CN104004725A - 一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用 - Google Patents

一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104004725A
CN104004725A CN201410258209.8A CN201410258209A CN104004725A CN 104004725 A CN104004725 A CN 104004725A CN 201410258209 A CN201410258209 A CN 201410258209A CN 104004725 A CN104004725 A CN 104004725A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tannase
tanxz7
neutral
low temperature
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410258209.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104004725B (zh
Inventor
姚斌
马锐
张三燕
石鹏君
黄火清
柏映国
罗会颖
王亚茹
杨培龙
孟昆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201410258209.8A priority Critical patent/CN104004725B/zh
Publication of CN104004725A publication Critical patent/CN104004725A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104004725B publication Critical patent/CN104004725B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/0102—Tannase (3.1.1.20)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用，其氨基酸碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的单宁酶TanXZ7最适pH为6.0，在pH3.0～8.0稳定性较好；最适温度为40℃,在25-60℃范围内具有较高的酶活力，且在40℃稳定性好；其中低温中性特性，可使其在食品工业生产上应用。

Description

一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用。
背景技术
单宁广泛分布于植物体内，包括根，木材，树皮，水果和叶部。作为植物体内的主要次级代谢产物，单宁的含量仅低于纤维素，半纤维素和木质素。根据其化学结构，可分为可水解的桔酸单宁和鞣花单宁和相对稳定的由聚黄烷醇类多酚或原花色素(即羟基黄烷醇类单体)组成的缩合鞣质单宁。单宁含有大量的苯环和酚羟基，易与金属鏊和，形成更大的多聚体，且可与多糖和蛋白结合产生收敛和沉降的效果。
在食品和动物饲料方面，单宁是抗营养因子之一，可以引起茶，饮料，咖啡，酒水等的混浊。而含有单宁的工业废水也难以降解，导致水质富营养化从而严重破坏生态环境。而另一方面，作为单宁主要水解产物的没食子酸是一种附加值高，市场前景广阔的医药原料，具有抗癌和抗生素的活性。因此对单宁的有效利用和深层开发已成为目前国内外的研究热点。
单宁酶的研究始于1780年，主要来源于植物、动物和微生物。植物来源的单宁酶可以从含单宁丰富的水果、叶子、枝干和树皮中获得；动物来源的单宁酶可以从动物肠道和瘤胃粘液中提取；微生物来源的单宁酶主要是从细菌和真菌中获得。由于单宁酶的广泛应用潜力，在动物饲料中可以有效破坏单宁-多糖/蛋白质大分子复合物中的共价交联，降低食糜的粘度，改善饲料性能，降低因粘度增加而引起的抗营养作用；在食品方面起到澄清和改善风味的效果；是抗癌药物和抗生素的主要成份；同时可以改善废水中单宁的有效降解，因此越来越受到人们的关注。微生物来源的单宁酶有很长的研究历史，但进展缓慢，目前已报道了58株可以产单宁酶的真菌/细菌，25个单宁酶做过性质研究，只有3个单宁酶实现了异源表达，1个完成了结构解析。单宁酶的最适pH值在偏酸和中性范围内，极少数细菌单宁酶在碱性条件下有活性，最适温度在20-60℃之间。
食品生产过程中为了不破坏营养，需在中低温中性条件下利用单宁酶处理，破坏单宁的酯键，从而澄清果汁饮料和茶饮品等。因此，所需的单宁酶需要在中性pH和中温条件下具有高活性。本发明中TanXZ7最适pH6.0,在pH5.0–7.0之间有60％以上的酶活力；最适温度40℃，在25-60℃具有80％以上的酶活力。该酶具有在低温条件下高活力的特点，符合在食品工业中尤其果汁饮料和茶饮品低温处理的工业要求。另外，在饲料、医药和废水处理等领域具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种中低温中性单宁酶。
本发明的再一目的是提供编码上述中低温中性单宁酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述中低温中性单宁酶的基因工程方法。
本发明从梭孢菌(Thielavia subthermophila XZ7)中分离得到一种新的中低温中性单宁酶TanXZ7。
本发明提供了一种中低温中性单宁酶TanXZ7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MPSWLKLTAKALSLSDVCTVSNVQAALPSNGTLLGLNLIPSSVTATMTNSSTSGGMGGGMPMMKRQSSSTQYCAVTVTYTHPGQGDEVNLKYAFPSPSEFKNRFYVGGGGGFSLSSSATGGLSYGAAGGATDAGYDAFDQSYDQVVLYGNGSINWYATHMFGYQALGEMTKIGKYITKGFYGLSNDTKVYTYFEGCSDGGREGMSQVQRWGDEYDGVIAGAPAFRFAQQQVHHVFSSAVEKTLGYLPPPCELDTIVNATIKGCDKLDGREDGVISRTDLCKLNFNMKSIIGQSYYCAEKNSTSLGFGFQKRQQTSGSTTSYQPAQKGTVTKEGVAVAQAIYDGLHNTAGERAYLSWQIGSQLSDANPTYSSESGEWEPNIPSTGGEYVTKFIQLLDLDNLSDLDGVTYDTLVEWMTIGMYRYLDSLQTTLPDLTTFKSSGGKLLHYHGESDPSIPSASSVHYWQSVRSVMYPDVADDKALKDMAKWYQFYLVPGAGHCGSNSLQPGPYPQNNMDIMIDWVENGVQPTRLNATVSSGDYSGETQMLCQWPTRPLWKKANSFECMTDKKSIEAWTYDFPAFKVPVY
其中，该酶包括584个氨基酸，N端无信号肽序列。因此，成熟的中低温中性单宁酶TanXZ7的理论分子量为66.4kDa。
本发明的单宁酶TanXZ7同时具有好的酸碱低高温适应性而在常温下在酸性的范围内均具有高活性等特性。本发明的单宁酶，其最适pH值为6.0，在pH3.0-8.0的范围内稳定；最适温度为40℃，40℃处理1h酶活基本保持不变，50℃处理1h后仍可剩余30％以上的酶活。
本发明提供了编码上述中低温中性单宁酶tanXZ7。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示：
atgccctcctggctcaagctcaccgccaaagccctgtctctgagcgacgtctgcaccgtatcaaacgtgcaggctgcattgccctccaatggcactctgttgggtctcaatctcattccgtcctctgtcacagccacgatgaccaattcctccaccagtggcggcatgggcggcggcatgccaatgatgaaaagacagtcttcctctacccaatactgcgctgtcaccgtcacatatacgcaccctggccagggcgacgaggtcaatctaaagtacgcttttccgagcccttcggaattcaagaaccgtttctatgtcggcggtggaggcggtttctccctctcgtcgtctgccacgggaggtctcagctatggtgccgccggcggggccaccgatgctggatacgacgccttcgaccagtcgtacgaccaggtcgtcctttatggcaacggatccatcaactggtatgccacccacatgttcggctaccaagcactgggcgagatggtagcgagttggagttactactgtgttggaaccatcaggaagaaagatggctgacgtcgttggcagaccaagatcggaaagtacatcaccaagggattctacggactctccaacgacaccaaggtctacacgtacttcgagggctgctctgacggtggacgcgagggcatgagccaggttcagcgctggggcgacgagtacgacggtgtcattgcaggcgccccggccttccgctttgcccagcagcaagtccaccacgtcttctcctccgcagtggaaaaaactctcggctatctcccgcccccctgcgagctcgatacgattgtcaacgccacaatcaagggctgcgataagctcgatggacgcgaggacggcgtcatttctcgcaccgatctttgcaagctcaacttcaacatgaagtcgatcatcggacagtcctactactgcgccgagaagaacagcacttccttgggcttcgggttccagaagcgtcaacagacctcggggagcaccacgagctaccagcctgctcagaagggcactgtcaccaaggagggcgtcgccgtcgctcaggccatttacgatgggctgcacaacaccgccggggagagggcctatctctcgtggcagattgggtcccagctttcggatgcgaacccgacctacagctcggagagcggtgaatgggaaccgaacatcccttcgaccggaggcgaatatgtcaccaagttcatccagctcctcgacctggacaacctgtctgacctggatggcgtcacgtacgacacgctggttgagtggatgacaatcggcatgtaccggtacttggacagccttcagacgaccttgccggatcttaccaccttcaagtcctctggcggaaagctgctccactaccacggcgaatccgaccccagcatcccttctgcttcctcggtgcactactggcagtctgtgcggagcgtcatgtaccctgatgtcgcggatgacaaggctctcaaggacatggccaagtggtatcagttctacctggtcccgggcgcaggccactgtggcagcaactccctccagcccggcccctaccctcagaacaacatggacatcatgattgactgggtggagaacggtgtccagccgacgcgcctcaatgccacggtttcctcgggcgactattccggcgagacccagatgctctgccagtggccgacacgtccgctctggaagaaggctaactcttttgagtgcatgacggacaagaagagtattgaggcctggacttacgacttccccgccttcaaggtgcccgtgtactaa
本发明基于PCR的方法分离克隆了单宁酶基因tanXZ7，DNA全序列分析结果表明，单宁酶TanXZ7结构基因tanXZ7全长1821bp。
本发明提供了编码上述中低温中性单宁酶tanXZ7的cDNA序列。具体地，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示：
atgccctcctggctcaagctcaccgccaaagccctgtctctgagcgacgtctgcaccgtatcaaacgtgcaggctgcattgccctccaatggcactctgttgggtctcaatctcattccgtcctctgtcacagccacgatgaccaattcctccaccagtggcggcatgggcggcggcatgccaatgatgaaaagacagtcttcctctacccaatactgcgctgtcaccgtcacatatacgcaccctggccagggcgacgaggtcaatctaaagtacgcttttccgagcccttcggaattcaagaaccgtttctatgtcggcggtggaggcggtttctccctctcgtcgtctgccacgggaggtctcagctatggtgccgccggcggggccaccgatgctggatacgacgccttcgaccagtcgtacgaccaggtcgtcctttatggcaacggatccatcaactggtatgccacccacatgttcggctaccaagcactgggcgagatgaccaagatcggaaagtacatcaccaagggattctacggactctccaacgacaccaaggtctacacgtacttcgagggctgctctgacggtggacgcgagggcatgagccaggttcagcgctggggcgacgagtacgacggtgtcattgcaggcgccccggccttccgctttgcccagcagcaagtccaccacgtcttctcctccgcagtggaaaaaactctcggctatctcccgcccccctgcgagctcgatacgattgtcaacgccacaatcaagggctgcgataagctcgatggacgcgaggacggcgtcatttctcgcaccgatctttgcaagctcaacttcaacatgaagtcgatcatcggacagtcctactactgcgccgagaagaacagcacttccttgggcttcgggttccagaagcgtcaacagacctcggggagcaccacgagctaccagcctgctcagaagggcactgtcaccaaggagggcgtcgccgtcgctcaggccatttacgatgggctgcacaacaccgccggggagagggcctatctctcgtggcagattgggtcccagctttcggatgcgaacccgacctacagctcggagagcggtgaatgggaaccgaacatcccttcgaccggaggcgaatatgtcaccaagttcatccagctcctcgacctggacaacctgtctgacctggatggcgtcacgtacgacacgctggttgagtggatgacaatcggcatgtaccggtacttggacagccttcagacgaccttgccggatcttaccaccttcaagtcctctggcggaaagctgctccactaccacggcgaatccgaccccagcatcccttctgcttcctcggtgcactactggcagtctgtgcggagcgtcatgtaccctgatgtcgcggatgacaaggctctcaaggacatggccaagtggtatcagttctacctggtcccgggcgcaggccactgtggcagcaactccctccagcccggcccctaccctcagaacaacatggacatcatgattgactgggtggagaacggtgtccagccgacgcgcctcaatgccacggtttcctcgggcgactattccggcgagacccagatgctctgccagtggccgacacgtccgctctggaagaaggctaactcttttgagtgcatgacggacaagaagagtattgaggcctggacttacgacttccccgccttcaaggtgcccgtgtactaa
本发明提供了编码上述中低温中性单宁酶tanXZ7的内含子序列。具体地，该基因的内含子序列如SEQ ID NO.4所示：
gtagcgagttggagttactactgtgttggaaccatcaggaagaaagatggctgacgtcgttggcag
本发明基于PCR的方法分离克隆了单宁酶基因tanXZ7的cDNA序列，cDNA全序列分析结果表明，单宁酶TanXZ7结构基因tanXZ7全长1755bp，无信号肽编码序列。
成熟蛋白理论分子量为66.4kDa，将单宁酶基因tanXZ7序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定TanXZ7是一种新的单宁酶。
本发明提供了包含上述中低温酸性单宁酶基因tanXZ7的重组载体，选为pPIC-tanXZ7。将本发明的单宁酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的单宁酶基因插入到质粒pPIC9上的SpeI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC-tanXZ7。
本发明还提供了包含上述中低温酸性单宁酶基因tanXZ7的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌，优选为重组菌株GS115/tanXZ7。
本发明还提供了一种制备中低温中性单宁酶TanXZ7的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组单宁酶表达；
3)回收并纯化所表达的单宁酶TanXZ7。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris GS115)，得到重组菌株GS115/tanXZ7。
本发明还提供了上述中低温酸性单宁酶TanXZ7的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品、饲料、医药和废水处理中应用新的单宁酶TanXZ7。本发明的单宁酶TanXZ7最适pH为6.0，最适温度40℃，在25～60℃都有较高的酶活性；其耐中低温特性，可使其在需求中低温环境的工业生产上应用。本单宁酶可应用于饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在食品工业中，可降解单宁，有效提高茶、咖啡、果汁饮料的澄清效率。
附图说明
图1重组单宁酶的最适pH。
图2重组单宁酶的pH稳定性。
图3重组单宁酶的最适温度。
图4重组单宁酶的热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明从梭孢菌(Thielavia subthermophila)中分离得到一种新的中低温中性单宁酶TanXZ7。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。单宁酸购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)Thielavia subthermophila XZ7CGMCC6544培养基为单宁酶筛选培养基(TAA)：0.3％硝酸钠，0.1％磷酸氢二钾，0.05％氯化钾，0.05％硫酸镁，1.5％琼脂粉，1％单宁酸。
(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH自然)。
(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH自然。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1Thielavia subthermophila XZ7单宁酶编码基因tanXZ7的克隆
菌株Thielavia subthermophila XZ7采自宁夏自治区沙漠地区植被根部沙子，能够在45℃正常生长，而在20℃下不能生长，是一株典型的嗜热真菌。
提取梭孢菌Thielavia subthermophila XZ7基因组DNA：
将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入液氮使其预冷，将菌体置于研钵中充分研磨成白色粉末状，将白色粉末转入50mL离心管中，加入22.5mL65℃预热的CTAB溶液(用前加入2％的巯基乙醇)和2.5mL20％SDS溶液，65℃水浴锅裂解2h，每隔10min颠倒混匀一次,在4℃下12000rpm离心15min。取上清于氯仿/异戊醇(24:1)中抽提除去杂蛋白,再取上清加入0.6倍体积异丙醇,于-20℃静置30min后,4℃下12000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70％的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量已灭菌的去离子水溶解,加入2μL RNase A酶，37℃水浴消化30min以去除RNA，置于-20℃备用。
根据单宁酶基因的保守(YY(L)PPPCEL和VTYDTLV)序列设计合成了简并引物Tan F，Tan R
Tan F:5'-TACTACCCNCCNCCNTGYGA-3'；
Tan R:5'-GTGTCGTANGTNACRTTRTC-3'。
以梭孢菌Thielavia subthermophila XZ7CGMCC6544基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec，48℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一段约497bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各两套TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，XZ7-F2/R2的位置设计在XZ7-F1/R1的内侧。每两个引物之间的距离是60～100bp，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为XZ7-F1，XZ7-F2(上游特异性引物),XZ7-R1,XZ7-R2(下游特异性引物)见表1。
表1.单宁酶TanXZ7TAIL-PCR特异性引物
通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到的产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后TanXZ7单宁酶基因全长1722bp，编码573个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端无信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为62.5kDa。
实施例2重组单宁酶的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(SpeI和NotI)，同时将编码单宁酶的基因tanXZ7双酶切(SpeI和NotI)，切出编码单宁酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有梭孢菌Thielavia subthermophila XZ7单宁酶基因tanXZ7的重组质粒pPIC-tanXZ7并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/tanXZ7。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定单宁酶的活力。重组单宁酶的表达量为10.52U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组单宁酶在毕赤酵母中得到了表达。
分离纯化获得重组单宁酶。
实施例3重组单宁酶的活性分析
罗单宁显色法：具体方法如下：在pH5.0，40℃条件下，500μL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，400μL没食子酸丙酯溶液(1.25mmol/L，pH5.0)，反应10min，加入300μL甲醇罗丹宁溶液(50mmol/L)终止反应，5min后再加入200μL KOH(0.5M)显色。冷却至室温后于520nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol没食子酸的酶量。
实施例4重组单宁酶TanXZ7的性质测定
测定实施例2获得重组单宁酶TanXZ7的性质
1、重组单宁酶TanXZ7的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将实施例2纯化的重组单宁酶TanXZ7在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物没食子酸丙酯于不同pH的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH3.0-7.0)中40℃下进行单宁酶活力测定。结果(图1)表明，重组TanXZ的最适pH为6.0，在pH5.5～6.5有80％以上的相对酶活性。单宁酶于各种不同pH的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠(pH2.0-8.0)和0.1mol/L甘氨酸-NaOH(pH9.0-12.0)缓冲液中37℃处理60min，再在pH6.0缓冲液体系中40℃下测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。结果(图2)表明单宁酶在pH3.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上，这说明此酶pH耐受性较为宽泛。
2、单宁酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
单宁酶的最适温度的测定为在柠檬酸-柠檬酸三钠(pH6.0)缓冲液体系及不同温度(20-60℃)下进行酶促反应。耐温性测定为单宁酶在不同温度(40℃，50℃，60℃)下处理不同时间(0、2、5、10、20、30和60min)，再在40℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为40℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，TanXZ7在40℃下温育1h，能保持90％以上的酶活。
3、单宁酶的Km值测定方法如下：
用不同浓度的没食子酸丙酯为底物，在柠檬酸-柠檬酸三钠(pH6.0)缓冲液体系中，40℃下测定酶活性，计算出其在40℃下的Km值。经测定，以没食子酸丙酯为底物时的Km值为2.02mmol/l，最大反应速度Vmax为105.5μmol/min/mg。
4、不同金属离子化学试剂对TanXZ7酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在40℃、pH6.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂对重组单宁酶的活力都有影响，Mg2+和Zn2+具有轻微的促进作用，Fe3+、Ag+、Pb+、Cu2+和Co2+抑制其部分活力，表面活性剂Tween20、Tween80、TritonX-100、EDTA和SDS有微弱的抑制作用，而β-巯基乙醇、异戊醇和甲醇具有较强的抑制作用。

Claims (9)

1.一种中温中性单宁酶TanXZ7，其特征在于，其氨基酸碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种中温中性单宁酶TanXZ7，其特征在于，编码权利要求1所述的中温中性单宁酶TanXZ7。
3.如权利要求2所述的中温中性单宁酶TanXZ7，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
4.包含权利要求2所述高温中温中性单宁酶TanXZ7的重组载体。
5.包含权利要求2所述中温中性单宁酶TanXZ7的重组载体pPIC-tanXZ7。
6.包含权利要求2所述中温中性单宁酶TanXZ7的重组菌株。
7.一种制备中温中性单宁酶TanXZ7的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组单宁酶表达；
3)回收并纯化所表达的中温中性单宁酶TanXZ7。
8.权利要求1所述中温中性单宁酶TanXZ7的应用。
9.权利要求1所述中温中性单宁酶TanXZ7在食品工业中的应用。
CN201410258209.8A 2014-06-11 2014-06-11 一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用 Active CN104004725B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410258209.8A CN104004725B (zh) 2014-06-11 2014-06-11 一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410258209.8A CN104004725B (zh) 2014-06-11 2014-06-11 一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104004725A true CN104004725A (zh) 2014-08-27
CN104004725B CN104004725B (zh) 2016-05-11

Family

ID=51365634

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410258209.8A Active CN104004725B (zh) 2014-06-11 2014-06-11 一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104004725B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101084772A (zh) * 2007-07-03 2007-12-12 浙江林学院 改善夏季绿茶品质的生产方法
CN102719413A (zh) * 2012-04-28 2012-10-10 中山大学 一种新型单宁酶及其应用
CN103275954A (zh) * 2012-11-08 2013-09-04 中国农业科学院饲料研究所 一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用
CN102203248B (zh) * 2008-10-24 2013-09-18 天野酶株式会社 鞣酸酶、编码其的基因及其制造法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101084772A (zh) * 2007-07-03 2007-12-12 浙江林学院 改善夏季绿茶品质的生产方法
CN102203248B (zh) * 2008-10-24 2013-09-18 天野酶株式会社 鞣酸酶、编码其的基因及其制造法
CN102719413A (zh) * 2012-04-28 2012-10-10 中山大学 一种新型单宁酶及其应用
CN103275954A (zh) * 2012-11-08 2013-09-04 中国农业科学院饲料研究所 一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NIERMAN, W.等: "tannase [Aspergillus fumigatus Af293]", 《GENBANK DATABASE》, 19 February 2008 (2008-02-19) *
OTILLAR, R.等: "hypothetical protein THITE_2117532 [Thielavia terrestris NRRL 8126]", 《GENBANK DATABASE》, 4 January 2012 (2012-01-04), pages 003654468 *
刘如石等: "Asp.Niger No.3单宁酶纯化及性质的研究", 《食品与机械》, no. 04, 25 August 2000 (2000-08-25), pages 15 - 16 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104004725B (zh) 2016-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102392007B (zh) 一种高温碱性木聚糖酶xyn10a及其基因和应用
CN102719417A (zh) 一种耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用
CN102363774B (zh) 一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和应用
CN104388408B (zh) 一种酸性高比活葡聚糖酶glu16-3及其基因和应用
CN103275954B (zh) 一种高温耐碱甘露聚糖酶Man5XZ7及其基因和应用
CN102533698B (zh) 一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和应用
CN101838636B (zh) 一种高比活木聚糖酶xyn11f63及其基因和应用
CN102533696B (zh) 一种酸性果胶酶endo-PGI及其基因和应用
CN101818135B (zh) 一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和应用
CN104004725A (zh) 一种中低温中性单宁酶TanXZ7及其基因和应用
CN103088002B (zh) 一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn及其基因和应用
CN101724613B (zh) 一种耐碱中温木聚糖酶xynam6及其基因和应用
CN103695397B (zh) 一种中温酸性木聚糖酶xyn10l1及其基因和应用
CN101851612B (zh) 一种酸性葡聚糖酶cela及其基因和应用
CN104232604A (zh) 一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应用
CN102154246B (zh) 一种酸性葡聚糖酶cel7g5及其基因和应用
CN101892208B (zh) 一种高温酸性木聚糖酶xyn10j88及其基因和应用
CN102586206B (zh) 一种高温酸性木聚糖酶xyn10c1及其基因和应用
CN103740682B (zh) 一种耐高温酸性β-甘露聚糖酶Man-L30及其基因和应用
CN103789283A (zh) 一种中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43及其基因和应用
CN101838637B (zh) 一种宽温度适用性的酸性葡聚糖酶agl9a及其基因和应用
CN102533699A (zh) 一种低温酸性木聚糖酶xyn10b及其基因和应用
CN104830960A (zh) 产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因
CN103074317B (zh) 一种啤酒酿造用高温中性木聚糖酶xyna及其基因和应用
CN105176950A (zh) 一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A及其基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200901

Address after: 100193 Beijing Old Summer Palace West Road, Haidian District, No. 2

Patentee after: Beijing Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Address before: 100081 Beijing, Zhongguancun, South Street, No. 12, No.

Patentee before: FEED Research Institute CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

TR01 Transfer of patent right