CN104130955B - 产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株cd82 - Google Patents

产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株cd82 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种黄海海水分离筛选得到的高产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株cd82，是芽孢杆菌属的Bacillus的新菌种，该菌株保藏于CCTCC，保藏号为CCTCCNo：M2013155，环状糊精葡萄糖基转移酶活性达1600U/ml，将在食品、医药、农药和环保等领域有着广泛应用。

Description

产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株cd82
技术领域
本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及从黄海海水中分离筛选出高产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株cd82及其产生的环状糊精葡萄糖基转移酶。
背景技术
环糊精(Cyclodextrin，CD)是由6个或更多的D-吡喃型葡萄糖单元通过α-(1-4)-糖苷键连接而成的环状低聚糖。根据环中D-吡喃型葡萄糖单元数目的不同，环糊精可分为许多种，其中分别由6、7和8个葡萄糖单元组成的α-、β-和γ-环糊精最为常见，也称之为基础环糊精。除了基础环糊精外，还有比较少见的分别由9、10、11和12个葡萄糖单元组成的δ-、ξ-、ζ-和η-环糊精。环糊精具有圆筒形空心结构，可容纳化合物分子。其空腔外表面具有亲水性，内表面却具有疏水性，这一特性使得环糊精及其衍生物在食品、医药、农药和环保等领域广泛用作添加剂或包埋材料，其中尤以β-环糊精的应用最为广泛。目前我国环糊精的实际产量约有4万吨左右，其中90％的产量被用于其他工业用途，如食品行业中作为稠化剂、纺织工业用辅料和香妆品工业等等。而环糊精更具有开发前景的用途是作为药物分子的包埋剂，可将一些难溶药物加工成可溶性药物制剂。
环状糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)可作用于淀粉类物质产生CD，目前主要应用软化芽孢杆菌、嗜热脂肪杆菌、巨大芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌等微生物在严格控制的条件下进行液体深层发酵来制备。我国CD的生产和应用史已有30多年，但CGTase生产菌种的酶产量不理想，导致了CD的生产成本过高而应用受到限制。因此，选育CGTase高产菌是我国酶制剂研究的一项重要任务。
随着海洋生物技术的发展，人们意识到开发海洋资源的重要性。海洋微生物为适应海洋各种极端环境，其产生的酶表现出独特的生理功能与酶学特性，比来自陆源微生物的酶更具开发应用潜力，越来越引起世界各国的重视，争相开发、寻找具有全新性质的酶已成为国际酶制剂研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于寻找生存在自然环境中特别是在极端环境条件下高产高活性环状糊精葡萄糖基转移酶的微生物，经发明人广泛深入开发研究，在对黄海海水中微生物进行分离筛选基础上，获得一株具有高效催化能力的高产高活性环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Bacillussp.cd82（简称菌株cd82）。
本发明提供的高产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株cd82是从黄海海水中分离筛选获得的高产高活性环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株，根据海洋微生物菌株cd82的16SrDNA序列相似性比对，cd82的16SrDNA与Bacillusalkalitolerans有99%的同源性。菌株cd82的GenBanK登录号为KC928273，鉴定确定为芽孢杆菌属的细菌，是Bacillus的新菌株。该高产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Bacillus sp.cd82于2013年4月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCNo：M2013155。
菌株cd82的筛选
初筛：取10ml水样，加入到90ml无菌水中进行梯度稀释，取30μl10-2、10-3、10-4、10-5的悬液涂布基础培养基(所述基础培养基（wt）：蛋白胨1%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，NaCl0.5%，固体另加2%琼脂，调至pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min)平板中，35℃培养箱中静止培养24h；固体筛选平板分为8个小格，把基础培养基平板上形态大小不同的单菌落依次挑取点接入小格中，30℃培养箱筛选用培养基中培养24h后观察透明圈的大小(所述筛选用培养基(g/L)：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，K2HP041g，MgSO4·7H2O0.2g，Na2CO35g，酚酞O.3g，甲基橙0.1g，琼脂15g，121℃灭菌15min，自然pH值。环状糊精与甲基橙和酚酞染料反应形成复合物，可在培养基平板上出现黄色透明圈,将黄色透明圈较大的菌落反复传代培养，直至获得纯培养菌株，接种于基础培养基斜面内，4℃冰箱保存。
复筛：分别取一环初筛保存的菌接入含有3ml基础培养液的试管中进行活化，35℃、200r/min振荡培养18h，取此培养液1ml转接入装有25ml发酵培养基(所述发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉4.5g，蛋白胨3.9g，酵母膏4.2g，K2HP040.8g，MgSO4·7H2O0.3g，Na2CO30.3g，pH7.0，121℃灭菌15min)的250ml三角烧瓶中，同样条件下培养
72h。发酵液10000rpm离心3min，取上清测定酶活大小，通过酶活测定最终分离到产环状糊精葡萄糖基转移酶,酶活高且稳定性好的菌株cd82。
本发明提供的高产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株cd82的形态与生理生化特征为：
形态特征：柱状芽孢杆菌，长2.5-5μm，宽0.7-1μm，椭圆芽孢次端生。
培养特征：在基础培养基(wt)蛋白胨1%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，NaCl0.5%，固体另加2%琼脂，调至pH7.0）中，4℃～50℃的温度下生长，其最适生长温度范围为30℃～40℃，生长pH范围为pH6～11，培养24h的菌落圆形、全缘、扁平，直径1.9-3.2mm，白色半透明。
生理生化特征：卵磷脂酶阳性、纤维素酶阳性、V-P阴性；可利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇，产酸为发酵型糖代谢；可以水解淀粉；能够利用柠檬酸盐，好氧，无尿酶活性。
本发明提供的高产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株cd82的16srDNA全序列（GenBanK登录号为KC928273）如图1，全长为1551bp。,
附图说明
图1海洋微生物菌株cd82的16s rDNA全序列
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例
1）、菌株cd82的筛选
取10ml水样，加入到90ml无菌水中进行梯度稀释，取30μl10-2、10-3、10-4、10-5的悬液涂布基础培养基（所述基础培养基（wt）：蛋白胨1%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，NaCl0.5%，固体另加2%琼脂，调至pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。）平板中，30℃培养箱筛选用培养基中（所述筛选用培养基(g/L)：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，K2HP041g，MgSO4·7H2O0.2g，Na2CO35g，酚酞O.3g，甲基橙0.1g，琼脂15g，121℃灭菌15min，自然pH值。环状糊精与甲基橙和酚酞染料反应形成复合物，可在培养基平板上出现黄色透明圈）静止培养24h；固体筛选平板分为8个小格，把基础培养
基平板上形态大小不同的单菌落依次挑取点接入小格中，30℃培养箱中培养24h后观察
透明圈的大小；将透明圈较大的菌落反复传代培养，直至获得纯培养菌株，接种于基础培养基斜面内，4℃冰箱保存。分别取一环初筛保存的菌接入含有3ml基础培养液的试管中进行活化，30℃、200r/min振荡培养18h，取此培养液1ml转接入装有25ml发酵培养基（所述产酶（发酵）培养基(g/L)：可溶性淀粉4.5g，蛋白胨3.9g，酵母膏4.2g，K2HP040.8g，MgSO4·7H2O0.3g，Na2CO30.3g，pH7.0，121℃灭菌15min）的250ml三角烧瓶中，同样条件下培养48h。发酵液10000rpm离心3min，取上清测定酶活大小，通过酶活测定最终分离到产环状糊精葡萄糖基转移酶酶活高且稳定性好的菌株cd82。
2）、海洋微生物菌株cd82的形态与生理生化特征为：
形态特征：柱状芽孢杆菌，长2.5-5μm，宽0.7-1μm，椭圆芽孢次端生。
培养特征：在基础培养基（wt）（蛋白胨1%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，NaCl0.5%，固体另加2%琼脂，调至pH7.0）中，4℃～50℃的温度下生长，其最适生长温度范围为30℃～40℃，生长pH范围为pH6～11，培养24h的菌落圆形、全缘、扁平，直径1.9-3.2mm，白色半透明。
生理生化特征：卵磷脂酶阳性、纤维素酶阳性、V-P阴性；可利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇，产酸为发酵型糖代谢；可以水解淀粉；能够利用柠檬酸盐，好氧，无尿酶活性。
3）、海洋微生物菌株cd82的16srDNA全序列（GenBanK登录号为KC928273）如图1。

Claims (2)

1.一种产环状糊精葡萄糖基转移酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)cd82，其特征在于是从黄海海水中分离获得的产环状糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株，是芽孢杆菌属的菌株，该菌株菌落圆形、全缘、扁平，直径1.9-3.2mm，白色半透明，为柱状芽孢杆菌，长2.5-5μm，宽0.7-1μm，椭圆芽孢次端生，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M2013155；该菌株16s rDNA全序列所示全长为1551bp。
2.根据权利要求1的产环状糊精葡萄糖基转移酶的芽孢杆菌产生的环状糊精葡萄糖基转移酶。
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