CN103992366A - 一种制备葫芦素b的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备天然产物葫芦素B的方法，具体方法是采用超临界流体萃取法，从植物中提取总葫芦素提取物，再采用硅胶柱分离纯化手段获得葫芦素B，葫芦素B含量大于90％。本发明与现有技术相比，具有时间短、效率高、溶剂用量少，环境污染小，适于大生产操作的优点。

Description

一种制备葫芦素B的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种天然产物葫芦素B的制备方法，具体涉及一种从植物中提取制备葫芦素B的方法。
背景技术
葫芦素B(Cucurbitacin B)，异名葫芦苦素B，Amarin，Fabacein II，分子式C32H46O8，分子量542.75。
化学结构式
葫芦素B普遍存在于葫芦科多种植物中，目前市场上销售的葫芦素制剂中的葫芦素来源于葫芦科植物甜瓜(Cucumis melo L.)的干燥成熟果柄。
葫芦素B具有抗肝炎和抗肿瘤等生理活性。
现有技术中，多采用有机溶剂回流、渗漉提取和生物酶等提取法(专利“一种葫芦素B的提取分离方法”，申请号200910154837.0和专利“一种提取葫芦素B的方法”申请号201010235780.X)得到总葫芦素提取物，再通过大孔树脂柱或活性碳氧化铝柱等分离纯化手段获得。但这些方法在由植物提取一步中消耗大量溶剂，生产过程中污染严重，得到的提取物中杂质含量高，后续分离纯化过程复杂，不适于大生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取制备葫芦素B的新方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
采用超临界流体萃取法得到总葫芦素提取物，具体步骤包括：
1)将甜瓜蒂粉碎，过40目筛，置于萃取釜中，设定萃取压力10～35MPa，萃取温度30～55℃，解析釜I温度为35～60℃，解析釜II温度为室温，解析釜I、II压力均为系统压力，静态萃取10～30min后，再动态萃取10～30min(频率35KHz)，从解析釜I出料口得样品I；
2)从携带剂罐中加入2～5倍药材量(V/W)的有机溶剂，设定萃取压力20～45MPa，萃取温度35～70℃，解析釜I温度为40～75℃，解析釜II温度为35～70℃，解析釜I、II压力均为系统压力，动态萃取30～60min(频率35KHz)从解析釜I出料口得萃取液。减压回收溶剂并浓缩至稠膏，得到样品II。
3)从富含总葫芦素提取物的样品I、样品II分离纯化得到葫芦素B。
其中，携带剂罐中加入的有机溶剂为乙醇和/或醋酸乙酯或/丙酮。
葫芦素B的分离纯化方法为采用闪式硅胶和总葫芦素提取物混合，用三氯甲烷润湿，拌样，挥干溶剂，上样装柱，用有机溶剂系统快速洗脱闪式硅胶色谱柱(200～300)，收集洗脱液，根据TLC检测结果合并洗脱液，回收洗脱液，用乙醇溶解，放置，析晶。即得葫芦素B，含量大于90.0％。
有机溶剂洗脱系统为石油醚-醋酸乙酯(1:0.5～1)，优选石油醚-醋酸乙酯(3:2)，或三氯甲烷-醋酸乙酯(1:0.5～1)，优选三氯甲烷-醋酸乙酯(1:0.7)。
TLC检测采用GF254硅胶板，展开剂为三氯甲烷-醋酸乙酯(3:2)和石油醚-醋酸乙酯(1:1)。
葫芦素B的分离纯化方法也可以为采用制备HPLC法，所采用的制备色谱柱填料为正相硅胶柱也可以为反相C18(5～15μm)，流动相正相系统为石油醚-乙酸乙酯，反相系统采用甲醇-水溶液，收集葫芦素B色谱峰洗脱液，回收洗脱液，浓缩，即得葫芦素B，含量大于95.0％。
在植物提取一步中采用超临界流体萃取法得到总葫芦素提取物，这种提取方法，不破坏植物中的天然化合物结构，且不用或用少量溶剂，生产过程中几乎无污染，得到的提取物中杂质含量低，有利于进一步的分离纯化。对得到的总葫芦素提取物采用闪式硅胶柱层析分离，洗脱系统用量少，毒性极低，适合大生产操作。葫芦素B的含量大于90.0％，且收率高。
具体实施方式
实施例1：
取甜瓜蒂2kg，粉碎，过40目筛，置于萃取釜中，设定萃取压力15MPa，萃取温度40℃，解析釜I温度为45℃，解析釜II温度为室温，解析釜I、II压力均为系统压力，静态萃取15min后，再动态萃取25min(频率35KHz)，从解析釜I出料口得样品I；2)从携带剂罐中加入2倍药材量(V/W)的乙醇，设定萃取压力25MPa，萃取温度45℃，解析釜I温度为50℃，解析釜II温度为45℃，解析釜I、II压力均为系统压力，动态萃取30min(频率35KHz)从解析釜I出料口得萃取液。减压回收溶剂并浓缩至稠膏，得到样品II。将I和II合并，即得总葫芦素提取物。
实施例2：
取甜瓜蒂2kg，粉碎，过40目筛，置于萃取釜中，设定萃取压力25MPa，萃取温度45℃，解析釜I温度为50℃，解析釜II温度为室温，解析釜I、II压力均为系统压力，从携带剂罐中加入3倍药材量(V/W)的乙醇，静态萃取25min后，再动态萃取40min(频率35KHz)，从解析釜I出料口得总葫芦素提取物。
实施例3：
取甜瓜蒂2kg，粉碎，过40目筛，置于萃取釜中，设定萃取压力20MPa，萃取温度40℃，解析釜I温度为45℃，解析釜II温度为室温，解析釜I、II压力均为系统压力，静态萃取10min后，再动态萃取30min(频率35KHz)，从解析釜I出料口得样品I；2)从携带剂罐中加入4倍药材量(V/W)的醋酸乙酯，设定萃取压力30MPa，萃取温度50℃，解析釜I温度为55℃，解析釜II温度为50℃，解析釜I、II压力均为系统压力，动态萃取30min(频率35KHz)从解析釜I出料口得萃取液。减压回收溶剂并浓缩至稠膏，得到样品II。将I和II合并，即得总葫芦素提取物。
实施例4：
取甜瓜蒂2kg，粉碎，过40目筛，置于萃取釜中，设定萃取压力20MPa，萃取温度40℃，解析釜I温度为45℃，解析釜II温度为室温，解析釜I、II压力均为系统压力，静态萃取10min后，再动态萃取30min(频率35KHz)，从解析釜I出料口得样品I；2)从携带剂罐中加入4倍药材量(V/W)的丙酮，设定萃取压力30MPa，萃取温度50℃，解析釜I温度为55℃，解析釜II温度为50℃，解析釜I、II压力均为系统压力，动态萃取30min(频率35KHz)从解析釜I出料口得萃取液。减压回收溶剂并浓缩至稠膏，得到样品II。将I和II合并，即得总葫芦素提取物。
实施例5：
取甜瓜蒂2kg，粉碎，过40目筛，置于萃取釜中，设定萃取压力25MPa，萃取温度35℃，解析釜I温度为40℃，解析釜II温度为室温，解析釜I、II压力均为系统压力，静态萃取15min后，再动态萃取30min(频率35KHz)，从解析釜I出料口得样品I；2)从携带剂罐中加入5倍药材量(V/W)的乙醇，设定萃取压力25MPa，萃取温度40℃，解析釜I温度为65℃，解析釜II温度为45℃，解析釜I、II压力均为系统压力，动态萃取50min(频率35KHz)从解析釜I出料口得萃取液。将I并入萃取液中，减压回收溶剂并浓缩至小体积，静置过夜，析出沉淀，干燥，即得总葫芦素提取物。
实施例6：
取实施例1中的总葫芦素提取物10g和闪式硅胶(80目)15g，混合，用三氯甲烷润湿拌匀，挥干溶剂，上样，用石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(3:2)快速洗脱闪式硅胶色谱柱(200目)，收集洗脱液，TLC检测，采用GF254硅胶板，展开剂为石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(1:1)，根据TLC检测结果合并洗脱液，回收洗脱液，用乙醇溶解，放置，析晶。得葫芦素B，用HPLC-DAD测定其含量为98.2％。
实施例7：
取实施例1中的总葫芦素提取物0.5g和闪式硅胶(100目)1.5g，混合，用三氯甲烷润湿拌匀，挥干溶剂，上样，用石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(1:1)快速洗脱闪式硅胶色谱柱(200目)，收集洗脱液，TLC检测，采用GF254硅胶板，展开剂为石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(1:1)，根据TLC检测结果合并洗脱液，回收洗脱液，用乙醇溶解，放置，析晶。得葫芦素B，用HPLC-DAD测定其含量为91.5％。
实施例8：
取实施例1中的总葫芦素提取物3g和闪式硅胶(80目)1.5g，混合，用三氯甲烷润湿拌匀，挥干溶剂，上样，用石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(1:0.82)快速洗脱闪式硅胶色谱柱(300目)，收集洗脱液，TLC检测，采用GF254硅胶板，展开剂为石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(1:1)，根据TLC检测结果合并洗脱液，回收洗脱液，用乙醇溶解，放置，析晶。得葫芦素B，用HPLC-DAD测定其含量为95.8％。
实施例9：
取实施例1中的总葫芦素提取5g和闪式硅胶(80目)15g，混合，用三氯甲烷润湿拌匀，挥干溶剂，上样，用三氯甲烷-醋酸乙酯(2:1)快速洗脱闪式硅胶色谱柱(200目)，收集洗脱液，TLC检测，采用GF254硅胶板，展开剂为三氯甲烷-醋酸乙酯(3:2)，根据TLC检测结果合并洗脱液，回收洗脱液，用乙醇溶解，放置，析晶。得葫芦素B，用HPLC-DAD测定其含量为94.3％。
实施例10：
取实施例1中的总葫芦素提取物0.5g和闪式硅胶(100目)1.5g，混合，用三氯甲烷润湿拌匀，挥干溶剂，上样，用三氯甲烷-醋酸乙酯(3:2)快速洗脱闪式硅胶色谱柱(200目)，收集洗脱液，TLC检测，采用GF254硅胶板，展开剂为三氯甲烷-醋酸乙酯(3:2)，根据TLC检测结果合并洗脱液，回收洗脱液，用乙醇溶解，放置，析晶。得葫芦素B，用HPLC-DAD测定其含量为96.9％。
实施例11：
取实施例1中的总葫芦素提取物0.5g，溶于三氯甲烷2ml中，采用制备HPLC法分离纯化制备葫芦素B，所采用的制备色谱柱填料为正相硅胶柱(10μm)，流动相正相系统为石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(60：40)，流速，30ml/min，收集葫芦素B色谱峰洗脱液，回收洗脱液，浓缩回收溶剂，即得葫芦素B，用HPLC-DAD测定其含量为97.9％。
实施例12：
取实施例1中的总葫芦素提取物0.5g，溶于甲醇5ml中，采用制备HPLC法分离纯化制备葫芦素B，所采用的制备色谱柱以十八烷基硅烷基键合硅胶为填充材料(10μm)，流动相甲醇-水(58：42)，流速，30ml/min，收集葫芦素B色谱峰洗脱液，回收洗脱液，浓缩回收溶剂，即得葫芦素B，用HPLC-DAD测定其含量为98.9％。

Claims (6)

1.一种制备葫芦素B的方法，其特征在于，采用超临界流体萃取法从植物中得到总葫芦素提取物，具体包括：
(1)将甜瓜蒂粉碎，过筛，置于萃取釜中，设定萃取压力10～35MPa，萃取温度30～55℃，解析釜I温度为35～60℃，解析釜II温度为室温，解析釜I、II压力均为系统压力，静态萃取10～30min后，再动态萃取10～30min，从解析釜I出料口得样品I；
(2)从携带剂罐中加入2～5倍药材量(V/W)的有机溶剂，设定萃取压力20～45MPa，萃取温度35～70℃，解析釜I温度为40～75℃，解析釜II温度为35～70℃，解析釜I、II压力均为系统压力，动态萃取30～60min从解析釜I出料口得萃取液；减压回收溶剂并浓缩至稠膏，得到样品II；
(3)从样品I、样品II中得到总葫芦素提取物；分离纯化得到葫芦素B。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为乙醇和/或醋酸乙酯或丙酮。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的总葫芦素提取物分离纯化方法为采用闪式硅胶和总葫芦素提取物混合，用三氯甲烷润湿，拌样，挥干溶剂，装柱，用有机溶剂系统快速洗脱闪式硅胶色谱柱，收集洗脱液，根据TLC检测结果合并洗脱液，回收洗脱液，用乙醇溶解，放置，析晶，即得葫芦素B。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂洗脱系统为石油醚-醋酸乙酯，比例为1:0.5～1；或者三氯甲烷-醋酸乙酯，比例为1:0.5～1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的石油醚-醋酸乙酯系统优选比例为3:2。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的三氯甲烷-醋酸乙酯系统优选比例为1:0.7。
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