CN104080922B - 细胞计数方法、细胞计数装置和细胞计数程序 - Google Patents

细胞计数方法、细胞计数装置和细胞计数程序 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种细胞计数方法，在细胞培养中，即使在细胞密集而形成立体的细胞团时，也能够不打散该细胞团而准确地计数培养细胞数。该方法如下：取得培养细胞的图像，并由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像，分别依据细胞团的图像和单独细胞的图像，计算细胞团的细胞数和单独细胞的细胞数。

Description

细胞计数方法、细胞计数装置和细胞计数程序
技术领域
本发明涉及计数细胞的方法，特别涉及用于在培养浮游细胞时，不损害增殖效率而准确地计数培养中的细胞数的细胞计数方法、细胞计数装置和细胞计数程序。
背景技术
近年，在药品生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞、组织、微生物等。
当这样大量培养细胞时，有必要在培养浮游细胞时计数培养中的细胞数，掌握细胞数随时间的变化、增殖效率的变化。但是，对于准确地计数培养中的细胞数，一直以来存在各种各样的问题。
即，在浮游细胞的增殖中，存在细胞立体地集合而形成的细胞团和独自分离的单独细胞。
一直以来，进行如下的方法：从上方或下方拍摄这些培养细胞，依据所得图像中的培养细胞的投影面积，通过用细胞团的投影面积除以每一个的平均细胞面积，从而计数细胞数。
但是，由于细胞团是立体的，因此按照这样得到的细胞数被计数为少于细胞团的实际细胞数。另外，在单独细胞呈平面密集连接时，通过用单独细胞的投影面积除以每一个的平均细胞面积而得到的细胞数被计数为多于单独细胞的实际细胞数。因此存在如下问题，依据培养细胞的投影面积计数的细胞数不是准确的值。
另一方面，为了得到准确的细胞数，也考虑将细胞团完全打散并计数。
但是，通常存在细胞团的过于打散而招致细胞的扩增效率降低这一进一步的问题。因此，一直以来在培养过程中不能进行准确的计数，仅在细胞回收时能够进行准确的计数。
在此，作为计数培养细胞的细胞数的现有方法，可以列举例如专利文献1中记载的细胞数计量方法。在该方法中，取得存在于培养容器内的培养细胞的观察图像，在取得的观察图像内计算培养细胞所占有的面积比率作为占有面积率，根据计算的占有面积率和规定的关系式计算存在于培养容器内的培养细胞的细胞数。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007－124913号公报
发明内容
发明所要解决的课题
但是，由于该方法是根据占有面积率计算细胞数的方法，因此如上所述，不能够进行准确的计数。另一方面，为了进行准确的计数，若将细胞团打散，则招致增殖效率的降低。
本发明是鉴于上述情况而完成的，目的在于提供即使存在细胞团也能够不将其打散而准确地计数细胞数的细胞计数方法、细胞计数装置和细胞计数程序，该方法如下：取得培养中的培养细胞的图像，并由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像，对细胞团的图像和单独细胞的图像分别进行图像处理，分别计算细胞团的细胞数和单独细胞的细胞数。
用于解决课题的方法
为了达成上述目的，本发明的细胞计数方法是计数培养细胞的方法，其中，取得培养中的培养细胞的图像，由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像，分别依据细胞团的图像和单独细胞的图像，计算细胞团的细胞数和单独细胞的细胞数。
另外，本发明的细胞计数装置是用于计数培养细胞的细胞计数装置，其具备：取得培养中的培养细胞的图像的单元、由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像的单元、和分别依据细胞团的图像和单独细胞的图像，计算细胞团的细胞数和单独细胞的细胞数的单元。
另外，本发明的细胞计数程序是用于计数培养细胞的细胞计数程序，其使计算机执行以下内容：输入培养中的培养细胞的图像，由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像，分别依据细胞团的图像和单独细胞的图像，计算细胞团的细胞数和单独细胞的细胞数。
发明效果
根据本发明，能够不损害增殖效率而准确地计数培养中的细胞数。
附图说明
图1是表示从培养容器的底面方向拍摄在培养容器中培养中的浮游细胞而得到的图像的图。
图2是表示从培养容器的底面方向拍摄在培养容器中培养中的浮游细胞而得到的图像中的细胞的投影面积的图。
图3是使用从培养容器的底面方向拍摄在培养容器中培养中的浮游细胞而得到的图像，将单独细胞和细胞团进行分离，表示细胞团的投影面积的图。
图4是使用从培养容器的底面方向拍摄在培养容器中培养中的浮游细胞而得到的图像，将单独细胞和细胞团进行分离，表示单独细胞的投影面积的图。
图5是表示培养中的浮游细胞中的单独细胞的直径变化的图。
图6是表示培养中的浮游细胞中的细胞团的体积的校正系数的图。
图7是表示本发明的细胞计数装置的构成的模块图。
图8是表示通过本发明的细胞计数装置执行的细胞计数程序的处理顺序的流程图。
图9是表示对基于本发明的细胞计数方法和现有的细胞计数方法的在培养容器中培养中的浮游细胞的计数结果进行比较的图。
具体实施方式
下面对于本发明的细胞计数方法、细胞计数装置和细胞计数程序的优选实施方式，参照附图进行说明。
[细胞计数方法]
首先，对于本实施方式的细胞计数方法，参照图1～图6进行说明。
本实施方式的细胞计数方法是计数培养容器中的培养细胞数的方法，只要是如下的方法即可：取得培养容器中的规定的区域的图像，由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像，对细胞团的图像和单独细胞的图像分别进行图像处理，分别计算细胞团的细胞数和单独细胞的细胞数。并不限定于实施方式和实施例的具体构成，可以成为具备例如以下的工序的方法。
(A)培养细胞的图像的取得
首先，拍摄培养容器中的规定的区域，取得图像。具体例如从透明的培养容器的上方照射光，从下方经由显微镜利用相机自动地拍摄培养细胞，从而能够取得培养容器中的规定的区域的图像。下面有时将该图像称为“观察图像”。图1表示按照这样得到的拍摄培养容器中的浮游细胞而得到的观察图像。在该图中示出了细胞团1、单独细胞2存在于培养液3中的样态。
需要说明的是，可以仅拍摄培养容器中的规定的区域，将该区域中的细胞数计数后，依据该区域相对于培养容器整体的比例计算培养容器整体的培养细胞数。
在此，以往，使用该观察图像制成如图2中所示的细胞的投影面积图像，用细胞的投影面积11除以每一个细胞的平均面积来计算细胞数。但是，对于用这样的方法得到的细胞数而言，由于细胞团1是立体的，因此与细胞团1对应的部分变得少于实际的细胞数。另外，关于与单独细胞2对应的部分，单独细胞2平面地连接的部分也包含于细胞投影面积11中，其结果是被计数为多于实际的细胞数。因此，在这样的现有方法中不能够准确地计数培养细胞数。
(B)细胞团与单独细胞的图像分离
接着，将观察图像中的细胞团1和单独细胞2的图像进行分离，分别制成细胞团的图像和单独细胞的图像。
具体地，首先如图3所示，制成仅表示细胞团1的细胞投影面积21的细胞团的图像。然后，使用该细胞团的图像，计量细胞团1的细胞投影面积21。
另外，如图4所示，从观察图像删去细胞团1，制成单独细胞的图像。然后，使用该单独细胞的图像，以能够将单独细胞2分别计数的方式将单独细胞2以圆形近似从而进行将它们分别区分的圆形近似处理。由此，在单独细胞的图像中示出进行了圆形近似的单独细胞22。然后，使用该单独细胞的图像计量单独细胞2的个数，并且计量单独细胞2的平均面积。
在此，如图5所示，有时培养中的培养细胞的大小根据培养时间而变化。在该图中表示了将人的淋巴球细胞增殖时的细胞直径的变化。
如该图所示，在培养的初期，培养细胞的直径逐渐增加，但在经过一定时间后反而能够看到直径变小的倾向。因此，由于单独细胞的平均面积根据观察时间而变化，如上所述，优选在计数培养细胞之时，计量单独细胞的平均面积。
另一方面，例如某种肿瘤细胞，根据培养细胞的种类，也有在培养中的大小几乎不变化的细胞。在这样的培养细胞的情况下，没有必要在计数培养细胞之时计量单独细胞的平均面积。即，单独细胞的平均面积用于后述的细胞团的细胞数的计算，这样的培养细胞的情况下，也优选代替计量平均面积而预先设定单独细胞的体积，将其使用于培养细胞的计数。
(C)细胞团的体积的计算
接着，使用依据细胞团的图像得到的细胞投影面积21，以球形计算细胞团1的体积。并且，使用校正系数修正按照这样计算的细胞团1的球形的体积。具体地，用该球形的体积除以校正系数，能够得到更接近实际值的细胞团1的体积。
在图6中示出了表示细胞团的投影面积与校正系数的关系的图。在该图中绘制了细胞团的投影面积与实际测定的细胞团的体积的关系，依据于此，将细胞团的投影面积与校正系数的关系表示于式中。即，在本实施方式中，确定校正系数的式子如下。
[校正系数]＝1.1003×[细胞团的投影面积(×10-5cm2)]－0.1885
其中，细胞团的投影面积不足1.0802×10-5cm2时，校正系数为1。
将细胞团的体积按照这样进行修正的原因如下：在细胞团小时以几乎球形的状态存在，而随着细胞团变大，细胞团沿纵向坍塌，纵断面成为椭圆形的形状。即，由于随着细胞投影面积变大，细胞团进一步呈沿纵向坍塌的形状，因此将其通过校正系数进行修正。需要说明的是，校正系数有时根据细胞的种类、培养条件而不同，因此希望根据这些而预先确定。
(D)细胞团的细胞数的计算
接着，用修正而得到的细胞团1的体积除以单独细胞2的体积，计算细胞团1的细胞数。单独细胞2的体积可以依据单独细胞2的平均面积计算。
(E)培养细胞的细胞数的计算
如上，能够得到单独细胞2的细胞数和细胞团1的细胞数，将它们相加，可以计算观察图像的区域中的细胞数。并且，通过用得到的细胞数乘以培养液的体积相对于观察图像的区域的比率，能够计算培养细胞的细胞数。
[细胞计数装置和细胞计数程序]
接着，对于本实施方式的细胞计数装置和细胞计数程序，参照图7～图8进行说明。图7是表示本发明的一个实施方式的细胞计数装置的构成的模块图，图8是表示通过该细胞计数装置执行的细胞计数程序的处理顺序的流程图。
首先，如图7所示，本实施方式的细胞计数装置100具备图像输入单元101、图像记忆单元102、图像分离单元103、单独细胞计量单元104、细胞团体积计算单元105、细胞团细胞数计算单元106和细胞数输出单元107。该细胞计数装置100可以使用智能手机、平板电脑、个人电脑、工作站、服务器等各种计算机来构成，上述各构成可以由计算机的CPU和内存等构成。另外，也可以作为具备各构成的专用的计数装置来构成。
图像输入单元101输入用相机自动拍摄培养中的培养细胞而得到的图像(观察图像)，记忆于图像记忆单元102。
图像分离单元103对观察图像中的细胞团和单独细胞进行分离，制成细胞团图像和单独细胞图像，分别记忆于图像记忆单元102。
单独细胞计量单元104使用单独细胞图像进行单独细胞的圆形近似，并计量单独细胞数。另外，单独细胞计量单元104还计量单独细胞的平均面积。
细胞团体积计算单元105使用细胞团图像，计量细胞团的投影面积。另外，细胞团体积计算单元105依据细胞团的投影面积以球形计算细胞团的体积。还有，细胞团体积计算单元105对计算的球形的体积使用校正系数，计算修正后的细胞团的体积。
细胞团细胞数计算单元106用通过细胞团细胞数计算单元105计算的细胞团的体积除以单独细胞的体积，计算细胞团的细胞数。此时，细胞团细胞数计算单元106依据通过单独细胞计量单元104计量的单独细胞的平均面积计算单独细胞的体积。
细胞数输出单元107计算单独细胞的细胞数与细胞团的细胞数之和作为观察图像上的区域中的细胞数，所述单独细胞的细胞数通过单独细胞计量单元104计数，所述细胞团的细胞数通过细胞团细胞数计算单元106计算。另外，细胞数输出单元107通过对该观察图像上的区域中的细胞数乘以培养液的体积相对于观察图像上的区域的比率，由此能够计算培养液中的细胞数。
并且，细胞数输出单元107将观察图像上的区域中的细胞数和/或培养液中的细胞数输出至连接于细胞计数装置100的显示器等显示装置(未图示)。
接着，对于细胞计数装置100的处理顺序，参照图8进行说明。该图是表示通过本发明的一个实施方式的细胞计数装置100执行的细胞计数程序的处理顺序的流程图。即，本实施方式的细胞计数程序使计算机等细胞计数装置100执行如下的处理。
首先，细胞计数装置100的图像输入单元101输入由相机拍摄的观察图像，将该图像记忆于图像记忆单元102(步骤10)。
接着，细胞计数装置100的图像分离单元13使用观察图像，将细胞团1和单独细胞2的图像进行分离，制成细胞团的图像和单独细胞的图像，将这些图像记忆于图像记忆单元102(步骤11)。
接着，细胞计数装置100的单独细胞计量单元104使用单独细胞的图像进行单独细胞的圆形近似，并计量单独细胞数。另外，计量单独细胞的平均面积(步骤12)。
另外，细胞计数装置100的细胞团体积计算单元105使用细胞团的图像计量细胞团的投影面积，并使用该投影面积计算将细胞团假定为球形时的体积(步骤13)。
然后，该细胞团体积计算单元105将计算的球形的体积进行修正，计算更接近实际的细胞团的体积(步骤14)。
接着，细胞计数装置100的细胞团细胞数计算单元106用细胞团的体积除以单独细胞的体积，由此计算观察图像上的区域中的细胞团的细胞数(步骤15)。
根据以上，能够分别更准确地计算细胞团的细胞数和单独细胞的细胞数，因此能够进一步准确地掌握培养细胞的细胞数。
最后，细胞计数装置100的细胞数输出单元107将细胞团的细胞数和单独细胞的细胞数进行合计，计算观察图像上的区域中的细胞数。另外，将得到的细胞数换算为培养容器整体的细胞数。然后，细胞数输出单元107将培养容器中的细胞数等输出于显示装置(步骤16)。
按照以上说明，以往，特别是若形成一定以上的尺寸的细胞团，则不能够准确地计数细胞数，因此存在只能实质上在培养后进行计数的问题。
但是，根据本实施方式变得能够准确地计数细胞团的细胞数。另外，对于单独细胞，与现有相比较能够更准确地计数。因此，能够进一步准确地掌握培养中的细胞数。
另外，其结果是能够记录细胞增殖历程，能够掌握培养中的细胞的状态。
还有，通过本实施方式的细胞计数装置能够掌握培养中的细胞数，因此能够消除目测观察导致的偏差，能够更准确地进行继代培养时机的判断。
实施例
(实施例1)
使用上述的实施方式的细胞计数方法、细胞计数装置和细胞计数程序，将培养容器中的培养细胞进行计数。
具体地，作为培养容器，使用LLDPE制培养袋(厚度100μm，尺寸230×620mm)。对于培养基，使用AlyS505N－7(细胞科学研究所)，作为接种细胞，接种人末梢血单核球细胞6.4×106个细胞。然后，在培养开始66小时后、104小时后、174小时后、222小时后、234小时后，计数培养细胞数。
其结果是，通过实施例1计算的细胞数如图9所示，分别为1.60×108个细胞、4.07×108个细胞、8.41×108个细胞、1.16×109个细胞、1.19×109个细胞。
(比较例1)
使用与实施例1中使用的相同的培养容器和培养细胞，在与实施例1相同的时机，通过现有的方法计数培养细胞。即，使用拍摄培养容器中的规定的区域而得到的培养细胞的观察图像，取得细胞的投影面积图像。并且计量细胞的投影面积，用得到的投影面积除以一个细胞的平均面积，计算细胞数。
其结果是，通过比较例1计算的细胞数如图9所示，分别为1.12×108个细胞、3.79×108个细胞、4.34×108个细胞、1.08×109个细胞、1.11×109个细胞。
(参考例1)
以与实施例1相同的条件培养细胞，在计数培养细胞时，将细胞团打散，全部成为单独细胞后进行计数。此时，使用拍摄培养容器中的规定的区域而得到的观察图像，将单独细胞进行圆形近似，并计量细胞数。
需要说明的是，在每个计数时机分别准备培养容器，且分别仅用于一次计数。因此认为，在本参考例中不存在将细胞团打散导致的培养效率的降低的影响，并且在各自的计数时机内能够得到接近较真实的细胞数的准确计数结果。
其结果是，通过参考例1计算的细胞数如图9所示，分别为1.45×108个细胞、4.34×108个细胞、8.48×108个细胞、1.25×109个细胞、1.24×109个细胞。
如上可知，在比较例1中示出的现有的细胞计数方法中计数值不稳定，不能够进行准确的计数。例如，174小时后的计数值与实施例1和参考例1的结果相比明显变低。其原因被认为是由于培养细胞的细胞团变大。
与此相对，可知，根据实施例1中示出的本实施方式的细胞计数方法、细胞计数装置和细胞计数程序，即使不将细胞团打散而计数细胞数，也能够进行与参考例1中示出的将细胞团打散而全部成为单独细胞后进行计数的情况大致相同的准确计数。
本发明并不现定于以上的实施方式、实施例，自不必说在本发明的范围内可以进行各种变更实施。
例如，在上述实施方式中，在仅计量细胞团的细胞投影面积之后计量单独细胞数和平均面积，但也可以交换它们的顺序。另外，可以进行将校正系数根据细胞数、培养条件进行变更等适当更改。
产业上的可利用性
本发明在有必要培养大量的细胞的生物医药、再生医疗、免疫疗法等的领域，能够优选地利用。

Claims (3)

1.一种细胞计数方法，其是计数培养细胞的方法，其特征在于，
取得所述培养细胞的图像，
由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像，
依据所述单独细胞的图像进行单独细胞的圆形近似，并计算所述单独细胞的细胞数和平均面积，
依据下述式(i)或式(ii)算出校正系数，
(i)细胞团的投影面积≥1.0802×10-5cm2时，
校正系数＝1.1003×(细胞团的投影面积、×10-5cm2)－0.1885；
(ii)细胞团的投影面积＜1.0802×10-5cm2时，
校正系数＝1，
依据所述细胞团的投影面积，以球状计算所述细胞团的体积后除以校正系数，从而算出所述细胞团的体积，
依据所述单独细胞的平均面积计算所述单独细胞的体积，
通过所述细胞团的体积除以所述单独细胞的体积，计算所述细胞团的细胞数。
2.一种细胞计数方法，其是计数培养细胞的方法，其特征在于，
预先设定单独细胞的体积，
取得所述培养细胞的图像，
由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像，
依据所述单独细胞的图像进行单独细胞的圆形近似，并计算所述单独细胞的细胞数和平均面积，
依据下述式(i)或式(ii)算出校正系数，
(i)细胞团的投影面积≥1.0802×10-5cm2时，
校正系数＝1.1003×(细胞团的投影面积、×10-5cm2)－0.1885；
(ii)细胞团的投影面积＜1.0802×10-5cm2时，
校正系数＝1，
依据所述细胞团的投影面积，以球状计算所述细胞团的体积后除以校正系数，从而算出所述细胞团的体积，
通过所述细胞团的体积除以预先设定的所述单独细胞的体积，计算所述细胞团的细胞数。
3.一种细胞计数装置，其是用于计数培养细胞的细胞计数装置，其特征在于，具备：
取得所述培养细胞的图像的单元、
由该图像分离细胞团的图像和单独细胞的图像的单元、和
依据所述单独细胞的图像进行单独细胞的圆形近似，并计算所述单独细胞的细胞数和平均面积，
依据下述式(i)或式(ii)算出校正系数，
(i)细胞团的投影面积≥1.0802×10-5cm2时，
校正系数＝1.1003×(细胞团的投影面积、×10-5cm2)－0.1885；
(ii)细胞团的投影面积＜1.0802×10-5cm2时，
校正系数＝1，
依据所述细胞团的投影面积，以球状计算所述细胞团的体积后除以校正系数，从而算出所述细胞团的体积，依据所述单独细胞的平均面积计算所述单独细胞的体积，通过所述细胞团的体积除以所述单独细胞的体积，计算所述细胞团的细胞数的单元。
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