CN104055755A

CN104055755A - 2′,4′-二羟基-6′-甲氧基-3′,5′-二甲基查耳酮在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN104055755A
Application number: CN201310097285.0A
Authority: CN
Inventors: 叶春林; 刘宣淦; 黄琦; 赖依峰
Original assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Priority date: 2013-03-19
Filing date: 2013-03-19
Publication date: 2014-09-24

Abstract

本发明公开了2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮在制备诱导肿瘤凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。本发明发现了2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮具有广谱抗肿瘤活性，体外对多种肿瘤细胞均有强烈的抑制效果。该化合物具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而对人正常细胞无损害的作用特性，对Bcl-2蛋白表达有明显影响。该化合物具有制备诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖药物的应用前景。

Description

2′,4′-二羟基-6′-甲氧基-3′,5′-二甲基查耳酮在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其涉及在制备诱导肿瘤凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是目前危害人类健康的三大疾病之一，自20世纪下半叶以来，世界癌症发病率与死亡率均呈现上升趋势。人类已开发出众多毒杀细胞的药物，并已在肿瘤的化疗中发挥了重要作用，但这类药物对细胞缺乏选择性，杀伤肿瘤细胞的同时也伤害正常细胞，毒副作用大。目前大多数人认为，肿瘤是一种细胞凋亡过少而增殖过多的疾病，若能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，则能有效地抑制肿瘤的进程，比直接杀伤肿瘤的细胞毒性化疗药物治疗有明显优势。因此，基于细胞凋亡机制的抗肿瘤药物的研发是近年来发现新型抗肿瘤药物的重要策略。我们经过多年研究发现中药材水翁花有良好的抗肿瘤作用，其中的主要成分2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖作用尤为显著，且对人体正常细胞基本无伤害。

本发明所述的2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮(2′，4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′，5′-dimethylchalcone，DMC)，分子式为C₁₈H₁₈O₄，其结构通式为：

该化合物的制备方法为：水翁干燥花蕾4kg，在室温下用70％甲醇(10L)浸泡提取三次，合并提取液，减压回收甲醇，得浸膏，将浸膏用水悬浮，依次以石油醚萃取多次，合并萃取液，减压回收，得到石油醚部位(18.4g)。石油醚部位经硅胶(200-300mesh)柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯(40∶1-5∶1)梯度洗脱，得到20个流份(Fr.1-Fr.20)。F r.14经葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱纯化，甲醇洗脱，收集到6个流分(Fr.A₃-F₃)。Fr.E₃通过重结晶得到化合物2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其涉及在制备诱导肿瘤凋亡和/或抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。

本发明所制备的2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮药物，可在制备治疗白血病、肝癌、胰腺癌、宫颈癌等药物中的应用。

本发明的2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二二甲基查耳酮可以和药学上允许的任意一种辅料或药物赋形剂制成药物，其制剂可以是药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、缓释剂、滴丸或注射剂。

本发明提供的药物，其给药形式主要包括口服给药或注射给药。

本发明的有益效果：

(1)2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮对凋亡相关蛋白有明显影响，能诱导细胞凋亡。

(2)2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二二甲基查耳酮对肿瘤细胞的抑制作用有较好的选择性。

(3)2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮对人体正常细胞安全、低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤药物。

附图说明

图1DMC对肿瘤细胞及正常细胞的增殖抑制率。

图2DMC诱导肝癌SMMC-7721细胞产生凋亡的Annexin V-PI双染流式图

图3DMC诱导肝癌SMMC-7721细胞产生凋亡的罗丹明123染色流式图

图4DMC对SMMC-7721细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响

图5DMC对K562细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响

具体实施方式

以下将结合具体实施例和附图对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1DMC对人肿瘤细胞及正常细胞的增殖抑制活性试验

肝癌细胞SMMC-7721、白血病细胞K562、胰腺癌细胞8898均购自中国科学研究院上海细胞库，细胞置5％CO2培养箱，37℃培养。培养基为RPMI1640，添加10％的小牛血清。人的正常胚胎肝细胞L-02购自中国科学研究院上海细胞库，细胞置5％CO₂培养箱，37℃培养，培养基为RPMI1640，添加15％的小牛血清。宫颈癌细胞HeLa、人的正常肺腺细胞HFL-1均购自中国科学研究院上海细胞库，细胞置5％CO₂培养箱，37℃培养。培养基为DMEM，添加10％的小牛血清。

四甲基偶氮唑盐(简称MTT法)检测药物对肿瘤细胞及正常细胞的增殖的影响：取对数生长期SMMC-7721、K562、8898、HeLa、HFL-1和L-02细胞10⁴cells/well接种于96孔培养板，每孔0.2ml，待细胞培养24小时后，分别加入一定浓度的药物处理，每浓度平行3孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱培养2天，实验终止前4小时每孔加入5mg/ml MTT10μl，培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)，每孔 150μl，振荡10min，使MTT还原产物完全溶解，用BioRad550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，分别计算DMC对各种细胞的半数增殖抑制浓度IC₅₀。

附图1a结果显示经DMC处理48h后，K562、SMMC-7721、8898和HeLa肿瘤细胞的IC₅₀值分别为14.2±0.45、32.3±1.13、37.2±2.15和37.7±1.64μM，表明DMC可以在制备治疗上述恶性肿瘤中应用。对人的正常胚胎肝细胞L-02和人的正常肺腺细胞HFL-1的IC₅₀值分别为111.0±4.57和152.0±4.83μM(附图1b)，表明DMC对正常细胞的毒性小，可以在临床上应用。

实施例2DMC诱导肝癌细胞SMMC-7721产生凋亡

(1)Annexin V-PI双染实验：约1×10⁶个对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721与DMC共同孵育48h，胰酶消化收集细胞，PBS清洗二次，加入300μL的结合缓冲液悬浮细胞，加入5μLAnnexinV-FITC混匀后，加入5μLPI混匀，室温、避光、反应15min，用FC500MCL流式细胞仪(Beckman Coulter)分析结果。

在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧，AnnexinV可与其结合，而凋亡细胞的细胞膜仍然保持完整，染料PI不能进入细胞进行染色，因此可通过Annexin V-PI双染实验，区分凋亡与坏死细胞。附图2中SMMC-7721细胞的4个不同DMC浓度0、6.25μM、12.5μM和25μM处理。每张图的右下角百分数表示该细胞在对应药物浓度下的凋亡百分数。从图中可以看到，DMC可以诱导SMMC-7721细胞产生凋亡，并且这种作用呈现了剂量依赖性。图中清晰地表明随着DMC浓度从0增加到25μM，SMMC-7721凋亡百分率上升至61.32％。

(2)罗丹明123(Rhodamine123，Rh123)染色实验：取对数生长的SMMC-7721细胞，按大约1×10⁶个细胞/孔接种于6孔培养板，待细胞培养24小时后，加入DMC终浓度分别为0、6.25μM、12.5μM和25μM作用48h，每孔加入Rh123使其终浓度为10μg/mL，37℃染色30min，1000r/min离心5min，收集细胞，用PBS洗一次，1000r/min离心5min，重悬于300μL PBS中，用FC500MCL流式细胞仪(Beckman Coulter)检测平均荧光强度，以阳性细胞的平均荧光强度表示ΔΨm。

罗丹明123(Rhodamine123，Rh123)是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，可通过借助线粒体跨膜电位ΔΨm进入线粒体对活细胞线粒体选择性着色，当细胞发生凋亡时，使ΔΨm下降，进入到线粒体内的荧光染料会相应减少，故检测到的荧光强度比未发生凋亡的正常细胞要弱。DMC浓度分别为6.25μM、12.5μM和25μM作用于SMMC-7721细胞48h后，细胞内的ΔΨm峰值下降到56.8％、44.7％、31.9％，与对照组(100％)比较，罗丹明在细胞中的平均荧光度均明显减少。

实施例3Western Blot检测DMC对SMMC-7721细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

Western Blot检测DMC浓度分别为3.125μM、6.25μM、12.5μM和25μM作用于SMMC-7721细胞48h后，与未加任何药物的对照组相比较，DMC能够剂量依赖性降低SMMC-7721细胞株Bcl-2蛋白表达水平，而Bax蛋白的表达水平未发生明显的变化，其结果使Bcl-2/Bax的比值降低，从而诱导细胞的凋亡(附图4)。

实施例4Western Blot检测DMC对K562细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

Western Blot检测DMC浓度分别为2μM、4μM、8μM和16μM作用于K562细胞48h后，与未加任何药物的对照组相比较，DMC能够剂量依赖性降低K562细胞株Bcl-2蛋白表达水平，而Bax蛋白的表达水平未发生明显的变化，其结果使Bcl-2/Bax的比值降低，从而诱导细胞的凋亡。结果见附图5。

综上实施例所述，本发明提供的2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮(DMC)对肝癌SMMC-7721细胞、白血病K562细胞、胰腺癌8898细胞、宫颈癌HeLa细胞均具有强烈的增殖抑制效果，并且DMC能诱导肝癌SMMC-7721细胞和白血病K562细胞凋亡。DMC对正常细胞的毒性小，有利于临床应用。目前临床上缺乏高效低毒的药物，因此，2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮具有很好的制备抗肿瘤药物的应用前景。

Claims

1.2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为肝癌、白血病、胰腺癌或宫颈癌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物，其制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、缓释剂、滴丸或注射剂。