CN104130113A - 一种从樟芝菌固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法 - Google Patents

一种从樟芝菌固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法 Download PDF

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许赣荣
路瑞秋
张薄博
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
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Abstract

本发明公开了一种从樟芝菌固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法,属于生物制药领域。所述分离制备方法是以樟芝固态发酵粉末物为原料,通过有机溶剂萃取、浓缩、初步除杂、粗提液的一次柱层析、半制备色谱、二次柱层析及浓缩去溶剂的步骤,得到高纯度的安卓奎诺尔产品,所述方法操作简单,能有效从粗提物中得到安卓奎诺尔,其纯度为90%以上,并且可实现大规模制备。

Description

一种从樟芝菌固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法
技术领域
本发明涉及一种从樟芝菌固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法,属于生物制药领域。
背景技术
安卓奎诺尔,英文名称为(Antroquinonol),是一种潜在的抗癌药物。安卓奎诺尔是发现于牛樟芝子实体中的化合物,分子式C24H38O4,分子量为390g/mol。纯化的安卓奎诺尔为淡黄色油状,具有低水溶性之特性(<0.1mg/ml),具有高度稳定性,可于室温(25℃)或低温环境(4℃)维持稳定性至少长达24个月。
生理活性物质安卓奎诺尔是2007年Lee等人利用正己烷从樟芝子实体中萃取并鉴定一种新化合物,属于泛醌类的衍生物。2010年Chiang等人研究表明安卓奎诺尔可以通过活化AMPK来抑制胞内蛋白质的合成途径,进而抑制细胞周期,从而产生抗癌效果。2012年Tsai等研究发现安卓奎诺尔具有抗氧化应激和抗炎等活性。由于安卓奎诺尔具有显著的抗癌活性,并且,它对于癌细胞与正常细胞具有选择性,目前已进入FDA二期临床实验,是具有优良前景的抗癌化合物。
高纯度的安卓奎诺尔不仅在保健品、医药领域有着广阔的应用潜力,而且对于其生理功能方面的深入研究具有很重要的价值。目前,安卓奎诺尔的提纯仅以牛樟芝的菌丝体为原料,采用柱层析结合半制备色谱的方法进行提纯,但安卓奎诺尔的纯度仍不高,不能达到做参照标准品的要求。本发明以樟芝固态发酵粉为原料,制备获得了高纯度的安卓奎诺尔。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从樟芝固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法,以樟芝菌固态发酵粉末为原料,通过萃取、浓缩除杂、一次柱层析、半制备色谱、二次柱层析、浓缩等步骤,得到高纯度的含安卓奎诺尔的产品。
所述方法主要包括以下步骤:
(1)萃取:将樟芝固态发酵粉末,以无水乙醇反复浸提多次,然后合并滤液得到安卓奎诺尔粗提浓缩液;
(2)浓缩除杂:除去步骤(1)粗提浓缩液中的乙醇,以体积分数50%-90%的乙酸乙酯水溶液反复萃取3次;收集合并乙酸乙酯相,除去乙酸乙酯,得到浓缩液1;
(3)一次柱层析:柱层析填料为60-80目或100-200目的硅胶,或非极性或中极性的大孔树脂,采用梯度洗脱,以乙醇水溶液或选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群中的两种物质混合作为洗脱剂进行梯度洗脱,洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发得到浓缩液2;
(4)半制备色谱:将浓缩液2以半制备色谱分离纯化,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速:2mL/min,采用普通C18的制备色谱柱,柱温20-40℃;UV检测器,检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质,收集液浓缩后得到浓缩液3;
(5)二次柱层析:柱层析填料为200-300目的硅胶,以选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群的两种物质混合作为洗脱剂进行梯度洗脱,洗脱后的流分分段收集;
(6)浓缩:对收集的含安卓奎诺尔的样品进行常压浓缩或真空浓缩。
所述方法优选以下步骤:
(1)萃取:将安卓奎诺尔含量范围在300mg/kg~1000mg/kg的樟芝固态发酵粉末,按照料液比1g:5mL-1g:15mL的比例加入无水乙醇,20-40℃下,浸提、过滤,反复3次,然后合并滤液得到安卓奎诺尔粗提浓缩液。
(2)浓缩除杂:在40-50℃下真空旋转蒸发除去乙醇得到安卓奎诺尔粗提浸膏,粗提浸膏按1g:5mL-1g:20mL的比例加入50%-90%(v/v)乙酸乙酯水溶液进行萃取,静置分层,萃取3次。收集合并乙酸乙酯相,在40-50℃下真空旋转蒸发除去乙酸乙酯,得到浓缩液1。
(3)一次柱层析:柱层析填料为60-80目或100-200目的硅胶,或非极性或中极性的大孔树脂,采用梯度洗脱,以乙醇水溶液或选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群中的两种物质以体积比0-100%混合作为洗脱剂进行梯度洗脱,洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发得到浓缩液2。
(4)半制备色谱:将浓缩液2以半制备色谱分离纯化,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速:2mL/min,采用普通C18的制备色谱柱,柱温20-40℃;UV检测器:检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质,收集液浓缩后得到浓缩液3。
(5)二次柱层析:以选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群的两种物质混合作为洗脱剂,进行梯度洗脱,洗脱后的流分分段收集。
(6)浓缩:采用常压浓缩、真空浓缩等方法对收集的含安卓奎诺尔的样品进行浓缩。
所述步骤(3)中非极性或中极性的大孔树脂优选HPD100、HPD400、HPD700、HPD750、HPD826或D101。
所述步骤(3)优选以大孔树脂HPD100、HPD400、HPD700、HPD750、HPD826或D101为柱层析填料,以0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)的乙醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱。
所述步骤(3)还优选以60-80目或100-200目的硅胶为柱层析填料,以0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)的丙酮的苯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱。
所述步骤(3)还进一步优选以大孔树脂HPD100或HPD400为柱层析填料,水溶液冲洗HPD100或HPD400大孔树脂后,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)的乙醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积。
所述步骤(3)还优选柱层析填料60-80目或100-200目的硅胶,用苯冲洗60-80目或100-200目的硅胶,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)丙酮的苯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积。
所述步骤(5)优选200-300目的硅胶,以体积比70-75∶25-30的苯:甲醇为洗脱剂,以0.6BV/h流速洗脱,洗脱后的流分分段收集。
本发明方法得到的纯化的安卓奎诺尔为淡黄色油状物,其纯度达91%以上,产品的HPLC图谱为附图1,为单一峰;板层析图谱为附图2,TLC层析呈单一点。
本发明采用硅胶或大孔树脂层析结合半制备色谱分离纯化安卓奎诺,最后再采用硅胶层析纯化。其操作简单、易实施,能有效从目标产物含量较低的樟芝固态发酵粉末中得到安卓奎诺尔纯度为90%以上的产品,所得产品可以作为对照品用于检测或其它生理活性、稳定性试验的研究及应用等方面。
附图说明
图1:实施例3分离制备的安卓奎诺尔HPLC检测图谱。
图2:实施例3分离制备的安卓奎诺尔板层析图谱,A图为254nm下的检测图谱,B图为365nm下的检测图谱,样品1:浓缩液1;样品2:浓缩液2;样品3:浓缩液3;样品4:二次柱层析后的安卓奎诺尔产品。
图3:实施例3分离制备的安卓奎诺尔的核磁共振H谱。
图4:实施例3分离制备的安卓奎诺尔的核磁共振C谱。
具体实施方式
樟芝固态发酵产安卓奎诺尔、及安卓奎诺尔的检测方法均采用本领域现有常规方法,在此不作赘述。
实施例1
樟芝固态发酵粉末(安卓奎诺尔的含量为300mg/kg)500g与5L乙醇混合,在35℃下浸提1.5h;浸提后经布氏漏斗抽滤,滤液在45℃下旋转蒸发除去乙醇,得到安卓奎诺尔粗提浸膏,所述粗提浸膏与70%(v/v)乙酸乙酯水溶液按1g∶20mL的比例加入乙酸乙酯水溶液萃取,静置分层,萃取3次,收集合并乙酸乙酯相,在45℃下真空旋转蒸发浓缩安卓奎诺尔,得到安卓奎诺尔浓缩液1。
用水溶液冲洗HPD100大孔树脂后,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)的乙醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积。洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发浓缩得到浓缩液2。
半制备色谱柱分离安卓奎诺尔:采用SapphireC18(10.0×250mm,5um,100A)的制备色谱柱,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速为2mL/min,柱温28℃;UV检测器:检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质。收集液浓缩后得到浓缩液3。
浓缩液3的柱层析分离:第二次硅胶柱层析用200-300目的硅胶,采用体积比75∶25的苯:甲醇为洗脱剂,以0.6BV/h流速洗脱,洗脱后的流分分段收集。
合并含安卓奎诺尔的流分采用常压浓缩或真空浓缩,制得的安卓奎诺尔的得率为71`%。根据安卓奎诺尔在254nm的最大吸收峰面积与全部物质在254nm最大吸收峰面积总和的比值,可计算安卓奎诺尔的纯度为91%。
实施例2
樟芝固态发酵粉末(安卓奎诺尔的含量为300mg/kg)500g与5L乙醇混合,在35℃下浸提1.5h;浸提后经布氏漏斗抽滤,滤液在45℃下旋转蒸发除去乙醇,得到安卓奎诺尔粗提浸膏,所述粗提浸膏∶70%(v/v)乙酸乙酯水溶液按1g∶20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取,静置分层,萃取3次。收集合并乙酸乙酯相,在45℃下真空旋转蒸发浓缩安卓奎诺尔,得到安卓奎诺尔浓缩液1。
用水溶液冲洗HPD400大孔树脂,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)乙醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积。洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发浓缩得到浓缩液2。
半制备色谱柱分离安卓奎诺尔:采用SapphireC18(10.0×250mm,5um,100A)的制备色谱柱,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速为2mL/min,柱温28℃;UV检测器:检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质。收集液浓缩后得到浓缩液3。
浓缩液3的柱层析分离:第二次硅胶柱层析用200-300目的硅胶采用苯∶甲醇体积比75∶25为洗脱剂,以0.6BV/h流速洗脱,洗脱后的流分分段收集。
合并含安卓奎诺尔的流分采用常压浓缩或真空浓缩,制得的安卓奎诺尔的得率为69%。根据安卓奎诺尔在254nm的最大吸收峰面积与全部物质在254nm最大吸收峰面积总和的比值,可计算安卓奎诺尔的纯度为91%。
实施例3
樟芝固态发酵粉末(安卓奎诺尔的含量为300mg/kg)500g与5L乙醇混合,在35℃下浸提1.5h;浸提后经布氏漏斗抽滤,滤液在45℃下旋转蒸发除去乙醇,得到安卓奎诺尔粗提浸膏,所述粗提浸膏∶70%(v/v)乙酸乙酯水溶液按1g∶20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取,静置分层,萃取3次,收集合并乙酸乙酯相,在45℃下真空旋转蒸发浓缩安卓奎诺尔,得到安卓奎诺尔浓缩液1。
用苯冲洗60-80目硅胶,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)丙酮的苯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积,洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发浓缩得到浓缩液2。
半制备色谱柱分离安卓奎诺尔:采用SapphireC18(10.0×250mm,5um,100A)的制备色谱柱,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速为2mL/min,柱温28℃;UV检测器:检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质。收集液浓缩后得到浓缩液3。
浓缩液3的柱层析分离:第二次硅胶柱层析用200-300目的硅胶采用苯∶甲醇体积比75∶25为洗脱剂,以0.6BV/h流速洗脱,洗脱后的流分分段收集。
合并含安卓奎诺尔的流分采用常压浓缩或真空浓缩,制得的安卓奎诺尔的得率为73%。根据安卓奎诺尔在254nm的最大吸收峰面积与全部物质在254nm最大吸收峰面积总和的比值,可计算安卓奎诺尔的纯度为91%。
实施例4
樟芝固态发酵粉末(安卓奎诺尔的含量为300mg/kg)500g与5L乙醇混合,在35℃下浸提1.5h;浸提后经布氏漏斗抽滤,滤液在45℃下旋转蒸发除去乙醇,得到安卓奎诺尔粗提浸膏,所述粗提浸膏∶70%(v/v)乙酸乙酯水溶液按1g∶20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取,静置分层,萃取3次,收集合并乙酸乙酯相,在45℃下真空旋转蒸发浓缩安卓奎诺尔,得到安卓奎诺尔浓缩液1。
用苯冲洗60-80目硅胶,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)丙酮的苯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积,洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发浓缩得到浓缩液2。
半制备色谱柱分离安卓奎诺尔:采用SapphireC18(10.0×250mm,5um,100A)的制备色谱柱,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速为2mL/min,柱温28℃;UV检测器:检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质。收集液浓缩后得到浓缩液3。
浓缩液3的柱层析分离:第二次硅胶柱层析用200-300目的硅胶,采用体积比70∶30的苯∶甲醇为洗脱剂,以0.6BV/h流速洗脱,洗脱后的流分分段收集。
合并含安卓奎诺尔的流分采用常压浓缩或真空浓缩,制得的安卓奎诺尔的得率为75%。根据安卓奎诺尔在254nm的最大吸收峰面积与全部物质在254nm最大吸收峰面积总和的比值,可计算安卓奎诺尔的纯度为85%。
实施例5
樟芝固态发酵粉末(安卓奎诺尔的含量为300mg/kg)500g与5L乙醇混合,在35℃下浸提1.5h;浸提后经布氏漏斗抽滤,滤液在45℃下旋转蒸发除去乙醇,得到安卓奎诺尔粗提浸膏,所述粗提浸膏∶70%(v/v)乙酸乙酯水溶液按1g∶20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取,静置分层,萃取3次。收集合并乙酸乙酯相,在45℃下真空旋转蒸发浓缩安卓奎诺尔,得到安卓奎诺尔浓缩液1。
用苯冲洗100-200目硅胶,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)丙酮的苯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积,洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发浓缩得到浓缩液2。
半制备色谱柱分离安卓奎诺尔:采用SapphireC18(10.0×250mm,5um,100A)的制备色谱柱,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速为2mL/min,柱温28℃;UV检测器:检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质。收集液浓缩后得到浓缩液3。
浓缩液3的柱层析分离:第二次硅胶柱层析用200-300目的硅胶,采用体积比75∶25的苯∶甲醇为洗脱剂,以0.6BV/h流速洗脱,洗脱后的流分分段收集。
合并含安卓奎诺尔的流分采用常压浓缩或真空浓缩,制得的安卓奎诺尔的得率为70%。根据安卓奎诺尔在254nm的最大吸收峰面积与全部物质在254nm最大吸收峰面积总和的比值,可计算安卓奎诺尔的纯度为89%。
实施例6
樟芝固态发酵粉末(安卓奎诺尔的含量为300mg/kg)500g与5L乙醇混合,在35℃下浸提1.5h;浸提后经布氏漏斗抽滤,滤液在45℃下旋转蒸发除去乙醇,得到安卓奎诺尔粗提浸膏,所述粗提浸膏∶70%(v/v)乙酸乙酯水溶液按1g∶20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取,静置分层,萃取3次。收集合并乙酸乙酯相,在45℃下真空旋转蒸发浓缩安卓奎诺尔,得到安卓奎诺尔浓缩液1。
用苯冲洗100-200目硅胶,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%(v/v)丙酮的苯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积,洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发浓缩得到浓缩液2。
半制备色谱柱分离安卓奎诺尔:采用SapphireC18(10.0×250mm,5um,100A)的制备色谱柱,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速为2mL/min,柱温28℃;UV检测器:检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质。收集液浓缩后得到浓缩液3。
浓缩液3的柱层析分离:第二次硅胶柱层析用200-300目的硅胶,采用体积比70∶30苯∶甲醇为洗脱剂,以0.6BV/h流速洗脱,洗脱后的流分分段收集。
合并含安卓奎诺尔的流分采用常压浓缩或真空浓缩,制得的安卓奎诺尔的得率为70%。根据安卓奎诺尔在254nm的最大吸收峰面积与全部物质在254nm最大吸收峰面积总和的比值,可计算安卓奎诺尔的纯度为85%。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种从樟芝固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法,其特征在于,以樟芝固态发酵粉末为原料,通过萃取、浓缩除杂、一次柱层析、半制备色谱、二次柱层析、浓缩得到高纯度的含安卓奎诺尔的产品。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)萃取:将樟芝固态发酵粉末,以无水乙醇反复浸提多次,然后合并滤液得到安卓奎诺尔粗提浓缩液;
(2)浓缩除杂:除去步骤(1)粗提浓缩液中的乙醇,以体积分数50%-90%的乙酸乙酯水溶液反复萃取3次;收集合并乙酸乙酯相,除去乙酸乙酯,得到浓缩液1;
(3)一次柱层析:柱层析填料为60-80目或100-200目的硅胶,或非极性或中极性的大孔树脂,采用梯度洗脱,以乙醇水溶液或选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群中的两种物质混合作为洗脱剂进行梯度洗脱,洗脱后的流分分段收集,合并含安卓奎诺尔的流分,旋转蒸发得到浓缩液2;
(4)半制备色谱:将浓缩液2以半制备色谱分离纯化,流动相为体积分数80-100%的乙腈水溶液,流速:2mL/min,采用普通C18的制备色谱柱,柱温20-40℃;UV检测器,检测波长为254nm;根据出峰时间收集物质,收集液浓缩后得到浓缩液3;
(5)二次柱层析:柱层析填料为200-300目的硅胶,以选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群的两种物质混合作为洗脱剂进行梯度洗脱,洗脱后的流分分段收集;
(6)浓缩:对收集的含安卓奎诺尔的样品进行常压浓缩或真空浓缩。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(1)将安卓奎诺尔含量为300mg/kg~1000mg/kg的樟芝固态发酵粉末,按照料液比1g:5mL-1g:15mL的比例加入无水乙醇,20-40℃下浸提、过滤,反复3次,然后合并滤液得到安卓奎诺尔粗提浓缩液。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,步骤(2)在40-50℃下真空旋转蒸发除去乙醇得到安卓奎诺尔粗提浸膏,粗提浸膏与体积分数50%-90%的乙酸乙酯水溶液按1g:5mL-1g:20mL的比例加入乙酸乙酯水溶液进行萃取,静置分层,萃取3次;收集合并乙酸乙酯相,在40-50℃下真空旋转蒸发除去乙酸乙酯,得到浓缩液1。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中非极性或中极性的大孔树脂为HPD100、HPD400、HPD700、HPD750、HPD826或D101。
6.根据权利要求2或5所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)以体积分数为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的乙醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)柱层析填料为60-80目或100-200目的硅胶,以体积分数为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的丙酮的苯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)柱层析填料为大孔树脂HPD100或HPD400,水溶液冲洗HPD100或HPD400大孔树脂后,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用体积分数为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的乙醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积。
9.根据权利要求2或7所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)柱层析填料为60-80目或100-200目的硅胶,用苯冲洗60-80目或100-200目的硅胶,以流速为0.5BV/h注入安卓奎诺尔浓缩液1,待吸附结束后,用体积分数为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的丙酮的苯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,每个浓度洗脱1个柱体积。
10.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)柱层析填料为200-300目的硅胶,以体积比70-75∶25-30的苯:甲醇为洗脱剂,以0.6BV/h流速洗脱,洗脱后的流分分段收集。
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