CN104152563B - 一种检测污染水体中猪粪的pcr试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒及其检测方法，属于水体污染检测领域。一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒，包括4种巢式PCR引物、dNTP、PCR？buffer、Mg2+溶液和ddH2O，使用两轮PCR扩增，巢式PCR引物SPF1、SPR1的检测阈值为0.254ng/ul猪粪DNA，巢式PCR引物NPF1、NPR1的检测阈值为0.008ng/ul猪粪DNA，在第一轮PCR扩增后未检测出污染时，可以进行第二轮PCR扩增。通过PCR手段检测水体猪线粒体DNA来判断粪便污染，具有良好的特异性，降低了对检测样本的误判，可以实现快速、准确地检测水体中的微量猪粪污染。

Description

一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及水体污染检测领域，更具体地说，涉及一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒及其检测方法。
背景技术
近年来，我国水体污染日趋严重，严重威胁着人们的生存环境和健康用水，并对社会造成了严重的经济损失。随着太湖流域养殖业的迅猛发展，养殖业废水已成为该流域水体污染的主要来源之一，2011年太湖流域畜禽养殖业巨大，其中生猪约400万头，预计到2015年养殖量还将上升5％。生猪养殖产生大量粪便污染物未经处理便直接排放到环境中，造成了极大的污染。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成富营养化，并且会带入粪便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播。进行水体污染的控制和治理已经刻不容缓。
粪便污染的潜在污染源种类繁多，呈现面源特征，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治理工作只停留在“见污治污”阶段，在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区分水体中粪便污染主要来源，从而快速、准确地确定污染源，成为了解决问题的关键。传统方法通过检测水中粪便污染指示菌(如大肠杆菌、肠球菌等)来判断水体粪便污染情况，耗时长且无法区分污染源。通过检测水体宿主特异性微生物或化学标志物，可以达到粪便污染溯源的目的，但现存的一些微生物及化学标志物特异性不高，往往导致假阳性结果的产生。2000年，Pierre等最先证实粪便中的线粒体DNA(mtDNA)具有其种属特异性，并且动物粪便中含有较高丰度的mtDNA，通过PCR手段能够检测到明显的mtDNA信号，因此提出了“水体粪便污染的mtDNA溯源方法”。
以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为水体粪便污染的检测提供了强有力的工具。通过特异性引物PCR扩增水体中的目标线粒体DNA片段，即可检测样品是否受到潜在的粪便污染，用时短且准确度高。另外通过设计特异性的巢式PCR引物进行二次扩增，极大的提高了方法的灵敏度，能够检测到水体中的微量粪便污染。
目前国内对水体粪便污染溯源研究较少，本发明基于猪mtDNA设计的一组特异性巢式PCR引物及实验方法能够快速、准确地检测水体中的微量猪粪污染，国内外均未见报道。
发明内容
1.要解决的技术问题
针对现有技术中存在的水体中猪粪污染检测困难、灵敏度不高问题，本发明提供了一种检测水体猪粪污染的PCR试剂盒及检测方法，它可以实现快速、准确地检测水体中的微量猪粪污染。
2.技术方案
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒，包括4种巢式PCR引物、dNTP、PCRbuffer、Mg2+溶液和ddH2O，4种巢式PCR引物为：
SPF1：5’-CTACTCATACCCAGCAAGCC-3’
SPR1：5’-TAGGAATTAATAGGGCGGGTG-3’
NPF1：5’-TACCCAGCAAGCCCAGAATC-3’
NPR1：5’-GATTGTGCGGTTATTAATGAGTCGTT-3’。
更进一步的，PCRbuffer为10×PCRbuffer。
更进一步的，巢式PCR引物SPF1、SPR1的检测阈值为0.254ng/ul猪粪DNA，巢式PCR引物NPF1、NPR1的检测阈值为0.008ng/ul猪粪DNA。
一种PCR试剂盒检测污染水体中猪粪的检测方法，其步骤为：
(1)从待测水样中提取DNA作为模板；
(2)进行第一轮PCR扩增，2.5ul的10×PCRbuffer；2.5uldNTP；2ulMg2+；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SPF1、SPR1；2ul模板DNA；灭菌ddH2O补足至25ul；
反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存；
(3)检验PCR扩增产物：5ulPCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，1×TAE作为电泳缓冲液，用EB染色，在紫外灯下观测，若存在490bp的条带，表明水体受到了猪粪污染，若不存在，则进行下一步骤；
(4)以步骤(2)的PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，2.5ul的10×PCRbuffer；2.5uldNTP；2ulMg2+；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物NPF1、NPR1；2ul第一轮PCR扩增产物；灭菌ddH2O补足至25ul；
反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，59℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存；
(5)检验第二轮PCR扩增产物：5ulPCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，1×TAE作为电泳缓冲液，用EB染色，在紫外灯下观测，若存在194bp的条带，则表明水体收到了猪粪污染，但程度较轻若不存在，则表明水体未受到猪粪污染。
更进一步的，步骤(3)和步骤(5)中1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明通过PCR手段检测水体猪线粒体DNA来判断粪便污染，具有良好的特异性，降低了对检测样本的误判；
(2)本发明采用巢式PCR方法检测水体猪粪污染，开发的特异性巢式PCR引物大大增加了方法的灵敏度，能够检测到水体中的微量猪粪污染，在水体粪便污染检测及污染防控预警等方面，具有很高的应用价值；
(3)本发明采用二段检测方法，第一段检测成功，则省去了后续步骤，检测不成功时才进行下一步的探测，有效的节约了成本和时间，使得检测效率提升。
附图说明
图1：本发明的操作流程示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。
实施例1：
一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒，包括4种巢式PCR引物、dNTP、PCRbuffer、Mg2+溶液和ddH2O，引物由上海生工生物技术有限公司合成，4种巢式PCR引物为：
SPF1：5’-CTACTCATACCCAGCAAGCC-3’
SPR1：5’-TAGGAATTAATAGGGCGGGTG-3’
NPF1：5’-TACCCAGCAAGCCCAGAATC-3’
NPR1：5’-GATTGTGCGGTTATTAATGAGTCGTT-3’。
PCRbuffer为10×PCRbuffer。
粪便DNA提取试剂盒(QIAampDNAStoolMiniKit)购于新科元生物，用于对DNA进行提取，本发明可以对各种环境水样进行检测。
称取0.2克猪粪提取DNA，采用二倍和四倍稀释法对猪粪DNA进行稀释，得到1/4、1/16、1/64、1/256、1/512、1/1024、1/4076、1/16284猪粪DNA，各取2ul稀释后的猪粪DNA溶液做模板用特异性引物SPF1、SPR1进行PCR扩增，PCR反应条件反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果，以检测引物的灵敏度。
猪粪DNA稀释512倍后的PCR产物仍能检测到490bp的产物，当稀释倍数大于512倍时则检测不到，表明第一轮PCR的检测限为1/512猪粪DNA，对应浓度为0.254ng/ul。可以测得巢式PCR引物SPF1、SPR1的检测阈值为0.254ng/ul猪粪DNA。
当猪粪DNA稀释16284倍后，经过两轮PCR反应能检测到194bp的产物，当稀释倍数大于16284倍时则检测不到，表明第二轮PCR的检测限为1/16284猪粪DNA，对应浓度为0.008ng/ul。可以测得巢式PCR引物NPF1、NPR1的检测阈值为0.008ng/ul猪粪DNA。
如图1所示，一种PCR试剂盒检测污染水体中猪粪的检测方法，其步骤为：
(1)采集水样，环境样品S1、S2、S3采集于一处养猪场排污下游河流，样品采集后用0.45um滤膜过滤，按照QIAampDNAStoolMiniKit试剂盒的DNA提取步骤提取DNA，DNA溶液(200ul)保存于-20℃备用。
(2)将提取的水样S1、S2、S3的DNA溶液稀释100倍，以稀释后的水样S1、S2、S3的DNA样品为模板，进行第一轮PCR扩增，添加2.5ul的10×PCRbuffer；2.5uldNTP；2ulMg2+；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SPF1、SPR1；2ul模板DNA；灭菌ddH2O补足至25ul。
反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
(3)检验PCR扩增产物：取5ulPCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，1×TAE作为电泳缓冲液，用EB染色，在紫外灯下观测，电泳结果显示，样品S1、S2、S3中未检测到长度为490bp的产物的存在，进行下一轮PCR扩增。
(4)以步骤(2)的PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，2.5ul的10×PCRbuffer；2.5uldNTP；2ulMg2+；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物NPF1、NPR1；2ul第一轮PCR扩增产物；灭菌ddH2O补足至25ul。
反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，59℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
(5)检验第二轮PCR扩增产物：5ulPCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，1×TAE作为电泳缓冲液，用EB染色，在紫外灯下观测，电泳结果显示，经过第二轮PCR反应，S1、S2、S3样品中检测到了长度为194bp的产物的存在，说明采样点受到了猪粪污染。其在样品稀释了100倍之后经过两轮PCR反应，测出了其猪粪污染，表明其检测的灵敏性。
实施例2：
实施例2所用的试剂盒与实施例1中相同，不同点在于，其步骤(2)中，将提取的水样S1、S2、S3的DNA溶液不进行稀释，直接进行检测。
步骤(2)中以水样S1、S2、S3的DNA样品直接为模板，进行第一轮PCR扩增，添加2.5ul的10×PCRbuffer；2.5uldNTP；2ulMg2+；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SPF1、SPR1；2ul模板DNA；灭菌ddH2O补足至25ul。
反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。
检验PCR扩增产物：提取5ulPCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min，1×TAE作为电泳缓冲液，用EB染色，在紫外灯下观测，电泳结果显示，样品S1、S2、S3中检测到长度为490bp的产物的存在，水体受到了猪粪污染。其在样品未稀释之后仅需要一轮PCR反应，测出了其猪粪污染，可以快捷的对猪粪进行检测。
以上示意性地对本发明创造及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明创造的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本专利的保护范围。

Claims (3)

1.一种检测污染水体中猪粪的PCR试剂盒，包括4种巢式PCR引物、dNTP、PCRbuffer、Mg2 +溶液和ddH2O，其特征在于：所述的4种巢式PCR引物为：
SPF1：5’-CTACTCATACCCAGCAAGCC-3’
SPR1：5’-TAGGAATTAATAGGGCGGGTG-3’
NPF1：5’-TACCCAGCAAGCCCAGAATC-3’
NPR1：5’-GATTGTGCGGTTATTAATGAGTCGTT-3’；
所述的PCRbuffer为10×PCRbuffer，所述的巢式PCR引物SPF1、SPR1的检测阈值为0.254ng/ul猪粪DNA，巢式PCR引物NPF1、NPR1的检测阈值为0.008ng/ul猪粪DNA。
2.采用权利要求1中所述的PCR试剂盒检测污染水体中猪粪的检测方法，其步骤为：
(1)从待测水样中提取DNA作为模板；
(2)进行第一轮PCR扩增，2.5ul的10×PCRbuffer；2.5uldNTP；2ulMg2+；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物SPF1、SPR1；2ul模板DNA；灭菌ddH2O补足至25ul；
反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存；
(3)检验PCR扩增产物：5ulPCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，1×TAE作为电泳缓冲液，用EB染色，在紫外灯下观测，若存在490bp的条带，则表明水体受到了猪粪污染，若不存在，则进行下一步骤；
(4)以步骤(2)的PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，2.5ul的10×PCRbuffer；2.5uldNTP；2ulMg2+；0.5ul浓度为10umol/L上、下游引物NPF1、NPR1；2ul第一轮PCR扩增产物；灭菌ddH2O补足至25ul；
反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，59℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存；
(5)检验第二轮PCR扩增产物：5ulPCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，1×TAE作为电泳缓冲液，用EB染色，在紫外灯下观测，若存在194bp的条带，则表明水体受到了猪粪污染；若不存在，则表明水体未受到猪粪污染。
3.根据权利要求2所述的采用PCR试剂盒检测污染水体中猪粪的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)和步骤(5)中1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA，时间25min。
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