JP2008161133A - ポリフェノール配糖体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】グルコースが複数結合したポリフェノール配糖体を効率よく得ることができるポリフェノール配糖体の製造方法を提供する。
【解決手段】ポリフェノール化合物（Ａ）のフェノール性水酸基にグルコースが１分子結合した化合物（Ｂ）及びα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも１種である糖供与体（Ｃ）にγ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とするポリフェノール配糖体（Ｄ）の製造方法である。

［式中、ｎは１以上の正の整数である。］
【選択図】なし

Description

本発明は、ポリフェノール配糖体の製造方法に関する。特に、ポリフェノール化合物のフェノール性水酸基にグルコースが複数結合したポリフェノール配糖体の製造方法に関する。

ポリフェノールとは、同一分子内に複数のフェノール性水酸基を有する化合物の総称であり、植物等に含まれていることが知られている。ポリフェノールの多くが生理活性機能を有するが、水に対する溶解性が良好ではないことが多く、シクロデキストリン等を用いてポリフェノールを包接化したり、配糖化したりして種々の用途に利用されている。

例えば、特開平９−３０８９号公報（特許文献１）には、茶ポリフェノール類の配糖体及びその製造方法について記載されている。具体的には、茶ポリフェノール類とデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物に、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることによって、ポリフェノール類を配糖化できることが記載されている。これによれば、従来のポリフェノール類とは異なり、苦味、渋味、えぐみや収斂性などの嫌味がほとんどなく、その精製の程度や純度を問わず、そのままで、あるいは他の素材と共に含有させて食品、医薬部外品、化粧品、医薬品などの広い分野に用いることができるとされている。しかしながら、必ずしも効率良く配糖体を得ることができない場合も多く、改善が望まれていた。

また、特開２００５−４１８１７号公報（特許文献２）には、クルクミノイド配糖体及びその製造方法について記載されている。具体的には、配糖化した芳香族アルデヒド化合物を出発原料としてアセチルアセトン−酸化ホウ素錯体と縮合してクルクミノイド配糖体とし、かつ反応生成物を低級アルコールと加熱することでホウ素を除去することにより、広範囲のクルクミノイド配糖体を効率的に製造することができるとされている。しかしながら、このような化学合成による方法では必ずしも効率良く配糖体を得ることができない場合も多く、改善が望まれていた。

特開平９−３０８９号公報 特開２００５−４１８１７号公報

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、グルコースが複数結合したポリフェノール配糖体を効率よく得ることができるポリフェノール配糖体の製造方法を提供することを目的とするものである。

上記課題は、ポリフェノール化合物（Ａ）のフェノール性水酸基にグルコースが１分子結合した化合物（Ｂ）及び糖供与体（Ｃ）にγ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とするポリフェノール配糖体（Ｄ）の製造方法を提供することによって解決される。

このとき、ポリフェノール化合物（Ａ）がクルクミンであることが好適であり、糖供与体（Ｃ）が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも１種であることが好適である。また、γ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼが、バチルス・マセランス由来の酵素であることも好適である。

本発明のポリフェノール配糖体の製造方法によれば、グルコースが複数結合したポリフェノール配糖体を効率よく得ることができる。こうして得られたポリフェノール配糖体は、分子内にグルコースが複数結合したユニットを有するため、溶解性が良好であるとともに、光、熱、ｐＨなどに対する安定性が良好である。また、生体内に投与した場合には、ポリフェノール化合物とグルコースとの結合が容易に切断されるため、ポリフェノール化合物が有する生理活性機能を低減させることがない。したがって、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等として好適に用いることができる。

本発明のポリフェノール配糖体の製造方法は、ポリフェノール化合物（Ａ）のフェノール性水酸基にグルコースが１分子結合した化合物（Ｂ）及び糖供与体（Ｃ）にγ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下「γ−ＣＧＴａｓｅ」と略記することがある）を作用させることを特徴とするものである。

本発明で用いられるポリフェノール化合物（Ａ）としては、同一分子内にフェノール性水酸基を２つ以上有する天然化合物又はその誘導体であれば特に限定されない。ポリフェノール化合物（Ａ）としては、例えば、フラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノノール、イソフラボン、フラバン、フラバノール（カテキン）、フラバン−３，４−ジオール、カルコン、オーロン、アントシアニジン、リグナン、クマリン、クルクミン、エラグ酸、クロロゲン酸等が挙げられ、中でもクルクミンが好適に用いられる。

ポリフェノール化合物は、抗酸化作用、抗変異原性、抗ガン作用、血圧上昇抑制作用、血糖上昇抑制作用、抗アレルギー作用、抗菌作用、抗ウイルス作用等を有することが知られている。特に、ポリフェノール化合物は、水酸基を複数有するので他の共存化合物よりも酸化されやすく、抗酸化作用が優れているとされている。

本発明で用いられるポリフェノール化合物（Ａ）を得る方法は特に限定されず、植物などから有機溶媒等や超臨界二酸化炭素を用いて抽出したり、化学合成などにより得ることができる。例えば、クルクミンを得る方法としては、ウコンなどのクルクミンを多く含有する植物等から抽出する方法が挙げられる。

本発明のポリフェノール配糖体（Ｄ）の製造方法は、上記ポリフェノール化合物（Ａ）の１つのフェノール性水酸基に対してグルコースが１分子のみ結合することにより得られる化合物（Ｂ）を用いるものである。このような化合物（Ｂ）としては特に限定されず、化合物（Ｂ）が有するフェノール性水酸基の複数箇所にグルコースが１分子ずつ結合したものであってもよいし、前記フェノール性水酸基の１箇所のみにグルコースが１分子結合したものであってもよい。その際、フェノール性水酸基とグルコースとの結合は、α結合であってもβ結合であってもよい。フェノール性水酸基をできるだけ複数有する方が抗酸化作用等の活性が良好である観点からは、化合物（Ｂ）としては、フェノール性水酸基の１箇所のみにグルコースが１分子結合したものであることが好ましい。

このような化合物（Ｂ）を得る方法は特に限定されないが、好適には化学合成により得ることができる。例えば、ポリフェノール化合物（Ａ）がクルクミンである場合には、クルクミンとテトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコシルブロマイド（以下「ＴＡＧＢ」と略記することがある）とをＡｇ_２ＣＯ_３存在下で反応させ、次いで脱アセチル化することでグルコースが１分子結合した化合物（Ｂ）であるクルクミン誘導体を得ることができる。

本発明は、上記化合物（Ｂ）及び糖供与体（Ｃ）にγ−ＣＧＴａｓｅを作用させることを特徴とするものである。このような方法により、化合物（Ｂ）にグルコースが複数結合したポリフェノール配糖体（Ｄ）を得ることができる。本発明者らは、化合物（Ｂ）の代わりにクルクミンを用いてγ−ＣＧＴａｓｅを作用させた場合には、グルコースが複数結合したポリフェノール配糖体を得ることが困難となることを確認している。したがって、本発明ではフェノール性水酸基にグルコースが１分子結合した化合物（Ｂ）を用いることが重要である。本発明により得られるポリフェノール配糖体（Ｄ）は、分子内にグルコースが複数結合したユニットを有するため、溶解性が良好であるとともに、光、熱、ｐＨなどに対する安定性が良好である等の利点を有する。

本発明で用いられる糖供与体（Ｃ）としては特に限定されないが、α−シクロデキストリン（以下「α−ＣＤ」と略記することがある）、β−シクロデキストリン以下「β−ＣＤ」と略記することがある）及びγ−シクロデキストリン（以下「γ−ＣＤ」と略記することがある）からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。上記α−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤは、それぞれ単独で用いてもよいし、混合物として用いてもよい。

本発明では、糖供与体（Ｃ）の使用態様により、得られるポリフェノール配糖体（Ｄ）におけるグルコースの結合数が異なる。実際に、後述するα−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤをそれぞれ用いた実施例における実施例１、２及び３から明らかなように、反応時間によりグルコースの結合数が各々異なったポリフェノール配糖体（Ｄ）が得られた。用いられるポリフェノール化合物（Ａ）の種類により異なる場合があるが、グルコースの結合数ができるだけ多いポリフェノール配糖体（Ｄ）を短い反応時間で得る観点からは、α−ＣＤを用いることが好ましく、コスト面での利点を有する観点からはβ−ＣＤを用いることが好ましい。

本発明ではポリフェノール化合物（Ａ）のフェノール性水酸基にグルコースが１分子結合した化合物（Ｂ）に対してγ−ＣＧＴａｓｅを作用させるため、ポリフェノール配糖体（Ｄ）におけるグルコースの結合数は２以上である。糖鎖が長くなることによって溶解性が良好となる観点からは、グルコースの結合数が７以上のものが５モル％以上であることが好ましく、７以上のものが１０モル％以上であることがより好ましく、７以上のものが２０モル％以上であることが更に好ましい。ここで、上記モル％は、吸光度４３０ｎｍでＬＣ−ＭＳ測定を行った際のピーク面積から求めた。上記吸光度４３０ｎｍは、主としてクルクミン骨格由来の吸収波長である。また、通常、グルコースの結合数は３０以下である。

本発明により得られるポリフェノール配糖体（Ｄ）は、例えば、用いられるポリフェノール化合物（Ａ）がクルクミンである場合、下記化学式（１）又は（２）で示される。

［式中、ｎは１以上の正の整数である。］

［式中、ｎは１以上の正の整数である。］

上記化学式（１）及び（２）において、クルクミン由来のフェノール性水酸基と直接結合しているグルコースとの結合はβ結合であるが、前記結合はα結合であっても何ら差し支えない。フェノール性水酸基をできるだけ複数有する方が抗酸化作用等の活性が良好である観点からは、ポリフェノール配糖体（Ｄ）は、上記化学式（１）のように、クルクミン由来のフェノール性水酸基の１箇所のみにグルコースが多数結合したものであることが好ましい。

本発明で用いられるγ−ＣＧＴａｓｅとは、デンプンに作用させた場合にα−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤの各シクロデキストリンのうち、主にγ−ＣＤを産生する酵素をいう。本発明で用いられるγ−ＣＧＴａｓｅとしては、特に限定されないが、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、クレブシーラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、等の微生物によって産生されるものが挙げられる。中でも食品の利用の観点からはバチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来であることが好ましい。

本発明において、化合物（Ｂ）に対するグルコース換算での糖供与体（Ｃ）のモル比（糖供与体（Ｃ）／化合物（Ｂ））は、１０〜１００００であることが好ましい。モル比が１０未満の場合、シクロデキストリンの分解が抑えられて反応が進行しないおそれがあり、より好適には１００以上である。一方、モル比が１００００を超える場合、シクロデキストリンの分解が早く起きて、糖同士で結合（重合）をして高分子のデキストラン（デンプン）が生じるおそれがあり、より好適には２０００以下である。

本発明で用いられるγ−ＣＧＴａｓｅの添加量は特に限定されず、化合物（Ｂ）１μｍｏｌ当たり３００〜１０００単位であることが好ましく、４００〜８００単位であることがより好ましい。

また、γ−ＣＧＴａｓｅを添加して反応する際の反応温度は特に限定されず、グルコースの結合数が所望のポリフェノール配糖体（Ｄ）を得ることを考慮すると、反応温度は２０〜７０℃であることが好ましい。反応温度が２０℃未満の場合、反応の進行が困難となるおそれがあり、より好適には３５℃以上であり、更に好適には４５℃以上である。一方、反応温度が７０℃を超える場合、γ−ＣＧＴａｓｅが失活するおそれがあり、より好適には６０℃以下である。

また、γ−ＣＧＴａｓｅを添加して反応する際のｐＨも特に限定されず、酵素の最適ｐＨを考慮することにより定めることができる。ｐＨは３〜１１であることが好ましく、４〜８であることがより好ましい。

γ−ＣＧＴａｓｅを添加してからの反応時間は特に限定されず、用いられる糖供与体（Ｃ）によりグルコースの結合数が異なったポリフェノール配糖体（Ｄ）が得られることとなる。本発明では、反応時間が長くなるほどグルコースの結合数が減少する傾向が見られる。反応時間は、通常、１分〜１００時間であるが、反応時間を適宜調整することでグルコースの結合数が所望のポリフェノール配糖体（Ｄ）を得ることができる。本発明において、α−ＣＤを用いた際の好適な反応時間は１分〜６時間であり、β−ＣＤを用いた際の好適な反応時間は１時間〜１２時間であり、γ−ＣＤを用いた際の好適な反応時間は３時間〜２４時間である。

本発明により得られるポリフェノール配糖体（Ｄ）を生体内に投与した場合には、生体内に存在するα−アミラーゼやα−グルコシターゼ等の作用により、ポリフェノール化合物（Ａ）とグルコースとの結合が容易に切断されるため、ポリフェノール化合物（Ａ）が有する抗酸化作用等を示すこととなる。したがって、本発明により得られるポリフェノール配糖体（Ｄ）は、ポリフェノール化合物（Ａ）が有する生理活性機能を低減させることがなく、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等として好適に用いることができる。

以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。

実施例１
ペンタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコース２０ｇを２５％臭化水素−酢酸溶液１００ｇを用いて２５℃で８時間反応させることにより、テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコシルブロマイド（ＴＡＧＢ）を得た。得られたＴＡＧＢをＡｇ_２ＣＯ_３０．４ｇを用い、モレキュラーシーブス４Ａ（ＭＳ−４Ａ）の存在下、アセトン中で反応させることにより、クルクミン−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを３．２ｇ得た。次いで、得られたクルクミン−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドに対して、Ｋ_２ＣＯ_３１ｇを用いてメタノール中で加水分解し、オープンカラムクロマトグラフィーを用いて単離精製してクルクミン−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを１００ｍｇ得た。化学反応式を以下に示す。

上記で得られたクルクミン−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド３ｍｍｏｌ、α−ＣＤ（和光純薬工業株式会社製）０．５ｍｍｏｌ及び塩化カルシウム１ｍｇを量り取り、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を３ｍｌ加え、更にバチルス・マセランス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のγ−ＣＧＴａｓｅ（天野株式会社製）を６００単位加え、攪拌しながら５５℃で、５分、１時間、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間反応をそれぞれ行った。反応後、８０℃で１時間熱処理を行って酵素を失活させ、メンブランフィルター（孔径０．４５μｍ）を通すことによりクルクミン配糖体をそれぞれ得た。得られたクルクミン配糖体に対して、吸光度４３０ｎｍでＬＣ−ＭＳ測定を行ったところ、１５配糖体までのピークが確認された。得られたチャートを図１に示す。

実施例２
実施例１において、α−ＣＤを用いる代わりにβ−ＣＤ（和光純薬工業株式会社製）を０．５ｍｍｏｌ用いて５分、１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間反応をそれぞれ行った以外は実施例１と同様にして反応を行った。

実施例３
実施例１において、α−ＣＤを用いる代わりにγ−ＣＤ（和光純薬工業株式会社製）を０．５ｍｍｏｌ用いて５分、１時間、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間反応をそれぞれ行った以外は実施例１と同様にして反応を行った。

実施例４
実施例１において、α−ＣＤを用いる代わりに可溶性デンプンを６００ｍｇ用いて２４時間反応を行った以外は実施例１と同様にして反応を行った。

α−ＣＤを用いた実施例１、β−ＣＤを用いた実施例２、及びγ−ＣＤを用いた実施例３では、グルコースの結合数が少ない配糖体よりも、比較的グルコースの結合数が多い配糖体が主として得られた。これに対し、可溶性デンプンを用いた実施例４では、グルコースの結合数が少ない配糖体が主として多く見られた。

α−ＣＤを用いた実施例１の場合は、反応時間が５分の時に７糖以上の配糖体が多く確認され、反応時間が進むにつれて加水分解されてグルコースの結合数が減少する傾向が見られた。また、β−ＣＤを用いた実施例２の場合は、反応時間が３時間の時に、γ−ＣＤを用いた実施例３の場合は、反応時間が６時間の時に７糖以上の配糖体がそれぞれ多く確認された。β−ＣＤ及びγ−ＣＤを用いた場合も、α−ＣＤを用いた場合と同様に反応時間が長くなり過ぎるとグルコースの結合数が減少する傾向が見られた。

α−ＣＤを用い、５分、１時間、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間反応させて得られたポリフェノール配糖体（Ｄ）のＬＣ−ＭＳ分析チャートである。 β−ＣＤを用い、５分、１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間反応させて得られたポリフェノール配糖体（Ｄ）のＬＣ−ＭＳ分析チャートである。 γ−ＣＤを用い、５分、１時間、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間反応させて得られたポリフェノール配糖体（Ｄ）のＬＣ−ＭＳ分析チャートである。 可溶性デンプンを用い、２４時間反応させて得られたポリフェノール配糖体のＬＣ−ＭＳ測定チャートである。

Claims (4)

1. ポリフェノール化合物（Ａ）のフェノール性水酸基にグルコースが１分子結合した化合物（Ｂ）及び糖供与体（Ｃ）にγ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とするポリフェノール配糖体（Ｄ）の製造方法。
2. ポリフェノール化合物（Ａ）がクルクミンである請求項１記載のポリフェノール配糖体（Ｄ）の製造方法。
3. 糖供与体（Ｃ）が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２記載のポリフェノール配糖体（Ｄ）の製造方法。
4. γ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼが、バチルス・マセランス由来の酵素である請求項１〜３のいずれか記載のポリフェノール配糖体（Ｄ）の製造方法。

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