CN104147590B - 一种脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用 - Google Patents
一种脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104147590B CN104147590B CN201410370095.6A CN201410370095A CN104147590B CN 104147590 B CN104147590 B CN 104147590B CN 201410370095 A CN201410370095 A CN 201410370095A CN 104147590 B CN104147590 B CN 104147590B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipopeptid
- cell
- melanoma
- formula
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了式(I)所示脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用，所述脂肽包括肽链和脂肪链，肽链和脂肪链通过肽键相连。本发明还公开了式(I)脂肽及其药物组合物在抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移、分化等各方面中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生命医学研究领域，具体涉及式(I)脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用。
背景技术
黑色素瘤起源于黑色素细胞，是发病率最低然而致死率却最高的皮肤癌。由于传统的治疗方法如手术、化疗和放射治疗等不能解决黑色素瘤转移和复发问题，因此靶向治疗和免疫治疗成为主要研究方向。目前，临床应用的治疗黑色素瘤药物多为针对原癌基因如BRAF、MEK的抑制剂。但是长期服用抑制剂导致肿瘤的耐药性和机体副作用使得黑色素瘤治疗仍然存在局限性。因此，人们越来越关注从自然界寻找一些天然化合物应用于肿瘤治疗中。
脂肽是微生物的次生代谢产物，由亲水性的肽链和亲脂性的脂肪酸链两部分组成，根据二者结合方式分为环形和线形脂肽。脂肽及其衍生物具有广泛的生物活性，如消炎、杀菌、杀虫等。此外还有报道一些环形脂肽具有抗肿瘤活性，如对人黑色素瘤细胞A375具有细胞毒性。
本发明人实验室已经报道了一类皮肤共生菌例如表皮葡萄球菌分泌的脂肽能够诱导角质形成细胞分泌抗菌肽，具有杀菌活性(申请号201210138021.0)；其衍生物具有抑制皮肤伤口过度炎症，调节皮肤先天免疫应答的活性(申请号201210254311.1)。
发明内容
本发明首次公开提出了一种脂肽衍生物，如式(I)所示，其能够抑制小鼠黑色素瘤细胞的增殖和迁移，促进其分化，抑制小鼠黑色素瘤的肺部转移，其对正常皮肤角质形成细胞无细胞毒性。
本发明首次公开提出了一种式(I)所示的脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用，所述脂肽包括肽链和脂肪链，肽链和脂肪链通过肽键相连成线状；所述脂肽结构如式(I)所示：
式(I)。
本发明中，所述黑色素瘤是小鼠黑色素瘤。
本发明中，所述脂肽作为药物的活性成分。
本发明中，所述式(I)脂肽的多肽链的合成是通过固相合成方法合成的，该脂肽衍生物的脂肪酸通过邻苯二甲酰丁辛酯(BCP)与N-甲基吗啉(NMM)接在所述多肽链上。
本发明还提出了一种抗黑色素瘤的药物组合物，其包括作为活性成分的式(I)脂肽。本发明药物组合物包括有效量的式(I)脂肽和药学上可接受载体和/或赋形剂。这类载体和/或赋形剂包括但不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、及其组合等。药物制剂可与给药方式相匹配，包括溶液、针剂、颗粒、固体或液体等，以常规方法制备。
本发明还提出了式(I)脂肽及含有式(I)脂肽的药物组合物在制备诱导黑色素瘤细胞停滞在细胞周期G1期从而抑制黑色素瘤细胞增殖的药物中的应用。
本发明还提出了式(I)脂肽及含有式(I)脂肽的药物组合物在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的药物中的应用。
本发明还提出了式(I)脂肽及含有式(I)脂肽的药物组合物在制备诱导黑色素瘤细胞分化的药物中的应用。
本发明还提出了式(I)脂肽及含有式(I)脂肽的药物组合物在制备抑制黑色素瘤肺转移的药物中的应用。
本发明应用中，所述式(I)脂肽及含有式(I)脂肽的药物组合物具有抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10增殖的作用。在具体实施方案中，通过克隆形成实验，体外证明了脂肽能够抑制B16F10细胞的增殖。通过流式分析细胞周期分析实验证明脂肽能够诱导G1期停滞，阻断其向S期过渡，从而抑制细胞增殖。
本发明应用中，所述式(I)脂肽及含有式(I)脂肽的药物组合物具有抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10迁移中的作用。在具体实施方案中，通过体外细胞刮痕实验证明式(I)脂肽能够抑制B16F10细胞横向迁移的能力，通过Transwell实验结果证明式(I)脂肽能抑制B16F10细胞纵向迁移的能力。
本发明应用中，所述式(I)脂肽及含有式(I)脂肽的药物组合物具有诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞的分化的作用。黑色素瘤细胞分化的主要标志是黑色素的合成。在具体实施方案中，所述脂肽能呈时间依赖性地促进黑色素瘤细胞形成黑色素。
本发明应用中，所述式(I)脂肽及含有式(I)脂肽的药物组合物具有抑制小鼠黑色素瘤的肺部迁移的作用。在具体实施方案中，通过构建小鼠肿瘤转移模型，证明了脂肽处理组的小鼠肺部迁移的黑色素瘤明显减少，表明脂肽对小鼠黑色素瘤的转移具有抑制作用。
本发明还公开了一种抑制黑色素瘤细胞增殖、抑制黑色素瘤细胞迁移、或诱导黑色素瘤细胞分化的方法，把所述式(I)脂肽或含有式(I)脂肽的药物组合物施加到黑色素瘤细胞上。所述黑色素瘤细胞是小鼠黑色素瘤细胞。
本发明还公开了一种抑制黑色素瘤肺转移的方法，把所述式(I)脂肽或含有式(I)脂肽的药物组合物施加到黑色素瘤细胞上。所述黑色素瘤细胞是小鼠黑色素瘤细胞。
附图说明
图1表示不同浓度的脂肽抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10的增殖，A表示克隆形成实验，B表示克隆形成的数目。
图2表示不同浓度的脂肽诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10的细胞周期G1期停滞。A细胞周期分析图，B细胞周期统计图。
图3表示不同浓度的脂肽抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10的横向迁移，A表示不同浓度的脂肽对B16F10细胞刮痕愈合的影响，B表示刮痕愈合的速度：刮痕愈合速度(百分比)＝1-刮痕愈合后面积与刮痕愈合前的面积百分比。
图4表示脂肽抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10的纵向迁移，A表示Transwell实验，B表示统计Transwell中细胞的数目。
图5表示脂肽抑制小鼠黑色素瘤的肺部迁移，A表示肺部肿瘤，B表示肺部肿瘤的数目。
图6表示脂肽诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10的黑色素合成，A表示黑色素，B表示黑色素合成的含量。
图7表示不同浓度的脂肽对正常皮肤角质形成细胞无毒性A(24h)B(48h)。
图8表示不同浓度的脂肽对正常皮肤角质形成细胞的活力无影响A(24h)B(48h)。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，本发明作进一步详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂和实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1，脂肽抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10的增殖。
接种细胞于6孔板中，每孔1000个细胞，培养过夜。第二天，每孔加入不同浓度(0，0.5，1，2，4，8μM)脂肽，继续培养。每隔2-3天更换新鲜培养基，并补足相应浓度的脂肽。培养12-14天以后，肉眼可见细胞克隆独立均匀分布于板上，此时取出细胞，弃去培养基，用DPBS轻轻清洗一遍，每孔加入1mL4％多聚甲醛，室温固定15min，弃去上清，用DPBS轻轻清洗两遍，每孔加入1mL结晶紫染液，室温放置10min，弃去染液，用DPBS轻轻清洗两遍，室温晾干。用酒精棉球擦去孔周围多余的染料，拍照并计数细胞克隆数。实验结果如图1所示，不同浓度的脂肽抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10的生长(图1A)。通过统计细胞的数量表明脂肽呈浓度梯度依赖性抑制黑色素瘤细胞B16F10的克隆数目(图1B)。
实施例2，脂肽诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10的细胞周期G1期停滞。
以6×105个/mL密度接种细胞于六孔板中，每孔2mL培养基，培养过夜。待细胞汇合率达到30％左右，用不同浓度(0，1，2，4μM)的脂肽刺激细胞36h。用TE消化收集细胞，DPBS漂洗两遍，弃掉上清，加入10mL70％无水乙醇(用去离子水配制，提前放于-20℃预冷)，吹打均匀，4℃固定过夜。1200rpm离心5min，弃掉酒精，用DPBS漂洗两遍，每次1200rpm离心5min。用DPBS稀释TritonX-100、PI染色液和RNaseA至终浓度分别为0.4％、50μg/mL和40μM。用0.5mL上述PI-RNaseA-TritonX-100混合液重悬细胞，于37℃避光反应20min。通过BD FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期。实验结果如图2所示，不同浓度的脂肽处理后，G1期细胞的百分比呈浓度梯度的增加，S期细胞的百分比呈浓度梯度的减少，表明脂肽诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10的细胞周期G1期停滞，从而抑制细胞增殖。
实施例3，脂肽抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞的横向迁移能力。
以16×104个/mL的密度接种细胞于12孔板中，每孔1mL培养基，于5％C02培养箱24小时以后，细胞密度达到90％-100％，加入7.5ug/mL丝裂酶素C抑制细胞增殖。用1mL枪头轻轻的在孔中间划痕，划痕后，用DPBS轻轻清洗两次，去除脱落细胞。每孔添加含有不同浓度脂肽(0.8，1，2μM)的新鲜培养基，在划痕中间做标记，在倒置显微镜的4倍镜下拍照，记为0点刮痕，之后每隔一定时间在同一位置拍照，记为不同时间点的刮痕。使用Image-Pro Plus6.0软件统计细胞刮痕，在Excel中计算愈合速率。实验结果如图3所示，脂肽能抑制B16F10细胞的刮痕愈合(图3A)，通过统计细胞刮痕愈合前后的面积，表明脂肽呈浓度梯度依赖性抑制B16F10细胞的刮痕愈合(图3B)，说明脂肽能够抑制黑色素瘤细胞横向迁移的能力(*，P＜0.05，**，P＜0.01)。
实施例4，脂肽抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10纵向迁移能力。
取对数生长期细胞，胰酶消化，用DPBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基重悬细胞，计数，调整浓度为4×105个/mL。用无血清培养基配制含有2倍于脂肽终浓度的母液，吹打混匀。取等量体积的母液和细胞悬浮液于EP管中，使脂肽的终浓度为(0，1，2，4μM)，吹打混匀。在24孔板底部(小室下层)加入800μL正常培养基(含有10％血清)，上室加入200μL上述步骤中的混合液。避免小室膜下面出现气泡。于5％CO2培养箱中继续培养12h之后，取出细胞，用镊子小心夹取小室，吸干小室液体，置于1mL DPBS中清洗一次，然后用4％多聚甲醛固定15min，DPBS清洗两次，浸入预先加入1mL结晶紫染液的孔中，室温染色15min。再用DPBS浸泡清洗数次，吸干上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。待小室膜晾干，显微镜下取6个随机视野拍照，计数，统计结果。结果如图4所示，小室中的细胞数量随着脂肽浓度的增加而减少(图4A)，通过统计细胞的数量表明脂肽呈浓度梯度依赖性地抑制B16F10细胞的迁移，并且具有显著差异(***，P＜0.001)。
实施例5，脂肽抑制小鼠黑色素瘤的肺部迁移。
将小鼠黑色素瘤细胞B16F10分成两组：对照组和脂肽处理组，分别用DPBS或者脂肽(2μM)预先刺激24h。待细胞生长到对数期，用TE消化细胞，培养基中和，离心收集细胞，并用DPBS洗涤两次，除去残留血清，用DPBS重悬细胞。细胞计数，调整细胞密度至2×106个/mL。尾静脉注射200μL上述细胞悬液至BALB/c体内。将小鼠根据所注射细胞的不同预处理分为对照组和脂肽组。每组3只小鼠。接种瘤细胞后14天，处死小鼠，剥离肺部组织，拍照观察并统计形成的转移肿瘤灶数目。结果如图5所示，细胞注射后，在小鼠肺部形成了转移的肿瘤灶，脂肽注射组明显减少了转移的肿瘤灶的数目，通过统计肿瘤灶的数目表明脂肽显著抑制小鼠黑色素瘤的肺部迁移，并且具有显著差异(**，P＜0.01)。
实施例6，脂肽诱导小鼠黑色素瘤细胞B16F10的黑色素合成。
接种B16F10细胞于6孔板中，在CO2培养箱中培养过夜，加入2μM的脂肽，继续培养。培养24h时，用光学显微镜拍照细胞形态。如图6A所示：脂肽处理之后，细胞的树突增多，细胞中有大量黑色颗粒沉淀，表明脂肽可以促进小鼠黑色素瘤细胞B16F10的黑色素合成。另一组实验，加入脂肽不同时间后，取出细胞，弃掉培养基，加入60μL RIPA裂解液，用细胞刮将细胞刮下，收集于1.5mL EP管中，超声10min，12000rpm离心15min，弃上清，用300μL含有10％DMSO的NaOH(1N)重悬沉淀，然后置于60℃水浴锅中放置1h，期间用手指轻弹几次。待黑色素完全溶解之后，混匀，分别取100μl于96孔板中，振荡20s，然后测量OD475nm处的吸光值。黑色素含量的相对值计算方法为：处理组OD值/对照组OD值×100％。结果如图6所示，脂肽呈时间依赖性地促进黑色素合成，并且具有显著性差异(*，P＜0.05，**，P＜0.01，***，P＜0.001)。
实施例7，脂肽对正常皮肤角质形成细胞无毒性。
以2.5×104个/mL的密度将原代角度形成细胞接种于96孔板中，每孔200μL培养基，培养过夜。第二天，弃去旧培养基，换成含有不同浓度(1，2，3，4，5，6μM)脂肽的新鲜培养基，设置最小值(空培养基)、最大值(只有细胞未加刺激)和不同浓度脂肽处理组，每组处理设置5个复孔。根据需要，继续培养24h或者48h，取出细胞前40min，在最大值组每孔加入TritonX-100(终浓度为1％)。按照试剂盒说明书配制反应液，现用现配。取出细胞，每孔吸取100μl上清至新96孔板中，加入反应液100μL/孔，轻轻混匀，室温静置30min。使用酶标仪测量OD490nm处吸光值。细胞毒性百分比的计算方式：细胞毒性(％)＝(检测样本-最小值)/(最大值-最小值)×100％。结果如图7所示，脂肽处理24h(图7A)和48h(图7B)之后，并未产生毒性作用(n.s.，无显著性差异)。
实施例8，脂肽对正常皮肤角质形成细胞的活力无影响。
以5×104个/mL的密度将原代角度形成细胞接种于96孔板中，每孔100μL培养基，为保证细胞密度均匀，每加三列细胞混匀一下细胞悬液，边缘孔用空培养基填充。培养过夜。第二天，弃去旧培养基，换成含有不同浓度脂肽(1，2，3，4，5，6μM)的新鲜培养基，设置调零孔(空培养基)、空白孔(细胞未加脂肽刺激)和药物组，每组处理设置5个复孔。继续培养24h或者48h之后，取出细胞，每孔加入25μL MTT溶液(5mg/mL)，于37℃恒温培养箱反应4h。移去反应液，每孔加入200μL DMSO，摇床低速振荡20min，用酶标仪检测各孔OD490nm处的吸光度(A)值。细胞活力(cell viability of control)＝(药物组A值-调零孔A值)/(对照孔A值-调零孔A值)×100％。结果如图8所示，脂肽处理24h(图7A)和48h(图7B)之后，并未对正常皮肤角质形成细胞的活力产生影响(n.s.，无显著性差异)。
Claims (6)
1.式(I)所示脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用，其特征在于，所述脂肽包括肽链和脂肪链，肽链和脂肪链通过肽键相连成线状；所述脂肽的结构如式(I)所示：
2.一种抗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于，其包括作为活性成分的如权利要求1中式(I)脂肽以及药学上可接受载体。
3.如权利要求1中式(I)脂肽或权利要求2所述的药物组合物在制备诱导黑色素瘤细胞停滞在细胞周期G1期从而抑制黑色素瘤细胞增殖的药物中的应用。
4.如权利要求1中式(I)脂肽或权利要求2所述的药物组合物在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的药物中的应用。
5.如权利要求1中式(I)脂肽或权利要求2所述的药物组合物在制备诱导黑色素瘤细胞分化的药物中的应用。
6.如权利要求1中式(I)脂肽或权利要求2所述的药物组合物在制备抑制黑色素瘤肺转移的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410370095.6A CN104147590B (zh) | 2014-07-30 | 2014-07-30 | 一种脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410370095.6A CN104147590B (zh) | 2014-07-30 | 2014-07-30 | 一种脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104147590A CN104147590A (zh) | 2014-11-19 |
| CN104147590B true CN104147590B (zh) | 2016-11-16 |
Family
ID=51873353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410370095.6A Active CN104147590B (zh) | 2014-07-30 | 2014-07-30 | 一种脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104147590B (zh) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102659932B (zh) * | 2012-05-04 | 2016-01-13 | 华东师范大学 | 一种脂肽及其衍生物、及其制备方法和应用 |
-
2014
- 2014-07-30 CN CN201410370095.6A patent/CN104147590B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104147590A (zh) | 2014-11-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104324053A (zh) | 一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液 | |
| Park et al. | Wound healing effects of deoxyshikonin isolated from Jawoongo: In vitro and in vivo studies | |
| CN105833277A (zh) | 治疗类风湿性关节炎的干细胞制剂及其制备方法和应用 | |
| CN108753682A (zh) | 促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂及其制备方法和应用 | |
| CN106167789A (zh) | 低氧处理的间充质干细胞及其应用 | |
| CN109517872A (zh) | 红景天苷在保护干细胞活性中的应用 | |
| CN103977029A (zh) | 经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用 | |
| CN104644522A (zh) | 透皮美容的组合制剂和试剂盒及其制备方法 | |
| CN107488627A (zh) | 一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂及其应用 | |
| CN101856496A (zh) | 胎盘干细胞抗肿瘤疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN102228455B (zh) | 双联苄类化合物在制备抗炎药物中的应用 | |
| JP2024510298A (ja) | 放射線療法と連携して抗腫瘍に使用される製剤の調製におけるマラリア原虫の使用 | |
| CN104147590B (zh) | 一种脂肽在制备抗黑色素瘤的药物中的应用 | |
| CN111759896A (zh) | 一种木瓜总三萜的制药用途 | |
| CN110075269A (zh) | Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用 | |
| CN102068448A (zh) | 淫羊藿次苷ⅱ在制备抗黑色素瘤药物中的用途 | |
| CN106075454A (zh) | 一种抗肿瘤药物制剂组合 | |
| CN101283994A (zh) | 白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用 | |
| CN109602859A (zh) | 苗药廖氏化风丹在制备防治黑色素瘤药物中的应用 | |
| CN104043112B (zh) | 一种含有重组人干扰素α-2b(假单胞菌)的软膏药物组合物 | |
| CN110496225A (zh) | 千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用 | |
| CN106074564B (zh) | 熊果酸在制备抗包虫药物中的应用 | |
| CN101278925A (zh) | 信筒子醌在制备抑制血管新生药物中的应用 | |
| CN107693509A (zh) | Sb‑fi‑26在制备治疗乳腺癌药物中的应用 | |
| CN109223801A (zh) | 一种新的胃癌肿瘤干细胞杀伤剂及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |