CN104152376B - 芽孢保护剂、应用及微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种芽孢保护剂、应用及微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法，芽孢保护剂，包括氯化钠浓度为8～10％的生理盐水以及用量为生理盐水用量1～5wt.％的聚天冬氨酸。本发明提供的芽孢杆菌保护剂能保护已经萌发的芽孢，使其70℃以内的灭菌温度下仍能继续在培养基中生长，从而保证了后续对微生物肥料中芽孢菌含量的检测准确性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物肥料检测领域，特别地，涉及一种芽孢保护剂、应用及微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法。
背景技术
现有技术中，对微生物肥料中活菌数的检测一直沿用农业部的检测标准。检测方法为：将菌剂制品通过稀释，将稀释到一定浓度的菌液接入预先制备好的平板检测培养基中，培养后，对培养基中的菌落数进行肉眼观察计数，从而计算得出产品的含菌数。为了保证检测的准确性，需根据肥料中所含菌种类，分别选择对应的培养基进行培养。
对微生物肥料中各种以芽孢形式存在的细菌含量的检测结果常出现较大偏差。这主要是因为检测时各类芽孢菌的芽孢还未萌发，检测出的总菌数中不含这些以芽孢形式存在的细菌的数量，从而降低了微生物肥料中实际的含菌量。
发明内容
本发明目的在于提供一种芽孢保护剂、应用及微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法，以解决现有技术中微生物肥料中以芽孢形式存在的芽孢含量无法准确获知的技术问题。
为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种芽孢保护剂，包括氯化钠浓度为8～10％的生理盐水以及用量为生理盐水用量1～5wt.％的聚天冬氨酸。
进一步地，由氯化钠浓度为8～10％的生理盐水以及用量为生理盐水用量1～5wt.％的聚天冬氨酸组成。
进一步地，由氯化钠浓度为8.5％的生理盐水以及用量为生理盐水用量4wt.％的聚天冬氨酸组成。
根据本发明的另一方面还提供了一种上述的芽孢保护剂在灭菌处理中的应用。
进一步地，包括以下步骤：将含芽孢萌发菌体的待处理物分散于芽孢保护剂中，得到菌悬液；在70～80℃下对菌悬液进行灭菌处理。
根据本发明的另一方面还提供了一种微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法，包括以下步骤：1)将待检测肥料分散于如上述的芽孢保护剂中，配置成菌悬液；2)对菌悬液在70～80℃下水浴15分钟进行灭菌处理，得到灭菌悬液；3)将灭菌悬液接种至芽孢培养基中，培养后形成菌落，根据芽孢培养基上所形成菌落数量计数后，得出待检测肥料的含菌量。
进一步地，芽孢培养基为由胰蛋白胨4.0～6.0g/L、酵母浸粉2.0～3.0g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、七水硫酸镁0.2～1g/L、氯化钠0.5～1.5g/L、碳酸钙0.5～1.5g/L、磷酸氢二钾2.0～3.0g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC0.01g/L和琼脂16～20g/L组成。
进一步地，芽孢培养基为由胰蛋白胨5.0g/L、酵母浸粉2.5g/L、葡萄糖1.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钠1.0g/L、碳酸钙1.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC0.01g/L和琼脂16g/L组成。
进一步地，菌悬液中还包括1～2滴/L分散剂。
进一步地，分散剂为吐温或OP-10。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的芽孢杆菌保护剂能保护已经萌发的芽孢，使其70℃以内的灭菌温度下仍能继续在培养基中生长，从而保证了后续对微生物肥料中芽孢菌含量的检测准确性。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明提供的芽孢杆菌保护剂包括氯化钠浓度为8～10％的生理盐水以及用量为生理盐水用量1～5wt.％的聚天冬氨酸。
现有技术中聚天冬氨酸多被用作肥料增效剂，可以强化作物对N，P，K及微量元素的全面吸收，效果显著，适用于多种作物和土壤。而本发明通过试验发现将其用于分散含芽孢的待检测样品，能保护其中以及已经萌发的芽孢菌种，防止其在后续去除其他杂菌的加热过程中失活，而无法在培养阶段继续生长，从而影响检测所得含菌数的准确性。通过添加此比例的聚天冬氨酸后，能对分散于其中的待测物料中所含已经萌发的芽孢菌体起到保护作用。
聚天冬氨酸因含有肽键和羧基等活性基团的结构特点，具有极强的螯合、分散、吸附等作用，且配伍性极佳。具体的机理不得而知，猜测可能是由于聚天冬氨酸能附着于萌发后的芽孢菌体表面，阻挡高温对菌体的损伤。作为70℃的萌发芽孢菌体保护剂十分的有效。生理盐水有维持细胞正常渗透压的作用，从而起到保护芽孢菌的作用。二者联合使用起到对萌发芽孢菌体的保护作用。
优选由氯化钠浓度为8～10％的生理盐水以及用量为生理盐水用量1～5wt.％的聚天冬氨酸组成。更有选此时该保护剂对芽孢菌萌发菌体的保护效果较优。经过70℃下水浴15分钟后，萌发菌体存活率可达到80％以上。
更优选的由氯化钠浓度为8.5％的生理盐水以及用量为生理盐水用量4wt.％的聚天冬氨酸组成。此时经过70℃下水浴15分钟后，萌发芽孢菌体存活率可达到90％以上。
优选保护剂的保护条件为70～80℃下水浴15分钟。此温度和水浴时间下，保护剂能有效保护萌发芽孢菌体，同时能将待检测物料中的其他非芽孢萌发菌体杀灭。起到提高检测结果准确性的作用。
本发明另一方面还提供了一种上述的芽孢保护剂在灭菌处理中的应用。包括以下步骤：将含芽孢萌发菌体的待处理物分散于芽孢保护剂中，得到菌悬液；在70～80℃下对菌悬液进行灭菌处理。本发明提供的芽孢保护剂通过对芽孢萌发菌体起到保护作用，保护其分散成为菌悬液后再70～80℃下不被杀灭。
优选分散步骤包括在200r/分钟的摇床上振荡60分钟。在此条件下进行分散能提高菌体的分散均匀性。防止局部菌体浓度过高导致的萌发菌体受损死亡。
本发明另一方面还提供了一种微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法，包括以下步骤：
1)将待检测肥料分散于如前述的芽孢保护剂中，配置成菌悬液；
2)对菌悬液在70～80℃下水浴15分钟进行灭菌处理，得到灭菌悬液；
3)将灭菌悬液接种至芽孢培养基中，培养后形成菌落，根据芽孢培养基上所形成菌落数量计数后，得出待检测肥料的含菌量。
采用该方法能有效检测微生物肥料中芽孢类细菌的数量，如固氮类芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等等菌种。采用该方法结合上述芽孢保护液，能有效保护微生物肥料中已经萌发的芽孢体避免在灭菌过程中被杀灭。同时灭菌过程能保证将菌悬液中的其他菌体杀灭。在分散带检测肥料时可以在其中加入分散剂。分散剂的加入量为1～2滴/L。分散剂能将菌悬液中的抱团菌体分散开，防止抱团后稀释过程中无法将其有效分开，而导致检测结果不准确。分散剂可以为常用的各类分散剂，优选为吐温或OP-10(烷基酚聚氧乙烯醚)。分散效果较优。
经过灭菌处理的菌悬液需要按常规方法进行稀释。稀释倍数根据待检测肥料中菌种数量进行按常规方法进行选择。可参考平板培养法中的稀释方法进行。
之后将灭菌后的菌悬液接种至芽孢培养基中。优选芽孢培养基为由胰蛋白胨4.0～6.0g/L、酵母浸粉2.0～3.0g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、七水硫酸镁0.2～1g/L、氯化钠0.5～1.5g/L、碳酸钙0.5～1.5g/L、磷酸氢二钾2.0～3.0g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC0.01g/L和琼脂16～20g/L组成。按此比例制得的芽孢培养基具有促进菌悬液中未萌发芽孢萌发的作用。尤其还能有利于得到芽孢保护液保护的芽孢萌发体进一步萌发生长。该培养基中胰胨、酵母浸粉提供氮源、维生素和生长因子；七水硫酸镁、氯化钠维持均衡的渗透压和增强细胞活力；葡萄糖提供碳源；碳酸钙，磷酸氢二钾为缓冲剂；硫酸锰促进芽孢菌生长，形成芽孢；TTC(氯化三苯四氮唑)是显色剂，TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲月赞，用来表示细胞的活力；琼脂是培养基的凝固剂。硫酸锰的加入量，既能促进芽孢菌生长，形成芽孢，又能避免对生长中的菌体的毒害作用。
更优选芽孢培养基为由胰蛋白胨5.0g/L、酵母浸粉2.5g/L、葡萄糖1.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钠1.0g/L、碳酸钙1.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC0.01g/L和琼脂16g/L组成。该培养基对芽孢体及受保护萌发体有效生长。就生长的细菌数和菌落直径而言，该培养基优于《中国药典》中所使用细菌计数营养琼脂培养基(NA)。
灭菌处理时，菌悬液经过70℃后迅速冷却至30～40℃以便有效杀死其中的非芽孢类细菌而使芽孢类细菌萌发菌体更好的萌发生长。热处理一方面杀死营养体，也能分散菌团。水浴完迅速冷却。冷却后的菌悬液还需经过旋转式摇床上200r/分钟，充分振荡40～60分钟，得到灭菌液。
实施例
以下实施例和对比例中所用物料和仪器均为市售。
存活率＝(70℃处理菌悬液测得的活菌数/未经热处理常温菌悬液测得的活菌数)*100％
检测结果与标注菌数的正负偏差(％)＝{(检测菌数-标注菌数)/标注菌数}*100％
实施例1
1)将待检测肥料(标注含菌量为50亿/克)分散于芽孢保护剂(氯化钠浓度为10％的生理盐水和生理盐水5wt.％的聚天冬氨酸、1滴吐温)中，配置成菌悬液；
2)用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后菌悬液在70℃下水浴15分钟，迅速冷却到40℃，上旋转式摇床上200r/分钟充分振荡60分钟，得到灭菌悬液；
3)对灭菌悬液稀释10-7倍接种至芽孢培养基中，培养后形成菌落，根据芽孢培养基上所形成菌落数量计数后，得出待检测肥料的含菌量；
其中芽孢培养基为由胰蛋白胨6.0g/L、酵母浸粉3.0g/L、葡萄糖1.5g/L、七水硫酸镁1g/L、氯化钠1.5g/L、碳酸钙1.5g/L、磷酸氢二钾3.0g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC0.01g/L和琼脂16g/L组成。
实施例2
1)将待检测肥料(标注含菌量为45亿/克)分散于芽孢保护剂(氯化钠浓度为8％的生理盐水和生理盐水1wt.％的聚天冬氨酸)中，配置成菌悬液；
2)用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后菌悬液在75℃下水浴15分钟，迅速冷却到30℃，上旋转式摇床上200r/分钟充分振荡40分钟，得到灭菌悬液；
3)对灭菌悬液稀释10-7倍接种至芽孢培养基中，培养后形成菌落，根据芽孢培养基上所形成菌落数量计数后，得出待检测肥料的含菌量；
其中芽孢培养基为由胰蛋白胨4.0g/L、酵母浸粉2.0g/L、葡萄糖0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.5g/L、碳酸钙0.5g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC0.01g/L和琼脂18g/L组成。
实施例3
1)将待检测肥料(标注含菌量为40亿/克)分散于芽孢保护剂(氯化钠浓度为8.5％的生理盐水和生理盐水4wt.％的聚天冬氨酸)中，配置成菌悬液；
2)用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后菌悬液在80℃下水浴15分钟，迅速冷却到35℃，上旋转式摇床上200r/分钟充分振荡50分钟，得到灭菌悬液；
3)对灭菌悬液稀释10-7倍接种至芽孢培养基中，培养后形成菌落，根据芽孢培养基上所形成菌落数量计数后，得出待检测肥料的含菌量；
其中芽孢培养基为由胰蛋白胨5.0g/L、酵母浸粉2.5g/L、葡萄糖1.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钠1.0g/L、碳酸钙1.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC0.01g/L和琼脂20g/L组成。
对比例1～3
与实施例3的区别在于：所用芽孢保护液中没有使用聚天冬氨酸和菌悬液中没有使用分散剂吐温或OP-10。
检测方法：
分别对实施例1～3和对比例1～3中所得菌悬液和灭菌液进行平板稀释培养。培养基为本发明提供的芽孢培养基。得到相应的菌数。
实施例1～3中结果列于表1中。
表1 实施例1～3中菌体存活率表
对比例1～3中所得灭菌液培养后，平板计数所得结果列于表2中。
表2 对比例1～3中菌数变化表
由表1数据可见。经过灭菌处理后，菌体中的芽孢在后续培养中得到萌发，同时在灭菌过程中已经萌发的芽孢体得到保护，因而菌的平均存活率为107.74％。由实施例1～3中所得结果可知，其中菌悬液菌体检测结果的为正偏差，平均值为7.32％，灭菌液菌体检测结果的为正偏差，平均值为14.99％，同时表明灭菌液检测结果比标注的菌数值高，有显著的分散和保护芽孢菌的作用。由表2可见，不采用聚天冬氨酸作为芽孢菌体保护剂。待检测肥料中，已经萌发的芽孢菌体死亡数量巨大，培养后活菌存活率仅为52.76％，菌数损失近一半。通过对比可见，通过加入保护剂，能有效保护芽孢中已经萌发的菌体，防止其在灭菌过程中被杀灭，从而保护其在后续检查过程中能存留下。对比例1～3中，菌悬液菌体检测结果的为负偏差，平均值为-1.06％，灭菌液菌体检测结果为负偏差，平均值为-45.69％，由于存活率较低，因而对生物有机肥等产品中所含菌体的检测结果与标注的菌数有较大偏差。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待检测肥料分散于芽孢保护剂中，配置成菌悬液；
2)对所述菌悬液在70～80℃下水浴15分钟进行灭菌处理，得到灭菌悬液；
3)将所述灭菌悬液接种至芽孢培养基中，培养后形成菌落，根据芽孢培养基上所形成菌落数量计数后，得出所述待检测肥料的含菌量；
所述芽孢保护剂包括氯化钠浓度为8～10％的生理盐水以及用量为所述生理盐水用量1～5wt.％的聚天冬氨酸；
所述芽孢培养基为由胰蛋白胨4.0～6.0g/L、酵母浸粉2.0～3.0g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、七水硫酸镁0.2～1g/L、氯化钠0.5～1.5g/L、碳酸钙0.5～1.5g/L、磷酸氢二钾2.0～3.0g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC 0.01g/L和琼脂16～20g/L组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢培养基为由胰蛋白胨5.0g/L、酵母浸粉2.5g/L、葡萄糖1.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钠1.0g/L、碳酸钙1.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硫酸锰0.01g/L、TTC 0.01g/L和琼脂16g/L组成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌悬液中还包括1～2滴/L分散剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分散剂为吐温或OP-10。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢保护剂由氯化钠浓度为8～10％的生理盐水以及用量为所述生理盐水用量1～5wt.％的聚天冬氨酸组成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述芽孢保护剂由氯化钠浓度为8.5％的生理盐水以及用量为所述生理盐水用量4wt.％的聚天冬氨酸组成。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分散步骤包括在200r/分钟的摇床上振荡60分钟。
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