CN108344759B - 体外核磁信号实时检测方法和检测体系 - Google Patents

体外核磁信号实时检测方法和检测体系 Download PDF

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Abstract

本发明提供了体外核磁信号实时检测方法和检测体系。具体地，本发明提供了一种检测体系，所述检测体系为液相体系，包括：(1)顺磁探针(SPP)分子；(2)活细胞；和(3)产生核磁信号的代谢分子。本发明提供一种可以有效屏蔽活细胞外的分子核磁信号，仅实时检测活细胞内代谢分子信号的细胞内核磁检测体系、检测方法及其用途。本发明方法具有原位、实时、无损伤、可定量和高分辨率的特点，可以定量研究代谢分子在细胞内的多种代谢产物随时间的变化过程。

Description

体外核磁信号实时检测方法和检测体系
技术领域
本发明涉及活细胞内核磁检测领域。具体地，本发明涉及利用核磁波谱技术针对活细胞跨膜摄入的代谢产物定量检测和产物表征方法。
背景技术
核磁技术是一种被广泛应用于化合物表征和结构解析的技术方法。其中细胞内核磁检测技术主要用于研究细胞代谢组学和相互作用研究，相比于常用的细胞代谢分子的质谱检测技术，核磁技术的优点是无损伤、不需要破碎细胞，真正在活细胞条件下进行测试。同时核磁技术还具有可定量和高分辨的特点。
目前市场上与本发明最相近的检测方案是直接利用活细胞溶液进行核磁检查，其缺点是无法区分活细胞外和活细胞内两种不同环境下都可能存在的同一种物质，进而无法保证所测量的核磁信号只有而且仅有活细胞内的分子信息。而且，也无法直接实时测量活细胞从体外摄入代谢分子的动态过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以有效屏蔽活细胞外的分子核磁信号，仅实时检测活细胞内代谢分子信号的细胞内核磁检测体系、检测方法及其用途。
在本发明的第一方面，提供了一种检测体系，所述检测体系为液相体系，并且所述液相体系中含有：
(1)顺磁探针(SPP)分子；
(2)活细胞；和
(3)产生核磁信号的代谢分子。
在另一优选例中，所述液相体系为水相体系。
在另一优选例中，所述顺磁探针(SPP)分子为可溶性的顺磁探针分子。
在另一优选例中，所述顺磁探针(SPP)分子选自下组：
(a)Gd-DOTA或其衍生分子；
(b)Gd-DTPA-BMA或其衍生分子；
(c)TEMPOL或其衍生分子；
(d)Gd-EDTA或其衍生分子；
(e)Ln-(DPA)3或其衍生分子；
(f)上述(a)-(e)的任意组合。
在另一优选例中，在所述液相体系中，所述顺磁探针(SPP)分子的浓度为0.5-50mM，较佳地为1-30mM，更佳地为3-10mM。
在另一优选例中，所述活细胞选自：原核细胞、真核细胞或其组合。
在另一优选例中，所述活细胞选自：植物细胞、动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、病毒细胞。
在另一优选例中，所述活细胞选自：非人哺乳动物细胞、人的细胞。
在另一优选例中，所述活细胞选自：正常细胞、肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述活细胞选自：U937、Hela、HepG2、NKNT-3、CHO细胞。
在另一优选例中，所述活细胞包括悬浮培养细胞和贴壁培养细胞。
在另一优选例中，所述活细胞浓度为1×104-5×109细胞/ml，较佳地为1×105-1×109细胞/ml，较佳地为1×106-1×108细胞/ml。
在另一优选例中，所述产生核磁信号的代谢分子为同位素标记的分子。
在另一优选例中，所述同位素标记选自下组：1H、13C、15N、19F、31P、17O或其组合。
在另一优选例中，所述产生核磁信号的代谢分子选自下组：代谢物分子、影响代谢物分子摄入的物质、药物候选物、细胞内活性分子、或其组合。
在另一优选例中，所述代谢物分子选自下组：葡萄糖、氨基酸、脂类、核酸、或其组合。
在另一优选例中，影响代谢物分子摄入的物质选自下组：抗体、蛋白质、小分子化合物、提取物、多肽、或其组合。
在另一优选例中，所述药物候选物选自下组：细胞膜转运受体抑制剂、膜通道抑制剂、细胞内吞受体抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述顺磁探针(SPP)分子与代谢物分子的浓度比为0.2：1-1：10，较佳地1：1-1：5，更佳地为约1:1-1:3(如约1:2)。
在本发明的第二方面，提供了一种体外的核磁信号实时检测方法，包括步骤：
(1)提供本发明的第一方面所述的检测体系；
(2)对(1)中所述检测体系的细胞内的核磁信号进行测量，获得测量的胞内核磁信号；和
(3)任选地，基于(2)中所述测量的核磁信号进行分析。
在另一优选例中，所述检测方法为非诊断性和非治疗性的。
在另一优选例中，步骤(2)中用异核同位素编辑核磁波谱测量检测体系的核磁信号。
在另一优选例中，所述异核同位素编辑核磁波谱包括一维、二维和多维谱。
在另一优选例中，所述多维谱为快速多维谱。
在另一优选例中，在步骤(3)中对活细胞代谢分子摄入速度和/或过程进行分析。
在另一优选例中，所述的分析为实时分析。
在另一优选例中，在步骤(3)中，对活细胞内代谢分子产物的转化过程和/或浓度进行分析。
在另一优选例中，在步骤(3)中，对药物筛选和/或药效评价进行分析。
在另一优选例中，所述药物筛选和/或药效评价针对细胞膜通道或转移受体或内吞受体靶点。
在本发明的第三方面，提供了一种用于体外的对核磁信号进行实时检测的系统，所述系统包括：
(a)本发明的第一方面所述的检测体系；和
(b)用于检测所述检测体系中细胞内的核磁信号的核磁检测装置。
在另一优选例中，所述的核磁检测装置包括核磁共振波谱仪。
在另一优选例中，所述核磁共振波谱仪的磁场强度为1.5-25特斯拉。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明主要原理示意图。
图2为细胞外(或无细胞)核磁对照实验结果。
图3为细胞内核磁实验数据图。
图4为U937细胞摄入13C-葡萄糖速率受Cytochalasin B抑制剂的剂量响应图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，在检测体系中，通过在活细胞外引入可溶性顺磁探针(SPP)分子，可以使细胞外代谢分子的核磁信号快速驰豫不可测量，从而准确获得细胞内代谢分子的核磁信号(来自1H、13C、15N、19F、31P或17O等同位素标记物质)。本发明方法和检测体系具有原位、实时、无损伤、可定量和高分辨率的特点。具体地，基于本发明方法和检测体系，当代谢分子及其产物在细胞内发生浓度变化时，可以通过该方法实时原位检测。本发明方法和检测体系还可应用于相关药物筛选体系，如以细胞膜转运受体或细胞膜通道或细胞内吞受体为靶点的药物筛选。也可以应用于细胞的代谢组学研究和药效评价研究。在此基础上完成了本发明。
具体地，在一些实施例中，本发明人通过以13C标记-葡萄糖作为示例化合物，在活细胞溶液中加入5mM Gd-DOTA分子以屏蔽细胞外的所有分子核磁信号，通过测量1维13C编辑1H-13C相关谱图，实时原位检测了U937细胞摄入13C标记-葡萄糖的过程，实验结果表明，随着时间增加，细胞摄入13C-葡萄糖的量也逐步增加，核磁信号逐步增强。然后在有不同浓度的葡萄糖转运受体Glut1抑制剂Cytochalasin B(简称CB inhibitor)分子存在的情况下，获得U937细胞摄入13C-葡萄糖的速率受Cytochalasin B抑制剂的剂量响应实验，实验结果表明，1uM的Cytochalasin B抑制剂可以减缓Glut1转移受体蛋白质50％的转移速率，而大于10uM的Cytochalasin B抑制剂就可以完全阻断Glut1的葡萄糖的摄入。
术语
“Gd-DOTA”是指Gd-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N’,N”,N”’-tetraacetic acid)，分子式C16H24GdN4NaO8。所述的Gd-DOTA衍生分子包括：基于该Gd-DOTA而合成的或修饰的并且仍可作为顺磁探针(SPP)分子的衍生分子。代表性的衍生分子包括盐、酯、或其他衍生形式。
“Gd-DTPA-BMA”是指Gd-diethylenetriamine pentacetic acid-bismethylamide，分子式C16H26GdN5O8。所述衍生分子Gd-DTPA-BMA包括：基于该Gd-D TPA-BMA而合成的或修饰的并且仍可作为顺磁探针(SPP)分子的衍生分子。代表性的衍生分子包括盐、酯、或其他衍生形式。
“TEMPOL”是指4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基化合物(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl)，分子式C9H18NO2。
Figure BDA0001218762500000051
所述TEMPOL衍生分子包括：基于该TEMPOL分子而合成的或修饰的并且仍可作为顺磁探针(SPP)分子的衍生分子。代表性的衍生分子包括盐、酯、或其他衍生形式。
“Gd-EDTA”是指Gd-EDTA及其衍生分子包括：基于该Gd-EDTA分子而合成的或修饰的并且仍可作为顺磁探针(SPP)分子的衍生分子。代表性的衍生分子包括盐、酯、或其他衍生形式。
“Ln-(DPA)3”是指3吡啶二羧酸盐熬和镧系离子。所述Ln-(DPA)3衍生分子包括：基于该Ln-(DPA)3分子而合成的或修饰的并且仍可作为顺磁探针(SPP)分子的衍生分子。代表性的衍生分子包括盐、酯、或其他衍生形式。
细胞内核磁检测方法
在本发明中，提供了一种细胞内核磁检测方法，所述方法以活细胞为研究对象，利用液体核磁共振波谱技术，可实时地检测细胞样品中稳定同位素标记(1H、13C、15N、19F、31P、17O等)分子的核磁信号，从而获得该分子的化学环境和结构信息，进而实现对分子的定量和分子间的相互作用研究。
相比于常用的细胞代谢研究的质谱检测技术，本发明的细胞内核磁检测技术具有无损伤、不需要破坏细胞等显著优点。
异核同位素编辑核磁波谱
当采用本发明的核磁共振检测方法时，只要分子内含有异核同位素标记(如1H-13C或1H-15N等化学键)的分子，那么就能够有效地产生胞内的核磁信号。常用的细胞内核磁检测的异核同位素编辑谱有：一维13C编辑的1H-13C相关谱；一维15N编辑的1H-15N相关谱；快速两维谱或多维谱等。
在本发明中，采用异核同位素编辑核磁波谱可以有效地保证所采集到的核磁信号只来源于外源的同位素标记代谢分子，消除样品本底干扰，包括来自于1H的核磁信号干扰。
可溶性顺磁探针(SPP：Soluble Paramagnetic Probe)分子
在本发明的检测体系中，一种主要的物质是可溶性顺磁探针分子。
本发明人意外发现，当在本发明的检测体系中存在可溶于水或水性溶液的顺磁性分子，如Gd和Ln镧系金属螯合分子或含未配对电子的自由基分子等，这些SPP分子其对周围原子核会具有顺磁驰豫增强效应，该效应可以有效屏蔽一定距离范围内的核磁信号，屏蔽强度与距离r6成反比，距离越远屏蔽效果越弱。这样，检测体系中的可溶性顺磁探针分子可以有效屏蔽胞外的核磁信号，但是对于活细胞的胞内核磁信号却几乎无任何影响。
在本发明的一个实施例中，采用5mM Gd-DOTA分子，其屏蔽距离大约在3纳米以内，而细胞膜的厚度大约4纳米。实验表明，处于细胞外的Gd-DOTA分子可以有效屏蔽细胞外的核磁信号，而不影响细胞内的核磁信号被检测。
活细胞代谢分子摄入
指葡萄糖和氨基酸等细胞代谢分子，通过细胞膜上的特殊转运受体或通道(如Glut1和ASC)被摄入细胞内的过程。该过程的药物筛选包括针对这些受体或通道蛋白质的抑制剂筛选和药效评价试验。
检测体系
本发明提供了一种检测体系(参见图1)，所述检测体系为液相体系，其包括：
(1)顺磁探针(SPP)分子；
(2)活细胞；和
(3)产生核磁信号的代谢分子。
一种典型的检测体系为水相体系。
典型地，所述顺磁探针(SPP)分子为可溶性的。
在本发明中，可溶性顺磁探针(SPP)分子选自：
(a)Gd-DOTA或其衍生分子；
(b)Gd-DTPA-BMA或其衍生分子；
(c)TEMPOL或其衍生分子；
(d)Gd-EDTA或其螯合分子；
(e)Ln-(DPA)3或其衍生分子；
或其组合。
典型地，在本发明中，可溶性顺磁探针(SPP)分子的浓度为0.5-50mM，较佳地为1-30mM，更佳地为3-10mM。
在本发明中，活细胞选自：原核细胞、真核细胞或其组合。
在本发明中，活细胞选自：植物细胞、动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、病毒细胞。
在一个优选实施例中，活细胞选自：非人哺乳动物细胞、人的细胞。
在一个优选实施例中，活细胞选自：正常细胞、肿瘤细胞。
典型地，活细胞选自：U937、Hela、HepG2、NKNT-3细胞。
在一个优选实施例中，活细胞包括悬浮培养细胞和贴壁培养细胞。
在本发明中，产生核磁信号的分子为同位素标记的分子。
在一个优选实施例中，同位素标记选自：1H、13C、15N、19F、31P、17O或其组合。
在本发明中，产生核磁信号的分子选自：代谢物分子、影响代谢物分子摄入的物质、药物候选物、细胞内活性分子。
在一个优选实施例中，代谢物分子包括：葡萄糖、氨基酸、脂类、核酸。
典型地，影响代谢物分子摄入的物质包括抗体、蛋白质、小分子化合物、提取物、多肽。
在另一个优选实施例中，药物包括：细胞膜转运受体抑制剂、膜通道抑制剂、细胞内吞受体抑制剂。
典型地，在本发明中，所述顺磁探针(SPP)分子与代谢物分子的浓度比为1：1-1：5，较佳地为1:2。
检测系统
本发明还提供了一种用于体外的对核磁信号进行实时检测的系统，所述系统包括：
(a)本发明上述的检测体系；和
(b)用于检测所述检测体系中细胞内的核磁信号的核磁检测装置。
典型地，所述的核磁检测装置包括核磁共振波谱仪。
在另一优选例中，所述核磁共振波谱仪的磁场强度为1.5-25特斯拉。
发明机理
为了便于理解本发明，提供了以下发明机理供参考。应理解，本发明的保护范围并不受上述发明机理的限制。
该发明是通过对活细胞开展特殊的液体核磁波谱检测，原理如图1所示，在活细胞外加入特定的可溶性顺磁性探针(SPP)分子，其可以有效的屏蔽活细胞外代谢分子质的核磁信号；同时由于该SPP分子在测量时间内不能有效进入细胞，而且细胞膜的厚度正好使胞外的SPP分子对胞内没有顺磁效应。所以这种情况下，利用核磁检测技术采集到的活细胞溶液的核磁信号，只有而且仅有活细胞内的代谢分子质(1H、13C、15N、19F、31P、17O等同位素标记物质)及其转化物分子的核磁信息。
该发明条件下采集到的核磁信号，可以包括活细胞内被摄入的代谢分子质及其代谢产物分子的化学结构，含量和转化动力学等信息。该发明可以用于有不同抑制剂浓度条件下对比活细胞摄入代谢分子速度的差异，从而达到针对细胞膜上特定转移受体或通道的药物筛选和药效评价的目的。也可以用于实时测量细胞内代谢分子结构变化和浓度变化的过程，从而达到实时定量细胞内代谢途径研究的目的。
相比较于已报道的活细胞核磁检测技术，该方法只有而且仅有活细胞内分子的核磁信息，完全屏蔽细胞外的干扰，同时具有原位、实时、无损伤、可定量和高分辨率的特点。
检测方法
本发明还提供了一种体外核磁信号实时检测方法，所述方法包括步骤：
(1)提供本发明所述的检测体系；
(2)测量(1)中检测体系的细胞内核磁信号；和
(3)任选地，基于(2)中测量的核磁信号进行分析。
优选地，所述检测方法为非诊断性的。
在一个优选实施例中，步骤(2)中用异核同位素编辑核磁波谱测量检测体系的核磁信号。
典型地，所述异核同位素编辑核磁波谱包括一维、二维和多维谱。
在另一个优选实施例中，所述多维谱为快速多维谱。
本发明还提供一种可以实时测量活细胞外的代谢分子摄入速度和其药物筛选的细胞内核磁检测方法。
现参见图1，进一步阐述本发明方法的检测过程。
(1)由于细胞膜的存在，活细胞被隔离成细胞外和细胞内两种环境，细胞的跨膜分子转运主要是通过细胞膜上的转运受体或通道蛋白质完成。本发明首先在活细胞外引入特殊的不可穿透膜的可溶性顺磁探针(SPP)分子。由于SPP分子对周围原子核的顺磁驰豫增强效应是与其距离r6成反比，距离小于3纳米的分子的核磁信号受到明显的顺磁效应影响，核磁信号被屏蔽。通过调节SPP分子浓度，可以使大于3纳米的分子不受影响。由于细胞膜的厚度恰好是在4纳米左右，当细胞外有SPP分子的存在，细胞外的所有分子无法检测到核磁信号。相反，此时细胞内的分子不受影响，可以被测量到核磁信号。
(2)在此条件下，在如上活细胞溶液中快速加入同位素标记(1H，13C或15N等标记)的代谢分子，并同时利用液体核磁的快速检测技术(如一维13C编辑的1H-13C HSQC谱图或一维15N编辑的1H-15NHSQC谱图或快速两维HSQC/HMQC谱图等)采集代谢分子的核磁信号。当该代谢分子没有进入细胞，由于同环境中SPP分子的存在，该代谢分子的核磁信号被屏蔽。
(3)随着该代谢分子被活细胞逐步摄入，SPP分子距离细胞内的被摄入分子开始大于4纳米，此时代谢分子的核磁信号可以检测到。所以，此时利用细胞内核磁检测方法观察到的核磁信号只有而且仅有细胞内的同位素标记代谢分子及其转化产物的核磁信号。
(4)到此，就可以根据步骤(3)的方法测量细胞内代谢分子的核磁信号强度随时间的变化过程，从而计算出该代谢分子被活细胞摄入的速度。
(5)也可以根据步骤(3)的方法通过一系列核磁谱图探测到细胞内代谢分子的产物或转化物的出现过程，并定量分析代谢通路流量随时间的变化。
(6)如上发明内容(1)到(5)，可以用来准确测量代谢分子进入活细胞的速度和代谢过程。也可以用于开展针对细胞膜通道或转移受体蛋白质为靶点的药物筛选或药效评价过程。
(7)该发明可以完全屏蔽活细胞外的分子信号干扰，只针对活细胞内，同时具有原位、可实时、无损伤、可定量和高分辨率的特点。
用途
本发明还提供了所述体外核磁信号实时检测方法的用途，所述检测方法用于实时测量活细胞代谢分子摄入速度和过程。
在一个优选实施例中，所述检测方法用于检测活细胞内代谢分子产物的转化过程和浓度。
在另一个优选实施例中，所述检测方法用于药物筛选和/或药效评价。
典型地，所述药物筛选和/或药效评价针对细胞膜通道或转移受体或内吞受体靶点。
可用本发明方法和检测体系检测的代表性代谢物没有特别限制，包括(但并不限于)：代谢物分子、影响代谢物分子摄入的物质、药物候选物、细胞内活性分子、或其组合。
优选地，所述代谢物分子选自下组：葡萄糖、氨基酸、脂类、核酸、或其组合。
优选地，影响代谢物分子摄入的物质选自下组：抗体、蛋白质、小分子化合物、提取物、多肽、或其组合。
优选地，所述药物候选物选自下组：细胞膜转运受体抑制剂、膜通道抑制剂、细胞内吞受体抑制剂、或其组合。
一些代表性代谢物的种类和代表性的测量浓度列于表1。
表1 使用本发明的检测方法和检测体系可检测的代谢物
代谢物 测量浓度 示例
糖类 0.1～100mM 10mM
脂质 0.1～100mM 10mM
氨基酸 0.1～100mM 10mM
本发明的主要优点在于：
与目前文献中已报道的核磁技术利用顺磁探针分子研究生物大分子的结构和功能关系的技术相比，本发明在实验原理、技术路线、实验对象、检测目的和应用方向等方面都不相同。相比较于目前已有的活细胞核磁检测技术：
(1)本发明方法只有而且仅有活细胞内代谢分子的核磁信号，完全屏蔽活细胞外的分子信号干扰；
(2)本发明方法具有原位、实时、无损伤、可定量和高分辨率的特点；
(3)本发明方法可以原位实时定量测量活细胞摄入代谢分子的过程；
(4)本发明方法可以定量研究代谢分子在细胞内的多种代谢产物随时间的变化过程。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明中所涉及的实验试剂和设备，如无特殊说明，均可从市售渠道获得。
实施例1：细胞外对照实验
以Gd-DOTA化合物作为SPP分子为例，5mM Gd-DOTA就可以明显屏蔽10mM13C-葡萄糖的核磁信号，有效屏蔽距离3纳米。如图2所示，黑色曲线代表10mM13C-葡萄糖的一维13C编辑1H-13C相关谱，在此样品中加入5mM SPP分子Gd-DOTA，可以对13C-葡萄糖的核磁信号产生明显的顺磁驰豫增强效应，从而达到有效屏蔽细胞外13C-葡萄糖的核磁信号的目的。
实施例2：细胞内实验
U937细胞摄入13C标记-葡萄糖的过程：
第一步：取悬浮培养细胞U937总数约5*107个,溶解于500uL哺乳动物细胞培养液(含10％ D2O)中，在活细胞溶液中加入5mM Gd-DOTA分子，在液体核磁谱仪上采集1维13C编辑1H-13C相关谱图。由于Gd-DOTA分子的存在，细胞外的所有分子核磁信号将快速驰豫，无核磁信号。同时由于细胞溶液中还没有加入外源13C同位素标记的物质，故细胞内也无核磁信号(如图3所示)，此时数据为基线，即细胞在没有13C标记代谢分子质时的核磁本底信号。
第二步：在此细胞溶液中，快速加入10mM 13C-葡萄糖，快速采集1维13C编辑1H-13CHSQC谱图，每3分钟采集一次谱图，共采集10个时间点。如图3所示，随着时间增加，细胞摄入13C-葡萄糖的量也逐步增加，核磁信号逐步增强。不同颜色代表不同核磁采集时间点。
第三步：同理，可以在有不同浓度的葡萄糖转运受体Glut1抑制剂Cytochalasin B(图3上简称CB inhibitor)分子存在的情况下，如1uM,10uM和200uM Cytochalasin B浓度下，重复如上第二步的实验，从而获得U937细胞摄入13C-葡萄糖的速率受Cytochalasin B抑制剂的剂量响应实验(如图4所示)。
第四步：通过活细胞内13C-葡萄糖的核磁信号随时间增长的线性关系图(如图4所示)，可以计算出活细胞摄入13C-葡萄糖的速度。该实验结果表明，1uM的Cytochalasin B抑制剂可以减缓Glut1转移受体蛋白质50％的转移速率，而大于10uM的Cytochalasin B抑制剂就可以完全阻断Glut1的葡萄糖的摄入。
实施例3:改进的检测方案
由于核磁谱仪传递样品需要时间和实验操作速度的限制，从活细胞溶液加入同位素标记代谢分子到可以测量出第一个核磁信号，大约有1到2分钟的死时间，此段死时间内代谢分子已经部分被细胞摄入，但是核磁还没有开始采集数据。
为此，可以通过两种方法有效缩短该死时间：(1)安装样品快速混匀装置；(2)加快核磁谱仪的样品传递速度。
此外，也可以通过调节活细胞实验温度，改变SPP分子浓度，改变代谢分子浓度，或加入针对细胞膜上特异性转运受体蛋白质抑制剂的浓度，从而调控细胞代谢速度和信号强度，来优化该发明方案中细胞内核磁信号的变化速度，以便更好地进行检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (21)

1.一种检测体系，其特征在于，所述检测体系为液相体系，并且所述液相体系中含有：
(1)顺磁探针(SPP)分子；
(2)活细胞；和
(3)产生核磁信号的代谢分子；
并且，所述顺磁探针(SPP)分子的浓度为1-30mM；
并且，所述顺磁探针(SPP)分子与代谢分子的浓度比为1:1-1:3。
2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述顺磁探针(SPP)分子选自下组：
(a)Gd-DOTA或其衍生分子；
(b)Gd-DTPA-BMA或其衍生分子；
(c)TEMPOL或其衍生分子；
(d)Gd-EDTA或其衍生分子；
(e)Ln-(DPA)3或其衍生分子；
(f)上述(a)-(e)的任意组合。
3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，在所述液相体系中，所述顺磁探针(SPP)分子的浓度为3-10mM。
4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述活细胞选自：植物细胞、动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、病毒细胞。
5.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述产生核磁信号的代谢分子为同位素标记的分子。
6.如权利要求5所述的检测体系，其特征在于，所述同位素标记选自下组：1H、13C、15N、19F、31P、17O或其组合。
7.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述产生核磁信号的代谢分子选自下组：代谢物分子、影响代谢物分子摄入的物质、药物候选物、细胞内活性分子、或其组合。
8.如权利要求7所述的检测体系，其特征在于，所述代谢物分子选自下组：葡萄糖、氨基酸、脂类、核酸、或其组合。
9.如权利要求7所述的检测体系，其特征在于，所述影响代谢物分子摄入的物质选自下组：抗体、蛋白质、小分子化合物、提取物、多肽、或其组合。
10.如权利要求7所述的检测体系，其特征在于，所述药物候选物选自下组：细胞膜转运受体抑制剂、膜通道抑制剂、细胞内吞受体抑制剂、或其组合。
11.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述顺磁探针(SPP)分子与代谢分子的浓度比为1:2。
12.一种体外的核磁信号实时检测方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供权利要求1所述的检测体系；
(2)对(1)中所述检测体系的细胞内的核磁信号进行测量，获得测量的胞内核磁信号；和
(3)任选地，基于(2)中所述测量的核磁信号进行分析。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(2)中用异核同位素编辑核磁波谱测量检测体系的核磁信号。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述异核同位素编辑核磁波谱包括一维、二维和多维谱。
15.权利要求12或13所述的检测方法，其特征在于，在步骤(3)中对活细胞代谢分子摄入速度和/或过程进行分析。
16.权利要求12或13所述的检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，对活细胞内代谢分子产物的转化过程和/或浓度进行分析。
17.权利要求12或13所述的检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，对药物筛选和/或药效评价进行分析。
18.如权利要求17所述的检测方法，其特征在于，所述药物筛选和/或药效评价针对细胞膜通道或转移受体或内吞受体靶点。
19.一种用于体外的对核磁信号进行实时检测的系统，其特征在于，所述系统包括：
(a)权利要求1所述的检测体系；和
(b)用于检测所述检测体系中细胞内的核磁信号的核磁检测装置。
20.如权利要求19所述的系统，其特征在于，所述的核磁检测装置包括核磁共振波谱仪。
21.如权利要求20所述的系统，其特征在于，所述核磁共振波谱仪的磁场强度为1.5-25特斯拉。
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