CN104058990B - 一种阿利克仑或其盐的分离分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用多糖衍生物键合或涂覆的硅胶为固定相，以有机溶剂为流动相，对阿利克仑及其异构体进行分离分析的方法，实现了阿利克仑和异构体之间的有效分离，对产品质量控制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过手性柱为分离载体，对阿利克仑或其盐及其异构体进行分离分析的方法。
背景技术
阿利克仑（Aliskiren）是一种作用于肾素血管紧张素醛固酮系统的肾素抑制剂。临床上，阿利克仑以半富马酸盐的形式使用，是美国FDA批准的首个直接抑制引起血压升高肾脏酶肾素的高血压治疗药。
阿利克仑的化学名称是（2S,4S,5S,7S）-5-氨基-N-（2-氨基甲酰基-2甲基丙基）-4-羟基-2-异丙基-7-[4-甲氧基-3-（3-甲氧基丙氧基）苄基]-8-甲基壬酰胺，化学结构如下式（A）所示：
(A)
由于阿利克仑的本身具有4个手性中心，合成路线复杂，通常其终产品中都含有多种杂质，存在多种非对映异构体，最终可能影响药品的质量，其中主要的几个非对映异构体分别是：
AL-E或其盐，化学名为：(2R,4R,5R,7R)-5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-E的化学结构如下式（E）所示
（E）
AL-D1或其盐，化学名为(2S,4R,5R,7R) -5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D1的化学结构如下式（D1）所示
（D1）
AL-D2或其盐，化学名为(2S,4R,5R,7R) -5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D2的化学结构如下式（D2）所示
（D2）
AL-D3或其盐，化学名为(2S,4R,5S,7S)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D3的化学结构如下式（D3）所示
（D3）
AL-D4或其盐，化学名为(2R,4S,5R,7R)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D4的化学结构如下式（D4）所示
（D4）
AL-D5或其盐，化学名为(2S,4S,5R,7S)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D5的化学结构如下式（D5）所示
（D5）
AL-D6或其盐，化学名为(2R,4R,5S,7R)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D6的化学结构如下式（D6）所示
（D6）
AL-D7或其盐，化学名为(2S,4S,5S,7R)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D7的化学结构如下式（D7）所示
（D7）
AL-D8或其盐，化学名为(2R,4R,5R,7S)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D8的化学结构如下式（D8）所示
（D8）
AL-D9或其盐，化学名为(2R,4R,5S,7S)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D9的化学结构如下式（D9）所示
（D9）
AL-D10或其盐，化学名为(2S,4S,5R,7R)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D10的化学结构如下式（D10）所示
（D10）
AL-D11或其盐，化学名为(2R,4S,5R,7S)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D11的化学结构如下式（D11）所示
（D11）
AL-D12或其盐，化学名为(2S,4R,5S,7R)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D12的化学结构如下式（D12）所示
（D12）
AL-D13或其盐，化学名为(2S,4R,5R,7S)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D13的化学结构如下式（D13）所示
（D13）
AL-D14或其盐，化学名为(2R,4S,5S,7R)- 5-氨基-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，所述的AL-D14的化学结构如下式（D14）所示
（D14）
由于上述非对映异构体和阿利克仑或其盐的结构非常相似，对各个组分进行有效的分离是非常困难的，目前尚未有文献报道任何方法对阿利克仑或其盐的终产品中的非对映异构体进行质量控制的方法，现有的分析条件也不能将阿利克仑的非对映异构体进行有效的分离，无法有效控制阿利克仑的产品质量。因此，亟需要一种有效的分离分析方法，使阿利克仑中的各个非对映异构体和阿利克仑有效分离，以达到对阿利克仑的有效质量控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种对阿利克仑或其盐及其异构体或其盐进行分离分析的方法，其特征在于，包括采用多糖衍生物键合或涂覆的硅胶为固定相，以有机溶剂为流动相进行洗脱。
所述的多糖衍生物键合或涂覆的硅胶优选三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）衍生化的多糖键合或涂覆的硅胶；更优选纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）键合或涂覆的硅胶，或直链淀粉-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）键合或涂覆的硅胶；最优选纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）键合或涂覆的硅胶。所述的固定相粒径为1.6~50um，最优选3.5或5um，更优选3.5um，内径，2.1~150mm，最优选3~4.6mm，更优选4.6mm，柱长为100~300mm，最优选150mm或250mm。本发明的方法既可以用于对阿利克仑产品进行分析，作为质量控制标准，也可以用于制备柱中，用于分离纯化阿利克伦。当用于对产品进行分析时，固定相的粒径选择较小的粒径，例如1.5-10um；当进行分离纯化时，固定相可以选择较大的粒径，例如10-50um。所述的柱长和柱内径，也可以根据分离和分析的目的不同，按照本领域常规技术手段进行选择。
所述的流动相优选含有正己烷-异丙醇的混合流动相体系，本发明在正己烷-异丙醇的混合流动相体系下，能够实现较易分离的少量异构体和阿利克仑之间的有效分离。进一步的，更优选在正己烷-异丙醇混合流动相体系的基础上添加有机胺，或添加乙醇-甲醇-有机胺的流动相体系，或添加乙醇-有机胺的流动相体系，或添加甲醇-有机胺的流动相体系。最优选为在正己烷-异丙醇混合流动相体系的基础上添加乙醇-甲醇-有机胺的流动相体系。所述的有机胺优选正丙胺。申请人研究中发现，在正己烷-异丙醇的混合流动相体系的基础上，添加乙醇-甲醇-有机胺的流动相体系，或乙醇-有机胺的流动相体系，或甲醇-有机胺的流动相体系所形成的多元流动相体系，能够使几乎所有的阿利克仑异构体之间，阿利克仑和各异构体形成良好的分离效果，实现快速有效的对产品进行控制或分离纯化的目的。
所述的正己烷-异丙醇流动相体系和乙醇-甲醇-有机胺流动相体系的用量比为100:2-100:10（v/v），优选100:5（v/v）；所述的正己烷-异丙醇流动相体系中正己烷和异丙醇的用量比为750:150-750:300（v/v），优选750:200（v/v）；所述的乙醇-甲醇-有机胺流动相体系中乙醇：甲醇：有机胺的用量比为45:2~50:0.5~5（v/v），优选45:10:2（v/v）。
所述的检测波长为280nm。
所述的洗脱包括梯度洗脱或等度洗脱。
所述的阿利克仑的盐包括有机酸盐或无机酸盐，例如盐酸盐、硫酸盐、半富马酸盐、柠檬酸盐等，优选半富马酸盐。所述的阿利克仑异构体包括AL-D1，AL-D2，AL-D3，AL-D4，AL-D5，AL-D6，AL-D7，AL-D8，AL-D9，AL-D10，AL-D11，AL-D12，AL-D13，AL-D14、AL-E中的一种或任意两种或两种以上的组合，所述的阿利克仑异构体的盐包括包括有机酸盐或无机酸盐，例如盐酸盐、硫酸盐、半富马酸盐、柠檬酸盐等，优选半富马酸盐。
进一步的，本发明提供一种对阿利克仑或其盐及其异构体进行分离分析的方法，包括下述步骤：
1）将阿立克仑或其盐配置成0.2~20mg/ml1mg/ml浓度的醇溶液作为供试品；
2）用流动相将阿利克仑的异构体或其盐配置成2~200ug/ml10μg/ml浓度的溶液作为对照品；
3）将供试品和对照品按照1:0.1~2混合为系统适应性溶液；
4）以多糖衍生物键合或涂覆的硅胶柱为固定相，取供试品和系统适应性溶液分别进样，检测波长280nm，用流动相采用梯度洗脱或等度洗脱进行分离分析。
上述方法中所述的流动相为有机溶剂，所述的流动相优选含有正己烷-异丙醇的混合流动相体系，更优选在正己烷-异丙醇混合流动相体系的基础上添加乙醇-甲醇-有机胺的流动相体系。所述的有机胺优选正丙胺。
所述的正己烷-异丙醇流动相体系和乙醇-甲醇-有机胺流动相体系的用量比为100:1-100:20（v/v），优选100:5（v/v）；所述的正己烷-异丙醇流动相体系中正己烷和异丙醇的用量比为750:150-750:300（v/v），优选750:200（v/v）；所述的乙醇-甲醇-有机胺流动相体系中乙醇：甲醇：有机胺的用量比为45:2~50:0.5~5（v/v），优选45:10:2（v/v）。
上述步骤1）中，所述的醇溶液包括低级醇溶液，例如甲醇、乙醇、异丙醇等，优选甲醇或乙醇，更优选甲醇。
所述的阿利克仑的盐包括有机酸盐或无机酸盐，例如盐酸盐、硫酸盐、半富马酸盐、柠檬酸盐等，优选半富马酸盐。
上述步骤2）中，所述的阿利克仑的异构体包括AL-D1，AL-D2，AL-D3，AL-D4，AL-D5，AL-D6，AL-D7，AL-D8，AL-D9，AL-D10，AL-D11，AL-D12，AL-D13，AL-D14、AL-E中的一种或任意两种或两种以上的组合，所述的阿利克仑异构体的盐包括包括有机酸盐或无机酸盐，例如盐酸盐、硫酸盐、半富马酸盐、柠檬酸盐等，优选半富马酸盐。
上述步骤4）中，所述的多糖衍生物键合或涂覆的硅胶优选三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）衍生化的多糖键合或涂覆的硅胶；更优选纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）键合或涂覆的硅胶，或直链淀粉-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）键合或涂覆的硅胶；最优选纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）键合或涂覆的硅胶。所述的固定相粒径为1.6~50um，最优选3.5或5um，更优选3.5um，内径，2.1~150mm，最优选3~4.6mm，更优选4.6mm，柱长为100~300mm，最优选150mm或250mm。本发明的方法既可以用于对阿利克仑产品进行分析，作为质量控制标准，也可以用于制备柱中，用于分离纯化阿利克伦。当用于对产品进行分析时，固定相的粒径选择较小的粒径，例如1.5-10um；放进行分离纯化时，固定相可以选择较大的粒径，例如10-50um。所述的柱长和柱内径，也可以根据分离和分析的目的不同，按照本领域常规技术手段进行选择。
所述的进样量根据分析和制备的不同要求，可以为1ul~2ml。
进一步的，所述的分离分析是在柱温为室温的条件下进行的。
所述的分离分析方法更进一步包括记录色谱图。
本发明解决了阿利克仑及其异构体的快速有效分离的问题，能够一次实现阿利克仑和7、8种甚至更多的异构体同时有效分离的问题。申请人研究中发现，以本发明的多糖衍生物键合或涂覆的硅胶，尤其是三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）衍生化的多糖键合或涂覆的硅胶为固定相进行分离，采用最基础的二元流动相体系，可以实现阿利克仑和异构体之间的有效分离，分离度达到1.5以上。更进一步的，采用本发明固定相，利用本发明所述的多元流动相体系，即便是当阿利克伦中含有多个异构体时，例如本发明7-8种异构体，也能实现每个异构体之间、异构体和阿立克仑之间的完全有效的分离，阿利克仑和各个异构体，以及各个异构体之间的分离度均能够达到1.5以上。对于实现阿利克仑的产品质量控制提供了重要的方法和依据，确保了阿利克仑原料和制剂的质量可控性。
本发明利克仑异构体对照品的制备方法，可以参考WO2002008172或WO2002002508中公开的阿利克仑的方法制备，通过控制原料的构型来控制最终产物的构型。例如，先制备出不同构型的如下式所示的式（I）和式（II）化合物为原料，按照WO2002008172公开的方法，合成重要中间体式（III），然后制备各阿利克仑的异构体：
本发明所述的重要异构体对照品的原料来源如下表所示：
表1阿利克仑及其异构体的合成起始物料列表
附图说明
图1 是应用本发明实施例1的方法获得的阿利克仑半富马酸盐和其非对映异构体的分离图谱。
图2 是应用本发明实施例2的方法获得的阿利克仑半富马酸盐和其非对映异构体的分离图谱。
图3是应用本发明实施例3的方法获得的阿利克仑半富马酸盐和其非对映异构体的分离图谱。
图4 是以阿利克仑为例的各手性中心的引入方法。
具体实施方式
以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中，除非另有说明，所述的试验方法具体条件通常按照常规条件或制造厂商建议的条件实施；所述的原料、试剂均通过市售购买获得；所述的百分比、比例、比率或份数等按照体积计算。所述的色谱柱，是直接购买的相应填料的色谱柱，也可以是购买填料自行填装的。
实施例1
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正己烷-异丙醇（750：200，v/v）的混合溶剂为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：10：2，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:5（v/v）进行梯度洗脱，检测波长为280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。如图1和下表所示，系统适用性溶液中，阿利克仑和各异构体，以及各异构体之间的分离度均符合要求。
实施例2
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正己烷-异丙醇（75：25，v/v）的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，检测波长为280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。如图2 所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体的分离度均符合要求。
实施例3
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正己烷-异丙醇-正丙胺（75：25：0.1（v/v））的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，检测波长为280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。如图3和下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，大部分异构体之间实现有效分离。
实施例4
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含
1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制
成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为
系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基
甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正
己烷-异丙醇-正丙胺（750：300：2（v/v））的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，检测波长为
280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，
记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，大部
分异构体之间实现有效分离。
| name | RT |
| AL-D13（半富马酸盐） | 5.186 |
| AL-D5（半富马酸盐） | 7.175 |
| AL-D10（半富马酸盐） | 8.172 |
| AL-E（半富马酸盐） | 10.567 |
| AL（半富马酸盐） | 11.911 |
| AL-D2（半富马酸盐） | 19.387 |
| AL-D7（半富马酸盐） | 25.131 |
| AL-D12（半富马酸盐） | 36.132 |
实施例5
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含
1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制
成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为
系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基
甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正
己烷-异丙醇-乙醇-正丙胺（750：225：75：2（v/v））的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，检测
波长为280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色
谱仪，记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，
大部分异构体之间实现有效分离。
| name | RT |
| AL-D13（半富马酸盐） | 4.953 |
| AL-D5（半富马酸盐） | 7.700 |
| AL-D10（半富马酸盐） | 8.539 |
| AL-E（半富马酸盐） | 10.617 |
| AL（半富马酸盐） | 11.795 |
| AL-D3（半富马酸盐） | 12.517 |
| AL-D2（半富马酸盐） | 18.938 |
| AL-D7（半富马酸盐） | 24.198 |
| AL-D12（半富马酸盐） | 32.460 |
实施例6
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含
1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制
成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为
系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基
甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正
己烷-异丙醇混合溶剂（750:150（v/v））为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：
10：2，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:2（v/v）进行梯度洗脱检测波长为
280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，
记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，大部
分异构体之间实现有效分离。
| name | RT |
| AL | 28.692 |
| AL-D2（半富马酸盐） | 52.574 |
| AL-D3（半富马酸盐） | 33.923 |
| AL-D5（半富马酸盐） | 21.426 |
| AL-D7（半富马酸盐） | 75.853 |
| AL-D10（半富马酸盐） | 24.581 |
| AL-D12（半富马酸盐） | 112.589 |
| AL-D13（半富马酸盐） | 12.342 |
| AL-E （半富马酸盐） | 26.256 |
实施例7
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正己烷-异丙醇混合溶剂（750:150（v/v））为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：10：2，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:10（v/v）进行梯度洗脱检测波长为280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，大部分异构体之间实现有效分离。
实施例8
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正己烷-异丙醇混合溶剂（750:200（v/v））为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：2：0.5，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:5（v/v）进行梯度洗脱检测波长为280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，大部分异构体之间实现有效分离。
实施例9
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含
1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制
成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为
系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基
甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正
己烷-异丙醇混合溶剂（750:200（v/v））为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：2：
5，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:5（v/v）进行梯度洗脱检测波长为
280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，
记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，大部
分异构体之间实现有效分离。
| name | RT |
| AL | 14.071 |
| AL-D2（半富马酸盐） | 24.052 |
| AL-D3（半富马酸盐） | 16.928 |
| AL-D5（半富马酸盐） | 8.789 |
| AL-D7（半富马酸盐） | 29.982 |
| AL-D10（半富马酸盐） | 9.308 |
| AL-D12（半富马酸盐） | 38.969 |
| AL-D13（半富马酸盐） | 5.827 |
| AL-E （半富马酸盐） | 12.369 |
实施例10
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含
1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制
成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为
系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基
甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正
己烷-异丙醇混合溶剂（750:200（v/v））为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：
50：0.5，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:5（v/v）进行梯度洗脱检测波长为
280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，
记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，大部
分异构体之间实现有效分离。
| name | RT |
| AL | 12.972 |
| AL-D2（半富马酸盐） | 19.287 |
| AL-D3（半富马酸盐） | 15.021 |
| AL-D5（半富马酸盐） | 7.512 |
| AL-D7（半富马酸盐） | 27.175 |
| AL-D10（半富马酸盐） | 8.123 |
| AL-D12（半富马酸盐） | 36.164 |
| AL-D13（半富马酸盐） | 4.828 |
| AL-E （半富马酸盐） | 11.565 |
实施例11
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含
1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制
成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为
系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基
甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正
己烷-异丙醇混合溶剂（750:200（v/v））为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：
50： 5，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:5（v/v）进行梯度洗脱检测波长为
280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，
记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，大部
分异构体之间实现有效分离。
| name | RT |
| AL | 12.878 |
| AL-D2（半富马酸盐） | 19.196 |
| AL-D3（半富马酸盐） | 14.989 |
| AL-D5（半富马酸盐） | 7.532 |
| AL-D7（半富马酸盐） | 27.071 |
| AL-D10（半富马酸盐） | 8.159 |
| AL-D12（半富马酸盐） | 35.998 |
| AL-D13（半富马酸盐） | 4.937 |
| AL-E （半富马酸盐） | 11.567 |
实施例12
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含
1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制
成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为
系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基
甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正
己烷-异丙醇（750：200，v/v）的混合溶剂为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：
10：2，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:2（v/v）进行梯度洗脱，检测波长为
280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，
记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，异构
体之间实现有效分离。
| name | RT |
| AL | 17.592 |
| AL-D2（半富马酸盐） | 32.577 |
| AL-D3（半富马酸盐） | 18.923 |
| AL-D5（半富马酸盐） | 8.126 |
| AL-D7（半富马酸盐） | 41.653 |
| AL-D10（半富马酸盐） | 8.686 |
| AL-D12（半富马酸盐） | 60.029 |
| AL-D13（半富马酸盐） | 7.012 |
| AL-E （半富马酸盐） | 15.916 |
实施例13
取阿利克仑半富马酸盐待检品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取阿利克仑各异构体适量，用流动相溶解稀释制成每1ml中分别含10μg的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液与对照品溶液按1:1混合为系统适用性溶液。照高效液相色谱法检测，以固定相为纤维素-三-（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）的色谱柱（购自大赛璐DAICEL OZ-H手性分析柱，粒径：5um，规格：4.6*250mm），以正己烷-异丙醇（750：200，v/v）的混合溶剂为流动相A，以乙醇-甲醇-正丙胺的混合溶剂（45：10：2，v/v/v）为流动相B，将流动相A与流动相B按照100:10（v/v）进行梯度洗脱，检测波长为280nm，柱温：室温。精密量取供试品溶液与系统适用性溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。如下表所示，系统适用性溶液中，阿利克伦和各异构体实现了有效分离，异构体之间实现有效分离。
实施例14 各异构体对照品的合成
图4详细描述了本发明各个异构体对照品中手性C的合成来源。
a、 起始物料式（I）所示的化合物的制备
（1）将ALD-01（8kg，35.36 mol）加入到二氯甲烷（35L）中，搅拌溶解，降温至0℃，氮气保护，再滴加PBr3（3.96 kg，12.37 mol），维持温度在0~5℃。TLC监测原料反应完全。将反应液缓慢加入水（3L）中，静置分层, 水层用二氯甲烷（3L）萃取，有机层用10% NaHCO3水溶液（20L）洗涤，再用水洗至中性. 无水硫酸钠干燥，旋蒸至干, 得ALD-02粗品10.9 kg，直接用于下步反应。
（2）氮气保护，将(S)-4-苯基-2恶唑烷酮（2.5Kg，15.3mol）加入到四氢呋喃中（20L），搅拌溶解，控制反应液温度在15-25℃，分批多次加入60% NaH（625g，15.6mol）。加料完全后，滴加异戊酰氯（1.9kg, 15.8mol），保持反应液温度低于30℃。滴加完全后，保温反应30min。TLC监测原料反应完全。将反应液缓慢倒入饱和NH4Cl（40L）水溶液中淬灭，并于室温搅拌反应2h，静置分层，分离出有机相，水层再用乙酸乙酯萃取（15L×2），合并有机层，旋蒸至干。向浓缩物中加入石油醚（4L），充分搅拌，抽滤，得式（I-S）所示的化合物3.41Kg。收率为90 %。
（3）将I-S（7kg，28.3 mol）加入到四氢呋喃（15L）中，搅拌溶解，降温至 -10℃。氮气保护，缓慢滴加二（三甲基硅基）氨基锂（5.2kg，31.1 mol）的四氢呋喃溶剂（26L）, 维持温度在-10℃以下。加料完全后，在-10℃继续反应1h。滴加ALD-02（8.2kg ，28.3 mol）的四氢呋喃（10 L）溶液, 加料完全后于0℃反应20 h。TLC监测原料反应完全。将反应液倒入饱和的氯化铵水溶液（10L）中淬灭，旋蒸除去四氢呋喃，残留物用乙酸乙酯（15L）萃取，旋蒸至干, 得ALD-03粗品12.84 kg，直接用于下步反应。
（4）将ALD-03粗品（12.84kg，27.3mol） 加入到四氢呋喃（30L）中，降温至0℃一下，氮气保护，滴加30% 双氧水（12.38kg，109.2mol），保持反应液温度低于0℃，滴加完全后于0℃搅拌反应30min。再缓慢滴加LiOH（2.4kg，54.6 mol）的水溶液（10L），保持反应液温度低于0℃，滴加完全后于0℃过夜反应。TLC 监测原料反应完全。将反应液缓慢加入至Na2S2O3水溶液（10L）中，搅拌反应2h，旋蒸除去四氢呋喃，用浓盐酸调节pH=2，水相用乙酸乙酯（30L）萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得ALD-04粗品 8.6 kg，直接用于下步反应。
（5）ALD-04粗品（8.6kg，27.7 mol）加入到四氢呋喃（20L）溶液中, 降温至0 ℃以下，氮气保护，分批加入NaBH4（1.9kg，50 mol），加完全后于0℃继续反应1h。再滴加BF3/THF（4.7L，37.06 mol）溶液，保持反应温度低于0℃，滴加完全后于0℃过夜反应。TLC 监测原料反应完全。将反应液加入2N HCl（2L）溶液中淬灭反应，室温搅拌反应1h。再加入水（30L）和乙酸乙酯（20L），搅拌萃取，静置分层；水相再用乙酸乙酯（20L）萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得ALD-05粗品 6.8 kg，直接用于下步反应。
（6）氮气保护，将ALD-05粗品（6.8kg, 22.96 mol）加入到甲苯（20L）中，搅拌溶解后，加入DMF（50ml），升温至90℃，滴加氯化亚砜（2.2L，29.85 mol），尾气用氢氧化钠溶液吸收，滴加完全后于90℃继续反应30 min。TLC 监测原料反应完全。将反应液缓慢加入到冰水（10L）中淬灭，于室温搅拌反应2h，静置分液，水相再用乙酸乙酯（20L）萃取，合并有机相，饱和食盐水（10L）洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后经柱层析纯化得黄色油状物，再用石油醚（20L）重结晶得式（I）所示化合物4 kg。1H-NMR（CDCl3）：0.988-1.005（6H，m），1.664-1.703（1H，m），1.870-1.920（1H，m），2.071-2.134（2H，m），2.485-2.544（1H，dd），2.718-2.765（1H，dd），3.359（3H，s），3.398-3.438（1H，dd），3.493-3.533（1H，dd），3.563-3.594（2H，t），3.841（3H，s），4.087-4.120（2H，t），6.710-6.739（2H，m），6.785-6.805（1H，m）。
b、起始物料式（I-E）所示的化合物的制备
以(R)-4-苯基-2恶唑烷酮为原料，按照上述a（1）-（6）的方法制备获得式（I-E）的化合物。1H-NMR（CDCl3）：0.977-1.006（6H，m），1.663-1.690（1H，m），1.870-1.904（1H，m），2.090-2.122（1H，m），2.485-2.544（2H，dd），2.720-2.768（1H，dd），3.361（1H，s），3.398-3.438（3H，dd），3.495-3.535（1H，dd），3.566-3.596（1H，t），3.843（2H，s），4.088-4.121（3H，t），6.712-6.739（2H，m），6.786-6.806（1H，m）
c、 起始物料式（II）所示的化合物的制备
（1）、将(E)-1,3-二氯丙烯（354g，3.20mol）加入到四氢呋喃（1.5L）溶液中，避光搅拌下加入碘化钠（595g，3.2mol），室温搅拌2h，制备的(E)-1-氯-3-碘丙烯反应液待用。将(S)-4-苯基-2恶唑烷酮（720g，2.91 mol）加入到四氢呋喃（2L）溶液中，降温至-10℃，滴加1N 二（三甲基硅基）氨基锂（486.8g，2.91mol）的四氢呋喃溶液（3L），保持反应液温度低于-10℃，滴加完毕后于-10℃反应2h，再加入上述制备的(E)-1-氯-3-碘丙烯溶液。再缓慢升温至10℃，过夜反应。TLC 监测原料反应完全。将反应液倒入饱和的NH4Cl溶液（5L）淬灭，旋蒸除去部分溶剂，浓缩物再用乙酸乙酯萃取（2L×3），合并有几相，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得1Kg棕色油状物，直接用于下步反应。
（2）、将ALB-01（2Kg，6.215 mol）加入到四氢呋喃（6L）和水（2L）的混合溶剂中，室温下滴加30%的双氧水（2.4L，25mol）溶液，保持反应液温度不超过30℃。滴加完毕后，降温至0℃一下，分批加入LiOH（522g，21.8mol），保持反应液温度不超过30℃。加料完毕后，室温反应3h。TLC 监测原料反应完全。向反应液中加入饱和NaHSO3水溶液，再加入饱和Na2CO3水溶液调节pH至9。旋蒸除去大部分溶剂，浓缩物中加入二氯甲烷萃取，水层再用2N 盐酸调节pH至9，再用二氯甲烷萃取，合并有机相，用饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得式（II-S）所示的化合物921.2g。
(3)、将式（II-S）（1140g，6.45 mol）加入到二氯甲烷（4L）中，降温至-20℃，缓慢滴加草酰氯（575 ml，6.77mol），保持反应液温度不超过0℃，并于0℃搅拌反应2h。升温至室温，再搅拌反应3h。将反应液旋蒸至干，残留物用二氯甲烷（1.5L）溶解，待用。将二甲胺盐酸盐（685g，8.4mol）加入到二氯甲烷（3L）中，降温至-10℃，滴加三乙胺（2.69L），保持反应液温度不超过0℃，加料完毕后并与0℃搅拌30min。再滴加上述制备的溶液，保持反应液温度不超过5℃。滴加完毕后，缓慢升温至室温，继续搅拌反应3h。TLC 监测原料反应完全。将反应液旋蒸至干，再用乙酸乙酯（5L）溶解，依次用蒸馏水（3L）、2N HCl溶液（4L）、饱和Na2CO3水溶液（2L）、饱和食盐水溶液（2L）洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得粗品1140g，经蒸馏纯化得式（II所）示的化合物960 g
d、起始物料式（II- E）所示的化合物的制备
以(R)-4-苯基-2恶唑烷酮为原料，按照上述c（1）-（3）的方法制备获得式（II-E）。
e、 中间体(III)的制备
(1) 、氮气保护，将镁屑（2.5g）加入到干燥的四氢呋喃（20ml）溶液中，升温至65℃，滴加1,2-二溴乙烷（0.5ml）引发反应，再滴加中间体ALD（8.3g）和1,2-二溴乙烷（0.5ml）的四氢呋喃（80ml）混合液，滴加完全后，继续回流反应2h。TLC监测原料反应完全，冷却至20℃待用。氮气保护，将中间体ALB（5g）加入到无水四氢呋喃（20ml）溶液中，再加入Fe(AcAc)3（0.25g）和NMP（0.1ml），将反应液冷却至-5℃，滴加上述制备的格式试剂，保持反应温度为0℃。滴加完全后，于0℃继续反应1h，再缓慢升温至20℃，过夜反应。TLC监测中间体ALB有少量残留。将反应液冷却至0℃，滴加饱和NH4Cl水溶液（20ml），有大量固体析出，再用2N盐酸调pH至5，旋蒸除去四氢呋喃溶液。向浓缩物中加入乙酸乙酯（50ml）萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后柱层析纯化，得6.5g中间体式（IV）所示化合物。
（2）、氮气保护，将中间体中间体式（IV）（366.0g，0.82mol）加入到四氢呋喃（5.0L）溶液中，再加入蒸馏水（44.0g）。降温至0℃，分批缓慢加入NBS（160.0g，0.90mol）和42.5%磷酸（170.0g，0.86mol）混合液，控制反应温度再0℃左右。加料完全后，于0℃-10℃搅拌反应2h。TLC显示原料反应完全。反应液用饱和亚硫酸氢钠水溶液（500mL）萃灭，将反应液旋蒸浓缩，浓缩物用乙酸乙酯萃取2次（1.0L×2），有机相用饱和食盐水（500mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后经柱层析分离，得中间体ALF粗品，再用异丙醚重结晶得中间体式（V）200g。
（3）、氮气保护，将式（V）（300.0g，0.6mol）和叠氮化钠（156.0g，2.4mol）加入到二缩三乙二醇（2.0L）和蒸馏水（500.0mL）的混合溶剂中，升温至90℃搅拌反应三天。TLC监测原料反应完全。向反应液中加入蒸馏水（2.0L）稀释，再用乙酸乙酯（2.0L）萃取2次，有机相再用饱和食盐水（500.0mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后经柱层析纯化得浅黄色油状液体，再经异丙醚（200mL）重结晶，得式（III）132g。
f、中间体(III-E)的制备
以式（I-E）和（II-E）为原料，按照e（1）-（3）所述的方法，制备中间体（III-E）所示的化合物。1H-NMR（CDCl3）：0.892-0.931（9H，m），1.003-1.021（3H，d），1.352-1.387（1H，m）1.614-1.788（3H，m），1.946-1.985（1H，m），2.019-2.154（4H，m），2.426-2.479（1H，m），2.549-2.604（2H，m），2.922-2.925（1H，dd），3.360（3H，s），3.581（2H，t），3.843（3H，s），4.102（2H，t），4.255-4.274（1H，dd），6.694-6.735（2H，m），6.788-6.808（1H，d）。
g、 中间体(III-D13)的制备
(1)、氮气保护，将中间体II-S（360g，2.04mol）加入到乙醇（1.8L）中，降温至0℃一下，滴加氯化亚砜（362g，2.69mol），保持反应液温度不超过5℃，低价完毕，缓慢升温至70℃回流反应8h。TLC监测原料反应完全。将反应液旋蒸至干，残留物用乙酸乙酯（1.5L）溶解，再用饱和碳酸钾溶液洗至弱碱性，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得产品350g。
(2)、氮气保护，将镁屑（320g）加入到干燥的四氢呋喃（100ml）溶液中，升温至65℃，滴加1,2-二溴乙烷（20ml）引发反应，再滴加中间体ALD（1.073Kg）和1,2-二溴乙烷（20ml）的四氢呋喃（2L）混合液，滴加完全后，继续回流反应2h。TLC监测原料反应完全，冷却至20℃待用。氮气保护，将中间体II-S-01（634g）加入到无水四氢呋喃（1L）溶液中，再加入Fe(AcAc)3（35g）和NMP（15ml），将反应液冷却至-5℃，滴加上述制备的格式试剂，保持反应温度为0℃。滴加完全后，于0℃继续反应1h，再缓慢升温至20℃，过夜反应。TLC监测中间体ALB有少量残留。将反应液冷却至0℃，滴加饱和NH4Cl水溶液（50ml），有大量固体析出，再用2N盐酸调pH至5，旋蒸除去四氢呋喃溶液。向浓缩物中加入乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后柱层析纯化，得1Kg中间体IV-D13-S产品。
(3)、将IV-D13-S（1Kg，2.23mol）加入到乙醇（4L）和水（4L）的混合溶剂中，再加入LiOH·H2O（168g，8.92mol），升温至回流，搅拌反应48h。TLC监测原料反应完全。将反应液旋蒸浓缩除去大部分乙醇，再向浓缩物中加入蒸馏水稀释（3L），用石油醚（5L×4）洗涤水层除去杂质，水层再用浓盐酸（1.2L）调节pH至酸性，用乙酸乙酯（4L×2）萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后得V-D13-S产品790g。
（4）、氮气保护，将V-D13-S（790g，1.878mol）加入到二氯甲烷（8L）中，降温至0℃，缓慢低级NBS（368g，2.07mol），保持反应液温度低于0℃，滴加完毕后，于0-10℃搅拌2h。TLC监测原料反应完全。将反应液旋蒸至干，残留物用乙酸乙酯（5L）溶解，用饱和NaHCO3水溶液（3L）洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后经柱层析纯化得III-D13产品470g。1H-NMR（CDCl3）：0.864-0.930（6H，m），0.981-1.030（6H，m），1.200-1.235（1H，t），1.465-4.528（2H，m），1.747-1.837（3H，m），2.015-2.119（3H，m），2.168-2.249（1H，m），2.523-2.555（1H，m），2.703-2.750（1H，dd），3.155-3.177（1H，m），3.432（3H，s），3.562（2H，t），3.823（3H，s），4.085（2H，t），4.205-4.230（1H，m），6.661-6.694（2H，m），6.764-6.784（1H，d）。。
h、中间体(III-D02)的制备
以式（I-E）和（II-S）为原料，按照g（1）-（4）所述的方法，制备中间体（III-D13）所示的化合物。1H-NMR（CDCl3）：0.862-0.915（9H，m），0.956-0.7-973（3H，d），1.210-1.284（1H，m），1.588-1.696（3H，m），1.727-1.837（2H，m），2.037-2.128（3H，m），2.164-2.211（1H，m），2.421-2.475（1H，dd），2.526-2.620（1H，dd），2.851-2.899（1H，m），3.350（3H，s），3.570（2H，t），3.826（3H，s），4.128-4.183（1H），4.128-4.183（1H，m），6.690-6.730（2H，m），6.771-6.791（1H，d）。
i、中间体(III-D05)的制备
(1)、将III-D13(50g，0.11mol)加入到甲醇(250ml，5V/w)中，搅拌中加入蒸馏水(250ml，5V/w)，降温至0-5℃，再加入LiOH·H2O(10g，0.22mol)，加料完全后缓慢升温至25℃，继续搅拌4.0h。TLC监测反应，原料反应完全后，无需处理，反应液直接用于下步反应。
（2）、将上步反应液降温到-10℃，加入柠檬酸调节反应液pH至5~6，再慢慢滴加新制备的重氮甲烷乙醚溶液，加料完全后，与-10℃反应30min，TLC监测显示原料消失。反应液用冰醋酸淬灭后，用饱和NaHCO3水溶液调节反应液pH至弱碱性，旋蒸浓缩除去大部分甲醇，浓缩液再用乙酸乙酯萃取2次（400ml×2），合并有机相，饱和食盐水洗涤1次（400ml×1），无水硫酸钠干燥，柱层析纯化后，得III-D05-02产品45g。
(3)、氮气保护下将III-D05-02（45g，0.09mol）和PBAN（26g，0.135mol）加入到干燥四氢呋喃（450ml，10V/w）中，降温至0℃，加入三苯基磷（41g，0.135mol），再滴加DIAD（32g，0.135mol），滴加完全后缓慢升温至25℃，搅拌反应5h。TLC显示少部分原料未能反应完。将反应液旋蒸至干，加入乙酸乙酯溶解，再用饱和NaHCO3溶液洗涤（500ml），无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后经柱层析纯化得III-D05-03产品53g。
（4）、将III-D05-03（53g，0.08mol）和LiOH·H2O（14g，0.32mol）加入到甲醇（250ml，5V/w）中，搅拌下加入蒸馏水（250ml，5V/w），于20℃搅拌6h。TLC监测原料反应完全，旋蒸浓缩除去大部分甲醇，再加入蒸馏水（200ml）稀释反应液后，用异丙醚（500ml×4）萃取除去部分杂质，水层再用乙酸乙酯萃取两次（500ml×2），合并有几层，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干的III-D05-04产品40g，直接用于下步反应。 (5)、将III-D05-04（40g，0.08mol）加入到1N盐酸乙酸乙酯（200mL，5V/w）溶液中，室温搅拌5h。TLC监测原料反应完全，将反应液倒入饱和K2CO3冰水溶液（200ml）中，萃取分液，水相再用乙酸乙酯（200ml）萃取1次，合并有机相，用饱和食盐水溶液（300ml）洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后得III-D05 20g。1H-NMR（CDCl3）：0.873-0.940（6H，m），0.981-1.042（6H，m），1.430-1.461（2H，m），1.739-1.755（1H，m），1.819-1.827（1H，m），1.963-1.982（1H，m），2.002-2.154（4H，m），2.247-2.305（1H，m），2.615（1H，m），2.696-2.731（1H，m），3.359（3H，s），3.518-3.541（1H，m），3.564-3.595（2H，t），3.846（3H，s），4.090-4.122（2H，t），4.276-4.307（1H，m），6.681-6.711（2H，m），6.791-6.811（1H，d）。
j、 中间体（III-D07）的制备
以式（I-E）和（II）为原料，按照e（1）-（3）所述的方法，制备中间体（III-D07）化合物。1H-NMR（CDCl3）：0.891-0.916（6H，m），0.987-1.011（6H，m），1.241-1.277（1H，t），1.513-1.532（1H，m），1.615-1.631（1H，m），1.828（1H，m），1.949-2.031（2H，m），2.090-2.145（3H，m），2.246-2.304（1H，dd），2.629-2.641（1H，m），2.704-2.751（1H，dd），3.110-3.124（1H，dd），3.360（3H，s），3.579（2H，t），3.844（3H，s），4.107（2H，t），4.319-4.338（1H，m），6.686-6.713（2H，m），6.788-6.808（1H，d）。
k、中间体(III-D03)的制备
以式（III）为原料，按照i（1）-（5）所述的方法，制备中间体（III-D03）所示的化合物。1H-NMR（CDCl3）： 0.887-0.909（9H，m），0.994-1.011（3H，d），1.352-1.405（2H，m），1.712-1.798（2H，m），1.888-1.927（3H，m），2.032-2.121（1H，m），2.160-2.174（1H，m），2.365-3.343（4H，m），2.475-2.518（1H，m），2.577-2.626（1H，m），3.316-3.578（4H，m），3.548-3.578（2H，t），3.819（3H，s），4.068-4.101（2H，t），4.114-4.152（1H，dd），6.685-6.712（2H，m），6.767-6.787（1H，d）。
l、 中间体（III-D10）的制备
以式（III-D02）为原料，按照i（1）-（5）所述的方法，制备中间体（III-D03）所示的化合物。1H-NMR（CDCl3）： 0.862-0.915（9H，m），0.956-0.973（3H，d），1.3370-1.432（2H，m），1.716-1.820（3H，m），1.912-1.937（1H，m），2.067-2.114（3H，m），2.332-2.387（1H，dd），2.471-2.496（1H，m），2.586-2.635（1H，dd），3.190-3.214（1H，m），3.334（3H，s），3.553（2H，t），3.817（3H，s），4.073（2H，t），4.143-4.164（1H，m），6.666-6.704（2H，m），6.762-6.782（1H，d）。
m、 中间体（III-D12）的制备
以式（III-D07）为原料，按照i（1）-（5）所述的方法，制备中间体（III-D13）所示的化合物。1H-NMR（CDCl3）：0.864-0.930（6H，m），0.981-1.032（6H，m），1.230-1.329（2H，m），1.442-1.461（1H，m），1.800-1.865（2H，m），2.033-2.126（3H，m），2.182-2.196（1H，m），2.250-2.308（1H，dd），2.544-2.556（1H，m），2.672-2.720（1H，d），3.347（3H，s），3.554-3.614（3H，s），3.833（3H，s），4.081-4.114（2H，t），4.206-4.231（1H，m），6.671-6.705（2H，m），6.778-6.798（1H，d）。
n、 异构体对照品AL-E的制备
(1)、氮气保护，将III-E（4.5g，0.01mol）、中间体X（5.6g，0.05mol）加入到三乙胺（5ml，1V/w）中，再加入2-羟基吡啶（1.0g，0.01mol），搅拌混匀后升温至100℃回流反应24h。TLC监测原料反应完全。将反应液降温至室温，加入乙酸乙酯（30ml）溶解，依次用饱和柠檬酸水溶液（20ml）、饱和NaHCO3水溶液（20ml）和饱和食盐水溶液（10ml）各洗涤1次，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸至干后再经柱层析纯化得IV-E为油状物4g。
（2）、将IV-E（4g）加入到甲醇（40ml）中，再加入湿的10%Pd/C（0.4g），通氢气，氢化反应釜压力为15 psi，室温反应过夜反应。TLC监测原料反应完全。抽滤，收集滤液，旋蒸至干后经柱层析纯化得无色油状物AL-E 3.2g。1H-NMR（CDCl3）：0.817-0.838（6H，m），0.895-0.911（6H，m），1.045-1.112（7H，m），1.134-1.297（2H，m），1.559-1.642（3H，m），1.698-1.749（1H，m），1.938（1H，s），1.958-2.021（2H，m），2.062-2.106（1H，t），2.254（1H，m），2.359-2.376（1H，dd），2.963-3.002（1H，m），3.252（3H，s），3.287-3.302（2H，d），3.474（2H，t），3.725（3H，s），3.976-4.018（3H，m），6.551-6.609（4H，m），6.666-6.686（1H，d），6.856-6.885（1H，t）。
（3）、将AL-E（3.2g，5.8mmol）和富马酸（0.34g，2.9mmol）加入到乙醇（10ml）中，溶解后于40℃搅拌1h，趁热抽滤，滤液旋蒸至干。将异丙醇加入到残留物中，加热至溶解。缓慢降温至0-5℃，冷却析晶，抽滤，滤饼用少量异丙醇洗涤2次，得AL-E的半富马酸盐白色固体1.84g。
o、异构体对照品AL-D02的制备
以中间体III-D02为原料，按照n（1）-(2)所述的方法制备AL-D02。1H-NMR（CDCl3）：0.868-0.910（12H，m），1.201（6H，s），1.527-1.560（2H，m），1.588-1.696（1H，m），1.644-1.724（4H，m），1.813-1.863（1H，m），2.001-2.112（3H，m），2.456-2.473（3H，m），3.191-3.212（1H，m），3.245-3.295（1H，dd），3.343（3H，s），3.414-3.466（1H，dd），3.550-3.581（2H，t），3.816（3H，s），4.064-4.116（2H，t），6.642（1H，s），6.479（1H，s），6.642-6.712（2H，m），6.754-6.774（1H，d）。
进一步，按照n（3）的方法制备AL-D02的半富马酸盐。
p、异构体对照品AL-D03的制备
以中间体III-D03为原料，按照n（1）-(2)所述的方法制备AL-D03。1H-NMR（CDCl3）：0.843（12H，m），0.985（6H，s），1.375-1.411（2H，m），1.673-1.898（4H，m），2.055（2H，m），2.070-2.116（2H，m），2.413-2.502（2H，m），2.880（1H，m），3.118-3.162（1H，dd），3.352（4H，m），3.459（3H，m），3.678-3.731（2H，t），3.823（3H，s），4.075-4.106（2H，t），6.324（1H，s），6.663-6.827（5H，m）。
进一步，按照n（3）的方法制备AL-D03的半富马酸盐。
q、异构体对照品AL-D05的制备
以中间体III-D05为原料，按照n（1）-(2)所述的方法制备AL-D05。1H-NMR（CDCl3）：0.825-0.961（12H，m），1.036（1H，m），1.182（6H，s），1.382-1.416（2H，m），1.533-1.565（2H，m），1.759-1.797（2H，m），2.016-2.182（4H，m），2.607-2.676（2H，m），3.308-3.319（2H，m），3.338（3H，s），3.393-3.428（3H，m），3.543-3.574（2H，t），3.815（3H，s），4.061-4.093（2H，t），6.030（1H，s），6.340（1H，s），6.629-6.681（3H，m），6.753-6.773（1H，d）。
进一步，按照n（3）的方法制备AL-D05的半富马酸盐。
r、异构体对照品AL-D07的制备
以中间体III-D07为原料，按照n（1）-(2)所述的方法制备AL-D07。1H-NMR（CDCl3）：0.825-0.998（12H，m），1.156-1.256（7H，s），1.417-1.504（2H，m），1.609-1.618（1H，m），1.702-1.829（3H，m），2.074-2.179（4H，m），2.462-2.494（1H，m），2.648-2.692（2H，dd），3.029-3.069（1H，m），3.280-3.329（1H，dd），3.354（3H，s），3.412-3.462（3H，m），3.563-3.593（2H，t），3.828（3H，s），4.080-4.112（2H，t），6.056（1H，s），6.364（1H，s），6.669-6.692（2H，m），6.773-6.793（1H，d）。
进一步，按照n（3）的方法制备AL-D07的半富马酸盐。
s、 异构体对照品AL-D10的制备
以中间体III-D10为原料，按照n（1）-(2)所述的方法制备AL-D10。1H-NMR（CDCl3）：0.804-0.913（12H，m），1.220-1.244（6H，m），1.366-1.474（3H，m），1.678-1.727（2H，m），1.789-1.859（2H，m），2.061-2.123（3H，m），2.171（1H，s），2.415-2.470（2H，m），2.691-2.712（1H，m），3.132-3.383（5H，m），3.448-3.481（1H，m），3.558-3.588（2H，t），3.828（3H，s）4.081-4.113（2H，t），5.676（1H，s），6.365（1H，s），6.437-6.453（1H，t），6.685-6.724（2H，m），6.763-6.783（1H，d）。
进一步，按照n（3）的方法制备AL-D10的半富马酸盐。
t、异构体对照品AL-D12的制备
以中间体III-D12为原料，按照n（1）-(2)所述的方法制备AL-D12。1H-NMR（CDCl3）：0.777-0.855（12H，m），1.086-1.202（6H，m），1.487-1.502（3H，m），1.726（2H，m），1.889-1.943（2H，m），2.002（3H，m），2.203（1H，s），2.368-2.472（2H，m），3.030（1H，m），3.271-3.298（5H，m），3.498（1H，m），3.532-3.597（2H，t），3.733（3H，s），4.003（2H，t），5.693（1H，s），6.395（1H，s），6.509-6.523（1H，t），6.693-6.724（2H，m），6.870-6.853（1H，d）。
进一步，按照n（3）的方法制备AL-D12的半富马酸盐。
u、 异构体对照品AL-D13的制备
以中间体III-D13为原料，按照n（1）-(2)所述的方法制备AL-D13。1H-NMR（CDCl3）：0.827-0.900（12H，m），1.000（7H，m），1.424-1.458（2H，m），1.581-1.704（4H，m），1.999-2.030（3H，m），2.125-2.179（1H，m），2.518-2.597（2H，m），3.163（2H，m），3.278（3H，s），3.309（3H，m），3.448-3.503（2H，t），3.749（3H，s），3.997-4.027（2H，t），6.437（1H，s），6.605-6.716（4H，m），7.007（1H，s）。
进一步，按照n（3）的方法制备AL-D13的半富马酸盐。
Claims (7)
1.一种对阿利克仑或其盐及其异构体或其盐进行分离分析的方法，包括采用多糖衍生物键合或涂覆的硅胶为固定相，以有机溶剂为流动相进行洗脱，其特征在于，所述的多糖衍生物键合或涂覆的硅胶是纤维素-三-(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)键合或涂覆的硅胶，所述的流动相为含有正己烷-异丙醇的混合流动相体系；所述阿利克仑盐为其盐酸盐、硫酸盐、半富马酸盐或柠檬酸盐；所述阿利克仑异构体盐为其盐酸盐、硫酸盐、半富马酸盐或柠檬酸盐；所述阿利克仑异构体是指以下化合物AL-D1，AL-D2，AL-D3，AL-D4，AL-D5，AL-D6，AL-D7，AL-D8，AL-D9，AL-D10，AL-D11，AL-D12，AL-D13，AL-D14、AL-E或其任意两种或两种以上的混合物：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相为在正己烷-异丙醇混合流动相体系的基础上添加有机胺获得的流动相，或添加乙醇-甲醇-有机胺的流动相体系获得的流动相，或添加乙醇-有机胺的流动相体系获得的流动相，或添加甲醇-有机胺的流动相体系获得的流动相。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的流动相为在正己烷-异丙醇混合流动相体系的基础上添加乙醇-甲醇-有机胺的流动相体系获得的流动相。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的正己烷-异丙醇流动相体系和乙醇-甲醇-有机胺流动相体系的用量比为100:2-100:10(v/v)；所述的正己烷-异丙醇流动相体系中正己烷和异丙醇的用量比为750:150-750:300(v/v)；所述的乙醇-甲醇-有机胺流动相体系中乙醇：甲醇：有机胺的用量比为45:2～50:0.5～5(v/v)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的正己烷-异丙醇流动相体系和乙醇-甲醇-有机胺流动相体系的用量比为100:5(v/v)；所述的正己烷-异丙醇流动相体系中正己烷和异丙醇的用量比为750:200(v/v)；所述的乙醇-甲醇-有机胺流动相体系中乙醇：甲醇：有机胺的用量比为45:10:2(v/v)。
6.一种对阿利克仑或其盐及其异构体进行分离分析的方法，包括下述步骤：
将阿立克仑或其盐配置成0.2～20mg/ml浓度的醇溶液作为供试品；
用流动相将阿利克仑的异构体或其盐配置成2～200μg/ml浓度的溶液作为对照品；
将供试品和对照品按照1:0.1～2混合为系统适应性溶液；
以多糖衍生物键合或涂覆的硅胶柱为固定相，取供试品和系统适应性溶液分别进样，检测波长280nm，用流动相采用梯度洗脱或等度洗脱进行分离分析其特征在于，所述的多糖衍生物键合或涂覆的硅胶是三-(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)衍生化的多糖键合或涂覆的硅胶，所述的流动相为含有正己烷-异丙醇的混合流动相体系；其中所述阿利克仑的异构体是指化合物AL-D1，AL-D2，AL-D3，AL-D4，AL-D5，AL-D6，AL-D7，AL-D8，AL-D9，AL-D10，AL-D11，AL-D12，AL-D13，AL-D14、AL-E或其任意两种或两种以上的混合物；其中所述阿利克仑的盐为其盐酸盐、硫酸盐、半富马酸盐或柠檬酸盐。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，将阿立克仑或其盐配置成1mg/ml浓度的醇溶液作为供试品；用流动相将阿利克仑的异构体或其盐配置成10μg/ml浓度的溶液作为对照品。
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