JP6505830B2 - 細胞解析装置および細胞解析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞解析装置および細胞解析方法に関するものである。
培養容器内の細胞数をカウントする技術として、位相差画像から細胞の形状認識によって細胞数をカウントする技術がある（例えば、特許文献１参照。）。
特開２００７−７８６１４号公報
特許文献１の細胞数計測装置では、画像内の細胞検出範囲内の細胞数を計測し、計測した細胞数に基づいて容器内の細胞数を算出する際に、細胞数の計測に適した状態で細胞が写っていない場合には、計測精度が低下する。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易に精度よく培養容器内の細胞の細胞数を計測することができる細胞解析装置および細胞解析方法を提供することを目的としている。
本発明の一態様は、細胞を培養している培養容器内の細胞の画像を取得する細胞画像取得部と、該細胞画像取得部により取得された画像の利用可否を判定する利用可否判定部と、該利用可否判定部により利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数部と、該細胞数計数部により計数された細胞数に基づいて前記培養容器内の細胞数を算出する細胞数算出部とを備える細胞解析装置である。
本態様によれば、細胞画像取得部の作動により取得された培養容器内の画像の利用可否が、利用可否判定部によって判定され、利用可であると判定された画像内の細胞数が細胞数計数部によって係数されるので、細胞数を計数するのに適当な状態で細胞が写っていない画像が計数の対象から除外され、最終的に細胞数算出部により算出される培養容器内の細胞数を精度よく算出することができる。
上記態様においては、前記利用可否判定部が、画像のブレを検出し、ブレが存在しない場合に利用可であると判定してもよい。
このようにすることで、画像がブレている場合に、当該画像が細胞数の計数の対象から除外されるので、ブレのない画像に基づいて細胞数を精度よく算出することができる。
また、上記態様においては、前記利用可否判定部が、前記培養容器のエッジが写り込んでいるか否かを検出し、前記培養容器のエッジが写り込んでいない場合に利用可であると判定してもよい。
このようにすることで、画像に培養容器のエッジが写り込んでいる場合に、当該画像が細胞数の計数の対象から除外されるので、エッジの写り込みのない画像に基づいて細胞数を精度よく算出することができる。
また、上記態様においては、前記利用可否判定部が、前記培養容器の外部が写り込んでいるか否かを検出し、前記培養容器の外部が写り込んでいない場合に利用可であると判定してもよい。
このようにすることで、画像に培養容器の外部が写り込んでいる場合に、当該画像が細胞数の計数の対象から除外されるので、容器外部の写り込みのない画像に基づいて細胞数を精度よく算出することができる。
また、上記態様においては、前記細胞数算出部が、複数枚の画像から計数された細胞数の平均値を用いて細胞数を算出し、前記利用可否判定部が、既に取得された画像と同一の画像であるか否かを検出し、同一の画像ではない場合に利用可であると判定してもよい。
このようにすることで、細胞数計数部により計数された複数枚の画像の細胞数の平均値に基づいて、細胞数算出部により培養容器内の細胞数が算出される。この場合には、既に取得された画像と同一の画像を用いても、平均による精度向上を望むことはできないので、このような画像を除外して、細胞数を精度よく算出することができる。
また、本発明の他の態様は、細胞を培養している培養容器内の細胞の画像を取得する撮影ステップと、該撮影ステップにより取得された画像の利用可否を判定する利用可否判定ステップと、該利用可否判定ステップにより利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数ステップと、該細胞数計数ステップにより計数された細胞数に基づいて前記培養容器内の細胞数を算出する細胞数算出ステップとを含む細胞解析方法である。
上記態様においては、前記利用可否判定ステップが、画像のブレを検出し、ブレが存在しない場合に利用可であると判定してもよい。
また、上記態様においては、前記利用可否判定ステップが、前記培養容器のエッジが写り込んでいるか否かを検出し、前記培養容器のエッジが写り込んでいない場合に利用可であると判定してもよい。
また、上記態様においては、前記利用可否判定ステップが、前記培養容器の外部が写り込んでいるか否かを検出し、前記培養容器の外部が写り込んでいない場合に利用可であると判定してもよい。
また、上記態様においては、前記細胞数算出ステップが、複数枚の画像から計数された細胞数の平均値を用いて細胞数を算出し、前記利用可否判定ステップが、既に取得された画像と同一の画像であるか否かを検出し、同一の画像ではない場合に利用可であると判定してもよい。
本発明によれば、簡易に精度よく培養容器内の細胞の細胞数を計測することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る細胞解析装置を示す全体構成図である。 図１の細胞解析装置を用いた本発明の一実施形態に係る細胞解析方法を示すフローチャートである。 図１の細胞解析装置の変形例を示す全体構成図である。 図３の細胞解析装置を用いた細胞解析方法の変形例を示すフローチャートである。 図２の細胞解析方法の他の変形例を示すフローチャートである。
本発明の一実施形態に係る細胞解析装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞解析装置１は、図１に示されるように、培養容器２内において培養されている細胞の画像を取得する細胞画像取得部３と、該細胞画像取得部３により取得された画像を処理して培養容器２内の細胞数を出力する画像処理部４とを備えている。
細胞画像取得部３は、細胞を培養している培養容器２の培養面２ａに対向して配置され、培養面２ａからの光を集光する対物レンズ５と、該対物レンズ５により集光された光を撮影することにより、培養面２ａ内の所定の視野範囲にわたる画像を取得する光検出部６とを備えている。
取得する画像は、例えば、位相差画像である。
画像処理部４は、光検出部６により取得された細胞の画像の利用可否を判定する利用可否判定部７と、該利用可否判定部７により利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数部８と、計数された細胞数を記憶する記憶部９と、細胞数計数部８により計数された細胞数に基づいて培養容器２内の細胞数を算出する細胞数算出部１０とを備えている。
利用可否判定部７は、取得された画像について以下の基準の少なくとも１つについて判定するようになっている。
（１） 画像にブレがないか
（２） 画像に培養容器２のエッジが写り込んでいないか
（３） 画像に培養容器２の外部が写り込んでいないか
（４） 既に取得されている画像と同一の画像ではないか
画像にブレがある場合には、ぶれた方向に向かって略同一方向に延びる線状構造が存在する。したがって、略同一方向に延びる線状構造があるか無いかを判定することにより、ブレの有無を判定することができる。線状構造の有無は画像信号のフーリエ変換により容易に検出することができる。利用可否判定部７は、画像にブレがないと判定された場合に、利用可であると判定するようになっている。
画像に培養容器２のエッジが写り込んでいる場合には、培養容器２のエッジの直線もしくは曲線等の幾何学的でかつ細胞に比べて十分に大きな構造が特徴となる。したがって、細胞を観察できる程度に拡大した画像において、略同一方向に延びる大きな線状構造を認識することで、画像内における培養容器２のエッジの有無を判定することができる。利用可否判定部７は、画像に培養容器２のエッジが写り込んでいない場合に利用可であると判定するようになっている。
画像に培養容器２の外部が写り込んでいる場合には、培養容器２内の細胞が写っている画像に比べて構造物が極めて少ないことが特徴である。したがって、画像内の輝度値の分散を元に、培養容器２の外部の画像が写り込んでいるか否かを判定することができる。利用可否判定部７は、画像に培養容器２の外部が写り込んでいない場合に利用可であると判定するようになっている。
既に取得されている画像と同一であるか否かの判定は、記憶部９に記憶されている直前の画像の細胞数と、新たに取得された画像における細胞数とを比較し、細胞数の変動率が所定の閾値以下であれば同一箇所を撮影した画像であると判定することができる。利用可否判定部７は、既に取得されている画像と同一でない場合に利用可であると判定するようになっている。
細胞数計数部８は、利用可否判定部７により利用可であると判定された場合に、画像内の細胞を認識して、その細胞数を計数するようになっている。細胞の認識は、形状認識等任意の方法を採用することができる。記憶部９は、細胞数計数部８において計数された細胞数を積算して記憶するようになっている。
細胞数算出部１０は、細胞数計数部８により計数され記憶部９に記憶された細胞数の積算値を所定枚数Ｎの画像について平均し、算出された平均値に培養容器２の培養面２ａの有効面積と視野範囲の面積との比率を乗算することにより、培養容器２全体の細胞数を算出するようになっている。
このように構成された本実施形態に係る細胞解析装置１を用いた細胞解析方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞解析方法により、培養容器２内の細胞数を算出するには、まず、図２に示されるように、枚数ｎがリセットされ（ステップＳ１）、細胞を培養している培養容器２の培養面２ａに、細胞画像取得部３の対物レンズ５を対向させ、かつ、対物レンズ５の光軸位置を適当な位置に位置決めし（ステップＳ２）、対物レンズ５によって集光された培養面２ａからの光を光検出部６により検出して画像を取得する（撮影ステップＳ３）。
撮影ステップＳ３により、培養容器２内の一部の範囲を切り出した細胞の位相差画像が取得される。
次いで、撮影ステップＳ３により取得された画像の輝度値に基づいて、上記４つの基準の少なくとも１つについて利用可否の演算を行い（ステップＳ４）、利用可否の判定を行う（利用可否判定ステップＳ５）。
ステップＳ４において、利用可否の判定のための画像処理が行われ、利用可であるか利用不可であるかの情報が出力される。
利用可否判定ステップＳ５において利用不可であると判定された場合には、培養容器２と対物レンズ５の少なくとも一方を対物レンズ５の光軸に直交する方向に相対的に移動させて、ステップＳ２からの工程が繰り返される。
利用可否判定ステップＳ５において、利用可であると判定された場合には、画像内の細胞数の計数が行われ（細胞数計数ステップＳ６）、計数された細胞数が、それまで記憶部９に記憶されていた細胞数に加算され、積算値として記憶部９に記憶されるとともに（ステップＳ７）、枚数ｎがインクリメントされる（ステップＳ８）。
その後、所定枚数Ｎの画像について細胞数の計数が行われたか否かが判定され（ステップＳ９）、行われていない場合にはステップＳ２からの工程が繰り返される。
所定枚数Ｎの画像について細胞数が計数された場合には、細胞数算出部１０において、記憶部９に記憶された所定枚数Ｎの画像について計数された視野範囲内の細胞数の積算値が、所定枚数Ｎによって除算されることにより平均値が算出される（平均値算出ステップＳ１０）。
その後、細胞数算出部１０において、平均値算出ステップＳ１０において算出された細胞数の平均値に培養容器２の培養面２ａの有効面積と視野範囲の面積との比率を乗算することにより、培養容器２全体の細胞数が算出される（細胞数算出ステップＳ１１）。
細胞画像取得部３により取得される画像による視野範囲は予め定められており、また、培養容器２の培養面２ａにおいて実質的に細胞の培養が行われる有効培養面積も予め定められているので、有効培養面積と視野範囲の面積との比率を細胞数計数部８において計数された細胞数に乗算することにより、培養容器２内全体の細胞数を簡易かつ精度よく算出することができる。
このように、本実施形態に係る細胞解析装置１および細胞解析方法によれば、画像処理部４により、細胞数を計数する前段階において、取得された画像が細胞数を計数するのに適しているか否かを示す利用可否が判定され、利用不可と判定された画像が細胞数の計数の対象から除外されるので、計数される細胞数の精度を向上することができるという利点がある。
そして、このようにして精度よく計数された細胞数に基づいて、培養中の培養容器２内の細胞数を推定することができ、細胞を培養容器２から剥離する必要もないので、培養中の細胞にかかるストレスを軽減して、細胞を効率的に増殖させることができるという利点もある。
なお、本実施形態においては、利用可否判定部７において利用可であると判定された画像についてその都度細胞数を計数することとしたが、これに代えて、図３および図４に示されるように、取得された画像について利用可であると判定された場合に、その画像を記憶部９に記憶しておき（ステップＳ１２）、所定枚数Ｎの画像取得が行われた後に、纏めて細胞数を計数し（細胞数計数ステップＳ６）、平均値を算出する（平均値算出ステップＳ１０）ことにしてもよい。
また、記憶部９に計数された細胞数の積算値を記憶することとしたが、これに代えて、計数された細胞数を別個に記憶しておき、平均値の算出時に積算および除算処理が行われることにしてもよい。
また、本実施形態においては、所定枚数Ｎの画像が利用可であると判定されたときに、画像の取得を終了して、細胞数を算出することとしたが、これに代えて、図５に示されるように、枚数ｎをカウントすること無く、細胞数の平均値を算出（ステップＳ１０）、記憶（ステップＳ１３）するとともに、その分散を算出してもよい（ステップＳ１４）。そして、細胞数の平均値の分散が所定の閾値以下となることを条件として（ステップＳ１５）、画像の取得を終了し細胞数を算出することにしてもよい（ステップＳ１１）。細胞数の平均値の分散が所定の閾値より大きい場合には、細胞数の算出を行うことなく、ステップＳ２からの工程が繰り返される。
細胞数の平均値の分散によれば、培養容器２内を十分にサンプリングできたことをより確実に判断することができる。
また、本実施形態においては、細胞数としてコロニー数を計数することにしてもよい。
１ 細胞解析装置
２ 培養容器
３ 細胞画像取得部
７ 利用可否判定部
８ 細胞数計数部
１０ 細胞数算出部
Ｓ３ 撮影ステップ
Ｓ５ 利用可否判定ステップ
Ｓ６ 細胞数計数ステップ
Ｓ１１ 細胞数算出ステップ

Claims (8)

  1. 細胞を培養している培養容器内の細胞の画像を取得する細胞画像取得部と、
    該細胞画像取得部により取得された画像の利用可否を判定する利用可否判定部と、
    該利用可否判定部により利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数部と、
    該細胞数計数部により計数された細胞数に基づいて前記培養容器内の細胞数を算出する細胞数算出部とを備え、
    前記利用可否判定部が、前記培養容器のエッジが写り込んでいるか否かを検出し、前記培養容器のエッジが写り込んでいない場合に利用可であると判定する細胞解析装置。
  2. 細胞を培養している培養容器内の細胞の画像を取得する細胞画像取得部と、
    該細胞画像取得部により取得された画像の利用可否を判定する利用可否判定部と、
    該利用可否判定部により利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数部と、
    該細胞数計数部により計数された細胞数に基づいて前記培養容器内の細胞数を算出する細胞数算出部とを備え、
    前記利用可否判定部が、前記培養容器の外部が写り込んでいるか否かを検出し、前記培養容器の外部が写り込んでいない場合に利用可であると判定する細胞解析装置。
  3. 細胞を培養している培養容器内の細胞の画像を取得する細胞画像取得部と、
    該細胞画像取得部により取得された画像の利用可否を判定する利用可否判定部と、
    該利用可否判定部により利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数部と、
    該細胞数計数部により計数された細胞数に基づいて前記培養容器内の細胞数を算出する細胞数算出部とを備え、
    前記細胞数算出部が、複数枚の画像から計数された細胞数の平均値を用いて細胞数を算出し、
    前記利用可否判定部が、既に取得された画像と同一の画像であるか否かを検出し、同一の画像ではない場合に利用可であると判定する細胞解析装置。
  4. 前記利用可否判定部が、画像のブレを検出し、ブレが存在しない場合に利用可であると判定する請求項１から３のいずれかに記載の細胞解析装置。
  5. 細胞を培養している培養容器内の細胞の画像を取得する撮影ステップと、
    該撮影ステップにより取得された画像の利用可否を判定する利用可否判定ステップと、
    該利用可否判定ステップにより利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数ステップと、
    該細胞数計数ステップにより計数された細胞数に基づいて前記培養容器内の細胞数を算出する細胞数算出ステップとを有し、
    前記利用可否判定ステップが、前記培養容器のエッジが写り込んでいるか否かを検出し、前記培養容器のエッジが写り込んでいない場合に利用可であると判定する細胞解析方法。
  6. 細胞を培養している培養容器内の細胞の画像を取得する撮影ステップと、
    該撮影ステップにより取得された画像の利用可否を判定する利用可否判定ステップと、
    該利用可否判定ステップにより利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数ステップと、
    該細胞数計数ステップにより計数された細胞数に基づいて前記培養容器内の細胞数を算出する細胞数算出ステップとを有し、
    前記利用可否判定ステップが、前記培養容器の外部が写り込んでいるか否かを検出し、前記培養容器の外部が写り込んでいない場合に利用可であると判定する細胞解析方法。
  7. 細胞を培養している培養容器内の細胞の画像を取得する撮影ステップと、
    該撮影ステップにより取得された画像の利用可否を判定する利用可否判定ステップと、
    該利用可否判定ステップにより利用可であると判定された画像内の細胞数を計数する細胞数計数ステップと、
    該細胞数計数ステップにより計数された細胞数に基づいて前記培養容器内の細胞数を算出する細胞数算出ステップとを有し、
    前記細胞数算出ステップが、複数枚の画像から計数された細胞数の平均値を用いて細胞数を算出し、
    前記利用可否判定ステップが、既に取得された画像と同一の画像であるか否かを検出し、同一の画像ではない場合に利用可であると判定する細胞解析方法。
  8. 前記利用可否判定ステップが、画像のブレを検出し、ブレが存在しない場合に利用可であると判定する請求項５から７のいずれかに記載の細胞解析方法。
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