实用性强。

Description

一种从豆科棘豆属或黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺

技术领域：

本发明属于植物提取工艺技术领域，具体涉及一种从豆科棘豆属或黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺。

背景技术：

(一)苦马豆素的药理作用

苦马豆素是一种吲哚里西啶生物碱，它是一种极强的α-甘露糖苷酶竞争性抑制剂，能抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长与转移，同时还能刺激机体的免疫系统，提高机体的免疫机能，促进免疫细胞的增生，增强杀灭肿瘤细胞的能力。由于苦马豆素具有很好的抗肿瘤活性和免疫增强作用，已引起国内学者的广泛关注，并作为抗肿瘤药筛选的后备药。目前，国外苦马豆素抗肿瘤药的研发已进入III期临床试验阶段，而国内尚处于起步阶段。

(二)苦马豆素的来源

苦马豆素的抗肿瘤活性、免疫增强作用及其抗辐射作用是十分明显的，然而制约国内苦马豆素抗肿瘤药物研发进程的主要问题是苦马豆素来源十分困难，远远不能满足人们研究的需要。因此，探索和优化苦马豆素的提取工艺就显的十分迫切。关于苦马豆素的来源，文献资料报道有三种途径。

1.从植物中提取分离

目前已经知道含苦马豆素的植物主要是豆科黄芪属和棘豆属植物，这类植物广泛分布于世界各地，尤其是北美和我国，资源十分丰富；其次是豆科苦马豆属植物，该属植物仅局限于澳大利亚和中国；再次从旋花科和锦葵科一些植物中也发现了苦马豆素，含苦马豆素的植物见表1。

2.从真菌菌丝体及其培养液中提取分离

Schneider B等(1984)从美国标准库保存的豆类丝核菌(RhizoctoniaLegaminicola)中分离出苦马豆素。Sim K L等(1997)报道绿僵菌(Metarrhiziumanisopliae)中也含有苦马豆素，如果降低绿僵菌培养液的pH值，可使苦马豆素的浓度增加。Braun K等(2003)从中毒疯草密柔毛黄芪，兰伯氏棘豆，绢毛棘豆的8个类群的叶、径、种子和花中分离出产苦马豆素的植物内生真菌。

3.人工合成途径

鉴于苦马豆素及其相关化合物在生物化学、免疫学、医学和毒理学等方面的众多用途，美国的化学家Yasuda(1984)、Bennett(1989)和我国科学院院士周维善先后对苦马豆素人工合成进行了研究。由于苦马豆素有4个手性碳原子，即使很好地控制反应，但是合成的产物中还有16个化学结构相同，而立体构象不同的异构体，要使之分离却十分困难，整个合成过程有21步，产率仅为6.6％。

(三)从植物中提取苦马豆素的现状及存在的不足

目前，国内苦马豆素纯品的来源主要是从植物中提取，现申请的专利有两项。一项是2002年杨凌大农生物技术有限公司申请的“疯草中苦马豆素的提取工艺”(专利申请号为02114590.3)。一项是2007年西北农林科技大学申请的“一种从疯草中提取苦马豆素的新方法”(专利申请号为200710017844.7)。综合分析两项苦马豆素提取专利技术，其提取技术原理和提取步骤基本相似，没有明显差别，存在的不足主要有以下几点。

1.提取步骤繁琐，提取周期较长：

“疯草中苦马豆素的提取工艺”(专利申请号为02114590.3)所采用的技术方案是首先采用阳离子交换法提取出大极性生物碱粗品，再用碱性氯仿抽提，抽提部分经硅胶柱层析分离得到苦马豆素粗品，最后分步升华获得苦马豆素纯品。具体提纯工艺分五个阶段完成即①浸膏提取阶段；②粗生物碱提取阶段；③苦马豆素粗品提取阶段；④苦马豆素提取阶段；⑤苦马豆素纯化阶段。整个过程需要28天左右。

“一种从疯草中提取苦马豆素的新方法”(专利申请号为200710017844.7)所采用的提纯工艺分四个阶段完成即①浸膏提取阶段；②粗生物碱提取阶段；③苦马豆素粗品提取阶段；④苦马豆素提取阶段。整个过程也需要20天左右。

2.易对环境造成污染：

现有的两项苦马豆素提取工艺中所涉及的有机溶剂及化学试剂有工业甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、氨水、盐酸、醋酸、氢氧化钠等，不仅种类较多，而且其中的甲醇、氯仿、二氯甲烷具有一定的毒性，直接排入大气会对环境造成污染，同时酸碱的大量排放也会对水源、土壤造成污染。

3.提取成本高：现有的两项苦马豆素提取专利技术不仅工艺复杂，而且使用溶剂繁多，因此提取成本高，前者达到20万/g左右，后者也达到10万/g左右。

4.纯度偏低：“一种从疯草中提取苦马豆素的新方法”苦马豆素的提取率虽然比“疯草中苦马豆素的提取工艺”高，但获得的苦马豆素纯度偏低为70％～80％，没有超过90％。

发明内容：

本发明提供了一种从豆科棘豆属或黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺，针对现有技术中存在的提取周期较长、易对环境造成污染、提取成本高和纯度偏低的缺陷和不足。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案是一种从豆科棘豆属和黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺，依次包括下述步骤：一、纯水超声提取，获得大极性有机成分水提取液；二、用极性大孔吸附树脂分离，获得苦马豆素粗提取物；三、分步升华，获得苦马豆素纯品。

上述极性大孔吸附树脂包括市售的D101、YWD-03和YWD-06。

上述步骤一：称取一定量的豆科棘豆属和黄芪属植物干草粉，按1∶6～10(重量/体积)的比例加入纯水，置于超声循环提取机中超声波提取，每次0.5～1小时，收集水提取液，再加纯水，相同条件下超声波提取2～3次，收集水提取液，合并水提取液，浓缩水提取液至密度为1.2～1.5，得到大极性有机成分水提取浓缩液；取水提取浓缩液，按1∶2～4(V/V)的比例加入95％的工业酒精进行醇沉淀，过滤除去不溶部分，所得滤液回收乙醇得到水浓缩液，保存备用；

上述步骤二：取第一步得到的水浓缩液，加入预先处理好的极性大孔吸附树脂，待样品完全进入极性大孔树脂层析柱后，吸附作用30～50分钟，用2.5～4倍柱体积的纯水洗脱，流速控制在1～2柱体积/小时，收集纯水洗脱部分，回收水分，浓缩得到苦马豆素粗提取物。

上述步骤三：将第二步得到的苦马豆素粗提取物，用1mol/L盐酸溶解，丁醇萃取2～3次，加入NaOH调成pH为9～10，过滤，挥干，用4～6倍量的碱性氯仿反复溶解处理，收取碱性氯仿溶液，减压回收溶剂得膏状物，置升华管经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品。

与现有专利技术相比，本发明具有以下优点：

1、提取周期短：本发明的提取工艺步骤简化，只有三步，不需要经过阳离子交换柱、硅胶层析柱和繁琐的萃取过程，只是通过可以反复利用的D101大孔树脂层析柱分离得到苦马豆素粗品，后经简单的处理即可升华得到苦马豆素纯品，整个生产周期降到了3天，提取周期显著缩短。

2、降低了对环境的污染：本发明专利所用的提取溶剂主要是纯水和工业乙醇，还使用少量的丁醇、盐酸、NaOH和氯仿，虽然它们有一定的腐蚀性和毒性，但由于用量很少，几乎不会对环境产生污染，因此本工艺明显降低了对环境的污染。

3、提取成本低：采用本发明工艺，提取成本降到了3万/g左右。

4、植物中苦马豆素的提取率从过去的10～30mg/kg提高到50mg/kg，苦马豆素纯度≥98％。

5、实用性强：整个操作过程简单易行，有利于大批量工厂化生产，对加速苦马豆素在抗肿瘤药物及免疫增强剂等方面的研发进程具有十分重要的实用价值。

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明做详细地说明。

第一部分：苦马豆素的理化特性及本发明的提取原理

苦马豆素属多羟基吲哚里西啶类生物碱，分子量小，极性大，易溶于水、甲醇、乙醇、丁醇、乙醚、丙酮、碱性氯仿等，遇到水分极易吸潮，且具有升华特性。本技术工艺是根据苦马豆素的基本理化特性，首先是采用纯水超声提取法从豆科棘豆属或黄芪属植物中提取出大极性有机成分水提取液，进行醇沉淀滤去不溶部分，滤液挥去残余乙醇经过D101大孔树脂，纯水洗脱合并水洗部分浓缩得到苦马豆素粗品。最后升华得到苦马豆素纯品。

第二部分：具体实例

实施例1：变异黄芪中苦马豆素的提取

一、采用纯水超声提取，获得大极性有机成分水提取液

称取变异黄芪植物干草粉1kg，按1∶6(g/ml)的比例加入纯水6000mL，置超声循环提取机，于60℃20KHz超声波提取，每次0.5小时，收集水提取液。再加纯水，相同条件下超声波提取3次，收集水提取液。合并水提取液，浓缩水提取液至密度为1.2，得到大极性有机成分水提取浓缩液200mL。取水提取浓缩液，按1∶2.5(v/v)的比例加入95％的工业酒精进行醇沉淀，过滤除去不溶部分，所得滤液回收乙醇得到水浓缩液100mL，保存备用。

二、用D101大孔树脂分离，获得苦马豆素粗提取物

将第一步得到的100mL水浓缩液，加入预先处理好的D101大孔树脂层析柱，待样品完全进入D101大孔树脂层析柱后，吸附作用30分钟。用3倍柱体积的纯水洗脱，流速控制在1～2柱体积/小时，收集纯水洗脱部分，回收溶剂得到苦马豆素粗提取物5.31g。

三、分步升华，获得苦马豆素纯品

将第二步得到的5.31g苦马豆素粗提取物，用10mL1mol/L盐酸溶解，丁醇萃取2次，用NaOH调成pH为9，过滤，挥干，用6倍量的碱性氯仿反复溶解处理，收取碱性氯仿溶液。减压回收溶剂得膏状物，置升华管经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品49.30mg。

实施例2：变异黄芪中苦马豆素的提取

一、采用纯水超声提取，获得大极性有机成分水提取液

称取变异黄芪植物干草粉2kg，按1∶8(g/ml)的比例加入纯水16000mL，置超声循环提取机，于60℃20KHz超声波提取，每次1小时，收集水提取液。再加纯水，相同条件下超声波提取3次，收集水提取液。合并水提取液，浓缩水提取液至密度为1.3，得到大极性有机成分水提取浓缩液300mL。取水提取浓缩液，按1∶3(v/v)的比例加入95％的工业酒精进行醇沉淀，过滤除去不溶部分，所得滤液回收乙醇得到水浓缩液150mL，保存备用。

2第二步采用D101大孔树脂分离技术，获得苦马豆素粗提取物

将第一步得到的150mL水浓缩液，加入预先处理好的D101大孔树脂层析柱，待样品完全进入D101大孔树脂层析柱后，吸附作用50分钟。用3.5倍柱体积的纯水洗脱，流速控制在1～2柱体积/小时，收集纯水洗脱部分，回收溶剂得到苦马豆素粗提取物11.60g。

3第三步采用分步升华技术，获得苦马豆素纯品

将第二步得到的11.60g苦马豆素粗提取物，用20mL1mol/L盐酸溶解，丁醇萃取2次，用NaOH调成pH为10，过滤，挥干，用5倍量的碱性氯仿反复溶解处理，收取碱性氯仿溶液。减压回收溶剂得膏状物，置升华管经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品106.2mg。

实施例3：甘肃棘豆中苦马豆素的提取

一、采用纯水超声提取，获得大极性有机成分水提取液

称取甘肃棘豆植物干草粉2kg，按1∶8(g/ml)的比例加入纯水16000mL，置超声循环提取机，于60℃20KHz超声波提取，每次1小时，收集水提取液。再加纯水，相同条件下超声波提取3次，收集水提取液。合并水提取液，浓缩水提取液至密度为1.3，得到大极性有机成分水提取浓缩液300mL。取水提取浓缩液，按1∶3(v/v)的比例加入95％的工业酒精进行醇沉淀，过滤除去不溶部分。所得滤液回收乙醇得到水浓缩液150mL，保存备用。

2第二步采用D101大孔树脂分离技术，获得苦马豆素粗提取物

将第一步得到的150mL水浓缩液，加入预先处理好的D101大孔树脂层析柱，待样品完全进入D101大孔树脂层析柱后，吸附作用40分钟。用2.5倍柱体积的纯水洗脱，流速控制在1～2柱体积/小时，收集纯水洗脱部分，回收溶剂得到苦马豆素粗提取物10.80g。

3第三步采用分步升华技术，获得苦马豆素纯品

将第二步得到的10.80g苦马豆素粗提取物，用20mL1mol/L盐酸溶解，丁醇萃取2次，用NaOH调成pH为9，过滤，挥干，用5倍量的碱性氯仿反复溶解处理，收取碱性氯仿溶液。减压回收溶剂得膏状物，置升华管经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品98.2mg。

实施例4：冰川棘豆中苦马豆素的提取

一、采用纯水超声提取，获得大极性有机成分水提取液

称取甘肃棘豆植物干草粉2kg，按1∶10(g/ml)的比例加入纯水20000mL，置超声循环提取机，于70℃20KHz超声波提取，每次1小时，收集水提取液。再加纯水，相同条件下超声波提取3次，收集水提取液。合并水提取液，浓缩水提取液至密度为1.3，得到大极性有机成分水提取浓缩液350mL。取水提取浓缩液，按1∶4(v/v)的比例加入95％的工业酒精进行醇沉淀，过滤除去不溶部分。所得滤液回收乙醇得到水浓缩液200mL，保存备用。

2第二步采用D101大孔树脂分离技术，获得苦马豆素粗提取物

将第一步得到的200mL水浓缩液，加入预先处理好的D101大孔树脂层析柱，待样品完全进入D101大孔树脂层析柱后，吸附作用30分钟。用4倍柱体积的纯水洗脱，流速控制在1～2柱体积/小时，收集纯水洗脱部分，回收溶剂得到苦马豆素粗提取物12.80g。

3第三步采用分步升华技术，获得苦马豆素纯品

将第二步得到的12.80g苦马豆素粗提取物，用20mL1mol/L盐酸溶解，丁醇萃取2次，用NaOH调成pH为10，过滤，挥干，用4倍量的碱性氯仿反复溶解处理，收取碱性氯仿溶液。减压回收溶剂得膏状物，置升华管经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品102.4mg。

极性大孔吸附树脂的预处理和再生是采用常规方法，以下以D101大孔树脂的预处理和再生的方法为例说明：

预处理：新用D101先用5％NaOH浸泡2h，水洗至中性，再用95％乙醇60℃热回流1h，倾去乙醇，水洗至无醇味，装入柱中，用2％～4％的NaOH用量3BV(3BV，1.5BV/h)，水洗到中性，用0.5mol/LHCl用量3BV(3BV，1.5BV/h)，水洗到中性，即可上样。

再生处理：D101先用5％的NaOH用量3BV(3BV，1.5BV/h)，水洗到中性，用0.5mol/LHCl用量3BV(3BV，1.5BV/h)，水洗到中性，0.05mol/LNaOH的75％乙醇溶液洗3BV(3BV，1.5BV/h)，水洗到中性，0.1mol/LHCl的90％乙醇溶液洗3BV(3BV，1.5BV/h)，水洗到中性和无醇味为止，即可上样。

实施例5：变异黄芪中苦马豆素的提取

一、采用纯水超声提取，获得大极性有机成分水提取液

称取变异黄芪植物干草粉1kg，按1∶8(g/ml)的比例加入纯水8000mL，置超声循环提取机，于80℃20KHz超声波提取，每次0.5小时，收集水提取液。再加纯水，相同条件下超声波提取2次，收集水提取液。合并水提取液，浓缩水提取液至密度为1.2，得到大极性有机成分水提取浓缩液200mL。取水提取浓缩液，按1∶3(v/v)的比例加入95％的工业酒精进行醇沉淀，过滤除去不溶部分，所得滤液回收乙醇得到水浓缩液100mL，保存备用。

二、用YWD-03大孔树脂分离，获得苦马豆素粗提取物

将第一步得到的100mL水浓缩液，加入预先处理好的YWD-03大孔树脂层析柱，待样品完全进入YWD-03大孔树脂层析柱后，吸附作用30分钟。用2.5倍柱体积的纯水洗脱，流速控制在1～2柱体积/小时，收集纯水洗脱部分，回收溶剂得到苦马豆素粗提取物5.29g。

三、分步升华，获得苦马豆素纯品

将第二步得到的5.31g苦马豆素粗提取物，用10mL1mol/L盐酸溶解，丁醇萃取2次，用NaOH调成pH为9，过滤，挥干，用6倍量的碱性氯仿反复溶解处理，收取碱性氯仿溶液。减压回收溶剂得膏状物，置升华管经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品49.30mg。

第三部分：本发明工艺提取的苦马豆素纯品光谱数据及技术指标

1.苦马豆素的理化性质

苦马豆素为白色针状结晶，熔点144～145℃，分子量173，纯度≥98％。经氯仿∶甲醇∶氨水∶水(70∶26∶2∶2，体积/体积)展开，H₂O₂/10％醋酐乙醇/Ehrlich’s试剂显色呈现紫红色斑点，R_f值为0.47。

2.苦马豆素紫外(UV)光谱数据

UVλmax：289(log4.67)，249(log3.83)。

3.苦马豆素红外(IR)光谱数据

IRmax(KBr，cm-1)：3423(O-H)，2943，2891(C-H)，2828～2724(Bohlmann带)，1072(C-O)吸收峰。

4.苦马豆素气相色谱(GC)数据

苦马豆素分子结构中含有羟基，与单糖结构相似，GC直接进样不出峰，所以要进行GC分析必须首先制备成硅醚衍生物。苦马豆素用100μl吡啶溶解，用100μlBSTFA+TMCS(99∶1)室温处理30min，形成TMS衍生物。0.32mm×30mSE-30毛细管柱，柱温从120℃逐渐升高至300℃，5℃/min，13.77min出峰。

5.苦马豆素质谱(MS)光谱数据

EI-MSm/e：173(M⁺)，155(M-H₂O)，138(M-H₂O-OH)，116(M-2H₂O-OH)，115，113(基峰)，96，84，72，43(母核裂解碎片峰)。

6.苦马豆素¹H-NMR(500MHz，C₅D₅N)，¹³C-DMPT(125MHz，C₅D₅N)，¹H-¹HCOSY和HMBC数据(见表1)

表1苦马豆素¹H-NMR，¹³C DMPT，¹H-¹H COSY和HMBC数据

第四部分：本发明提取的苦马豆素的稳定性试验

表2变异黄芪中苦马豆素提取结果

由于提取批次的不同，可能对植物体中苦马豆素的提取率和提取量产生影响。为了证实本发明工艺的稳定性，采用本发明技术对同一植物样品进行了不同批次的放大提取试验，提取结果见表2。

第五部分：本发明与现有技术对比性试验的结果见表3

表3对比性试验结果

Claims (2)

1.一种从豆科棘豆属和黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺，依次包括下述步骤：一、纯水超声提取，获得大极性有机成分水提取液；称取一定量的豆科棘豆属和黄芪属植物干草粉，按1∶6～10g/ml的比例加入纯水，置于超声循环提取机中超声波提取，每次0.5～1小时，收集水提取液，再加纯水，相同条件下超声波提取2～3次，收集水提取液，合并水提取液，浓缩水提取液至密度为1.2～1.5，得到大极性有机成分水提取浓缩液；取水提取浓缩液，按1∶2～4V/V的比例加入95％的工业酒精进行醇沉淀，过滤除去不溶部分，所得滤液回收乙醇得到水浓缩液，保存备用；

二、用极性大孔吸附树脂分离，获得苦马豆素粗提取物：取第一步得到的水浓缩液，加入预先处理好的极性大孔吸附树脂，待样品完全进入极性大孔树脂层析柱后，吸附作用30～50分钟，用2.5～4倍柱体积的纯水洗脱，流速控制在1～2柱体积/小时，收集纯水洗脱部分，回收水分，浓缩得到苦马豆素粗提取物；

三、分步升华，获得苦马豆素纯品：将第二步得到的苦马豆素粗提取物，用1mol/L盐酸溶解，丁醇萃取2～3次，加入NaOH调成pH为9～10，过滤，挥干，用4～6倍量的碱性氯仿反复溶解处理，收取碱性氯仿溶液，减压回收溶剂得膏状物，置升华管经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品。

2.如权利要求1所述的一种从豆科棘豆属和黄芪属植物中提纯苦马豆素的工艺，其特征在于：所述极性大孔吸附树脂选自市售的D101、YWD-03和YWD-06。