CN103961320A - 一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂及其制备方法 - Google Patents

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CN103961320A CN201410218676.8A CN201410218676A CN103961320A CN 103961320 A CN103961320 A CN 103961320A CN 201410218676 A CN201410218676 A CN 201410218676A CN 103961320 A CN103961320 A CN 103961320A
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邱焕杰
廖梦春
曹演威
李云开
舒遂智
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Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂及其制备方法。具体地，所述免疫调节剂多肽包含胸腺五肽、胸腺法新、胸腺素β4。该缓释微球包括以微球总重量计，占微球重量0.1%—30%（w/w）的免疫调节剂多肽，和占微球重量60%—80%的分子量为5，000—200，000道尔顿的可生物降解且具生物相容性的高分子材料，以及占微球重量0.1%—20%的药学上可接受的其他辅料。本发明的缓释微球平均粒径为5—60μm，包封率大于90%。该缓释微球缓释期长达数天或数月，明显减少用药次数，提高了生物利用度，降低了药物的毒副作用，有利于临床治疗。该产品生产工艺重现性好，可行性好。

Description

一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及缓释微球制剂技术领域，尤其涉及一种免疫调节剂多肽的缓释微球制剂及制备方法。
背景技术
免疫调节剂是一种对正常的免疫功能不产生影响，但可增强已经低下的免疫功能，调节免疫反应的药物。在低免疫应答的病例中，能增强各类抗原的皮肤迟发性变态反应；并增强淋巴细胞介质的产生。当吞噬细胞和T细胞功能低下时，免疫调节剂可使其恢复正常。在临床上可用于治疗复发性及慢性感染、肿瘤、类风湿疾病、病毒感染后的低应答性疾病等。常见的免疫调节剂有免疫促进剂，免疫抑制剂，免疫双向调节剂。胸腺制剂是一种非特异性免疫调节制剂。
胸腺肽作为一种免疫调节剂，目前市场上主要有两种胸腺肽应用较广，分别是胸腺五肽和胸腺法新，胸腺素β4是一种新型胸腺肽。
胸腺五肽是胸腺分泌物胸腺生成素Ⅱ的有效部分，作用之一是诱导T细胞分化，可选择性地诱导Thy-1-的前胸腺细胞转化为Thy-1+的T细胞。胸腺五肽可用于恶性肿瘤病人经放化疗后，免疫功能损伤者 ；乙型肝炎的治疗 ；重大外科手术及严重感染 ；自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎，红斑狼疮；Ⅱ型糖尿病、更年期综合征 ；年老体衰免疫功能低下者。
胸腺法新是人体内重要的免疫调节物质，可用于治疗慢性乙型肝炎和增强免疫系统。同时还具有刺激血管内皮细胞迁移、促进血管生成和伤口愈合等功效，已用于乙型肝炎、丙型肝炎、恶性肿瘤以及免疫缺陷疾病等的临床治疗和研究。
胸腺素β4是真核生物细胞中的一种主要的肌动蛋白螯合分子，广泛分布于哺乳动物和其他脊椎动物的多种组织和有核细胞中。近年来胸腺素β4的应用主要在创伤愈合、肿瘤转移、血管再生等方面。
目前已上市的胸腺五肽剂型为注射用胸腺五肽，肌肉注射或加入葡萄糖中静脉点滴，每次1 mg，每日或隔日一次，一般15日为一个疗程，或者根据病情决定。另有10mg规格，疗程遵医嘱。临床已上市的胸腺法新剂型为注射用胸腺法新，每瓶胸腺法新(1.6mg)以1ml注射用水溶解后立即皮下注射(不应作肌注或静注)。 治疗慢性乙型肝炎的推荐剂量：每次1.6mg，每周2次，两次相隔3-4天。连续给药6个月(共52针)，其间不应间断。 作为免疫损害病者的疫苗免疫应答增强剂：每次1.6mg，每周2次，两次相隔3-4天，连续4周(共8针)，第一针应在给疫苗后立即皮下注射。这些剂型均需要多次给药，给药麻烦，因此，开发一种新型制剂成为当前的重要课题。本发明的多肽缓释制剂微球是近年来发展的新剂型，它是以高分子材料为载体制成的给药系统，微球中的药物分散或包埋在材料中而形成球状实体。这类剂型的开发，对于发展缓释与靶向给药系统有重要的意义。而且本发明的制剂以缓释微球形式给药，有效延长了有效成分在体内作用时间，减少给药次数和药物耐受性，提高病人的适应性，方便临床使用和患者接受。另外，它还消除了普通注射剂多次给药产生的体内药物浓度峰谷现象，可获得平稳长时间的有效浓度，降低了毒副作用，并且总给药剂量减少。
发明内容
目前免疫调节剂胸腺肽类给药剂型是注射用药，给药频繁，以缓释微球形式给药，有效延长了有效成分在体内作用时间，减少给药次数和药物耐受性，提高病人的适应性，方便临床使用和患者接受。另外，它还消除了普通注射剂多次给药产生的体内药物浓度峰谷现象，可获得平稳长时间的有效浓度，降低了毒副作用，并且总给药剂量减少。
本发明制备了一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂，其特征在于所述制剂含有以微球总重量计，占微球重量0.1%—30%（w/w）的免疫调节剂多肽，和占微球重量60%—80%的分子量为5，000—200，000道尔顿的可生物降解且具生物相容性的高分子材料，以及占微球重量0.1%—20%的药学上可接受的其他辅料。本发明的缓释微球平均粒径为5—60μm，包封率大于90%。所述免疫调节剂多肽包括胸腺五肽、胸腺法新与胸腺素β4。所述可生物降解且具生物相容性的高分子材料，可选自聚丙交酯（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚丙交酯—乙交酯（PLGA）、聚羟丁酸（PHB）、聚羟基丁酸戊酸酯(PHBV)、聚癸酸（PDA）、聚乳酸—聚乙二醇其中的一种或其混合物，优选聚丙交酯（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚丙交酯—乙交酯（PLGA）其中的一种或其混合物，分子量范围均在5,000—200,000道尔顿。所述的药学上可接受的其他辅料包括明胶、甘油、乳化稳定剂及赋形剂，明胶用量范围为0.1%—5%，甘油用量范围为0.1%—5%，乳化稳定剂选自聚乙烯醇（PVA），其用量范围为0.1%—5%，赋形剂选自山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖中的一种或其混合物，其用量范围为0.1%—5%。
一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂的制备方法，其特征是采用复乳—液中干燥法，分两步制备微球，具体方法如下：
第一步，首先将免疫调节剂多肽、明胶、甘油溶于纯化水，得内水相；另将高分子材料溶于有机溶剂中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，高速乳匀，形成W/O乳液；然后将W/O乳液加入到聚乙烯醇溶液中，高速乳匀，形成W/O/W复乳；
第二步，将W/O/W复乳加入纯化水，室温下磁力搅拌，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入赋形剂，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
所述的有机溶剂选自二氯甲烷、乙醚、丙酮、四氢呋喃等，优选二氯甲烷。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1
称取10g胸腺五肽、5g明胶、5g甘油溶于纯化水，得内水相；称取160g聚丙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳加入纯化水中，室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入5g山梨醇，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例1制备的载药胸腺五肽缓释微球1g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例1制备的载药胸腺五肽缓释微球中药物含量，据此计算包封率是94.6%。
对实施例1制备的胸腺五肽缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例1制备的胸腺五肽缓释微球，每份10mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1:1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例1 制备的胸腺五肽缓释微球制剂的体外释药测定结果如表1所示：
表1 实施例1 制备的胸腺五肽缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例1制备的胸腺五肽缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（已上市注射用胸腺五肽组）、D组（实施例1制备的胸腺五肽缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每日肌肉注射1mg/(kgd)已上市注射用胸腺五肽，连续14d；D组：实施例1制备的胸腺五肽缓释微球制剂按0.1mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表2所示。
表2 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 70.42+10.23 84.55+18.42 93.22+3.21
D组 65.25+7.45 77.81+11.42 98.34+2.85
从表2可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每天注射，持续14天，D组仅需注射1次。
实施例2
称取10g胸腺五肽、2g明胶、2g甘油溶于纯化水，得内水相；称取45g聚乙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳加入纯化水，室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入5g甘露醇，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例2制备的载药胸腺五肽缓释微球1g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例2制备的载药胸腺五肽缓释微球中药物含量，据此计算包封率是92.9%。
对实施例2制备的胸腺五肽缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例2制备的胸腺五肽缓释微球，每份10mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1:1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例2 制备的胸腺五肽缓释微球制剂的体外释药测定结果如表3所示：
表3 实施例2 制备的胸腺五肽缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例2制备的胸腺五肽缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（已上市注射用胸腺五肽组）、D组（实施例2制备的胸腺五肽缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每日肌肉注射1mg/(kgd)已上市注射用胸腺五肽，连续14d；D组：实施例2制备的胸腺五肽缓释微球制剂按0.1mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表4所示。
表4 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 70.42+10.23 84.55+18.42 93.22+3.21
D组 67.34+6.48 79.21+9.33 97.12+2.75
从表4可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每天注射，持续14天，D组仅需注射1次。
实施例3
称取10g胸腺五肽、2g明胶、2g甘油溶于纯化水，得内水相；称取25g聚丙交酯-乙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳加入纯化水中，室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入2g乳糖，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例3制备的载药胸腺五肽缓释微球1g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例3制备的载药胸腺五肽缓释微球中药物含量，据此计算包封率是94.2%。
对实施例3制备的胸腺五肽缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例3制备的胸腺五肽缓释微球，每份10mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1:1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例3 制备的胸腺五肽缓释微球制剂的体外释药测定结果如表3所示：
表5 实施例3 制备的胸腺五肽缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例3制备的胸腺五肽缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（已上市注射用胸腺五肽组）、D组（实施例3制备的胸腺五肽缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每日肌肉注射1mg/(kgd)已上市注射用胸腺五肽，连续14d；D组：实施例3制备的胸腺五肽缓释微球制剂按0.1mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表6所示。
表6 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 70.42+10.23 84.55+18.42 93.22+3.21
D组 66.12+4.32 75.28+7.23 98.46+2.16
从表6可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每天注射，持续14天，D组仅需注射1次。
实施例4
称取16g胸腺法新、5g明胶、5g甘油溶于纯化水，得内水相；称取250g聚丙交酯-乙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳加入纯化水中，室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入20g蔗糖，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例4制备的载药胸腺法新缓释微球1.6g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例4制备的载药胸腺法新缓释微球中药物含量，据此计算包封率是94.9%。
对实施例4制备的胸腺法新缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例4制备的胸腺法新缓释微球，每份10mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1:1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例4 制备的胸腺法新缓释微球制剂的体外释药测定结果如表7所示：
表7 实施例4 制备的胸腺法新缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例4制备的胸腺法新缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（已上市注射用胸腺法新组）、D组（实施例4制备的胸腺法新缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每隔3天肌肉注射1.6mg/(kgd)已上市注射用胸腺法新，连续14d；D组：实施例4制备的胸腺法新缓释微球制剂按0.16mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表8所示。
表8 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 76.38+11.29 94.47+11.46 88.24+3.48
D组 69.35+4.12 79.67+7.34 95.23+2.76
从表8可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每隔3天注射，持续14天，D组仅需注射1次。
实施例5
称取16g胸腺法新、5g明胶、5g甘油溶于纯化水，得内水相；称取75g聚丙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳加入纯化水，室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入10g蔗糖，10山梨醇，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例5制备的载药胸腺法新缓释微球1.6g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例5制备的载药胸腺法新缓释微球中药物含量，据此计算包封率是91.5%。
对实施例5制备的胸腺法新缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例5制备的胸腺法新缓释微球，每份10mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1:1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例5 制备的胸腺法新缓释微球制剂的体外释药测定结果如表9所示：
表9 实施例5 制备的胸腺法新缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例5制备的胸腺法新缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（已上市注射用胸腺法新组）、D组（实施例5制备的胸腺法新缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每隔3天肌肉注射1.6mg/(kgd)已上市注射用胸腺法新，连续14d；D组：实施例5制备的胸腺法新缓释微球制剂按0.16mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表10所示。
表10 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 76.38+11.29 94.47+11.46 88.24+3.48
D组 67.47+4.56 76.25+7.17 90.36+2.01
从表10可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每隔3天注射，持续14天，D组仅需注射1次。
实施例6
称取16g胸腺法新、2g明胶、2g甘油溶于纯化水，得内水相；称取25g聚乙交酯、20g聚丙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳加入纯化水，室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入6g山梨醇，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例6制备的载药胸腺法新缓释微球1.6g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例6制备的载药胸腺法新缓释微球中药物含量，据此计算包封率是93.2%。
对实施例6制备的胸腺法新缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例6制备的胸腺法新缓释微球，每份10mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1:1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例6 制备的胸腺法新缓释微球制剂的体外释药测定结果如表11所示：
表11 实施例6 制备的胸腺法新缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例6制备的胸腺法新缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（已上市注射用胸腺法新组）、D组（实施例6制备的胸腺法新缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每隔3天肌肉注射1.6mg/(kgd)已上市注射用胸腺法新，连续14d；D组：实施例6制备的胸腺法新缓释微球制剂按0.16mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表12所示。
表12 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 76.38+11.29 94.47+11.46 88.24+3.48
D组 72.24+4.04 75.58+5.26 96.25+2.88
从表12可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每隔3天注射，持续14天，D组仅需注射1次。
实施例7
称取20g胸腺素β4、10g明胶、10g甘油溶于纯化水，得内水相；称取150g聚乙交酯、150g聚丙交酯-乙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳加入纯化水，室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入30g乳糖，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例7制备的载药胸腺素β4缓释微球2.0g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例7制备的载药胸腺素β4缓释微球中药物含量，据此计算包封率是95.2%。
对实施例7制备的胸腺素β4缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例7制备的胸腺素β4缓释微球，每份20mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1:1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例7 制备的胸腺素β4缓释微球制剂的体外释药测定结果如表13所示：
表13 实施例7 制备的胸腺素β4缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例7制备的胸腺素β4缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（注射用胸腺素β4组）、D组（实施例7制备的胸腺素β4缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每天肌肉注射2.0mg/(kgd)已上市注射用胸腺法新，连续14d；D组：实施例7制备的胸腺素β4缓释微球制剂按0.2mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表14所示。
表14 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 78.12+4.23 88.23+7.32 86.35+3.21
D组 68.22+4.04 77.13+3.24 90.42+3.12
从表14可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每天注射，持续14天，D组仅需注射1次。
实施例8
称取20g胸腺素β4、5g明胶、5g甘油、20ml5%聚乙烯醇溶于纯化水，得内水相；称取90g聚丙交酯-乙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入10g甘露醇，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例8制备的载药胸腺素β4缓释微球2.0g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例8制备的载药胸腺素β4缓释微球中药物含量，据此计算包封率是91.2%。
对实施例8制备的胸腺素β4缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例8制备的胸腺素β4缓释微球，每份20mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1:1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例8 制备的胸腺素β4缓释微球制剂的体外释药测定结果如表15所示：
表15 实施例8 制备的胸腺素β4缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例8制备的胸腺素β4缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（注射用胸腺素β4组）、D组（实施例8制备的胸腺素β4缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每天肌肉注射2.0mg/(kgd)已上市注射用胸腺法新，连续14d；D组：实施例8制备的胸腺素β4缓释微球制剂按0.2mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表16所示。
表16 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 78.12+4.23 88.23+7.32 86.35+3.21
D组 66.42+4.33 75.46+3.58 91.35+3.56
从表16可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每天注射，持续14天，D组仅需注射1次。
实施例9
称取20g胸腺素β4、2g明胶、2g甘油溶于纯化水，得内水相；称取50g聚乙交酯溶于二氯甲烷中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，室温下置于乳化分散机上高速（30000rpm）乳匀30秒，形成W/O型乳液；配制浓度为5%的聚乙烯醇溶液50ml，然后将所得的W/O型乳剂转移至50ml5%聚乙烯醇溶液中，置于乳化分散机上以5000rpm的转速，乳匀1分钟，得W/O/W型复乳；将W/O/W复乳加入纯化水中，室温下磁力搅拌2小时，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入10g蔗糖，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
精密称取实施例9制备的载药胸腺素β4缓释微球2.0g溶于1mL二氯甲烷，分次加入30mL和20mL纯化水提取药物，涡旋萃取1min，15000rpm离心3min，吸取合并上清液，移取上清液0.5mL以纯化水定容至10mL，进样20μl，HPLC测定含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算得实施例9制备的载药胸腺素β4缓释微球中药物含量，据此计算包封率是96.6%。
对实施例9制备的胸腺素β4缓释微球制剂进行体外释药考察，方法如下：
精密称取若干份实施例9制备的胸腺素β4缓释微球，每份20mg，置于35个100mL的西林瓶中，每份加入含有0.1M的Na2HPO4和0.1M的NaH2PO4的pH7.4的磷酸缓冲溶液，置于37℃恒温水浴中，分别在第0小时、2小时、1天、4天、10天、16天、24天、30天、40天取出，离心，重新分散在二氯甲烷醋酸缓冲液（1:1v/v），色谱柱为C18 50×2mm，流动相为1：1的含有0.1%三氟醋酸和含有1%三氟醋酸的50%乙腈混合溶液，流速1.0ml/min，在220nm处检测，测定微球内残余药量，按照外标法计算累计释放度，实施例9 制备的胸腺素β4缓释微球制剂的体外释药测定结果如表17所示：
表17 实施例9 制备的胸腺素β4缓释微球制剂的体外释药实验结果
研究表明肿瘤恶病质的发生是多种调节物质失衡所致，主要为细胞因子，因此，有效地调节细胞因子水平对改善恶病质状态有重要意义。利用小鼠结肠腺癌26细胞株诱导小鼠恶病质模型，观察实施例9制备的胸腺素β4缓释微球制剂对其相关细胞因子的调节作用。将40只小鼠随机分为4组，每组10只：A组（正常对照组）、B组（肿瘤恶病质组）C组（注射用胸腺素β4组）、D组（实施例9制备的胸腺素β4缓释微球制剂）。每组分别给药如下：B组：生理盐水0.2ml/d腹腔注射14d；C组：每天肌肉注射2.0mg/(kgd)已上市注射用胸腺法新，连续14d；D组：实施例9制备的胸腺素β4缓释微球制剂按0.2mg/kg皮下注射一次。
结肠腺癌26细胞株接种后第25天，全部小鼠摘掉眼球取血，离心收集血清。酶联免疫吸附法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（1L-2）、白细胞介素-6（1L-6）。各组小鼠血清细胞因子测定结果如表18所示。
表18 各组小鼠血清细胞因子测定结果（ρ／ng·L-1）
组别 TNF-α 1L-6 1L-2
A组 64.31+9.24 71.36+19.27 77.21+5.48
B组 91.54+9.88 131.52+23.46 50.25+4.52
C组 78.12+4.23 88.23+7.32 86.35+3.21
D组 68.22+4.04 77.13+3.24 90.42+3.12
从表18可以看出，与B组比较，C组和D组均具有降低TNF-α和1L-6表达水平，并且D组效果优于C组；C组和D组均能提高1L-2的表达水平，并且D组效果优于C组；另外，C组需每天注射，持续14天，D组仅需注射1次。

Claims (8)

1.一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂，其特征是：所述制剂含有占微球重量0.1%—30%（w/w）的免疫调节剂多肽，占微球重量60%—80%的分子量为5，000—200，000道尔顿的可生物降解且具生物相容性的高分子材料，以及占微球重量0%—20%的药学上可接受的其他辅料，所述缓释微球平均粒径为5—60μm，包封率大于90%。
2.根据权利要求1所述的免疫调节剂多肽缓释微球制剂，其特征是：所述免疫调节剂多肽包括胸腺五肽、胸腺法新与胸腺素β4。
3.根据权利要求1所述的免疫调节剂多肽缓释微球制剂，其特征是：所述可生物降解且具生物相容性的高分子材料，可选自聚丙交酯（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚丙交酯—乙交酯（PLGA）、聚羟丁酸（PHB）、聚羟基丁酸戊酸酯(PHBV)、聚癸酸（PDA）、聚乳酸—聚乙二醇其中的一种或其混合物。
4.根据权利要求3所述的免疫调节剂多肽缓释微球制剂，其特征是：所述可生物降解且具生物相容性的高分子材料，优选聚丙交酯（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚丙交酯—乙交酯（PLGA）其中的一种或其混合物。
5.根据权利要求4所述的免疫调节剂多肽缓释微球制剂，其特征是：所述的聚丙交酯（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚丙交酯—乙交酯（PLGA）分子量范围均在5，000—200，000道尔顿。
6.根据权利要求1所述的免疫调节剂多肽缓释微球制剂，其特征是：所述的药学上可接受的其他辅料包括明胶、甘油、乳化稳定剂及赋形剂，明胶用量范围为0.1%—5%，甘油用量范围为0.1%—5%，乳化稳定剂选自聚乙烯醇（PVA），其用量范围为0.1%—5%，赋形剂选自山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖中的一种或其混合物，其用量范围为0.1%—5%。
7.根据权利要求1所述的免疫调节剂多肽缓释微球制剂的制备方法，其特征是采用复乳—液中干燥法，分两步制备微球，其特征是：
第一步，首先将免疫调节剂多肽、明胶、甘油溶于纯化水，得内水相；另将高分子材料溶于有机溶剂中，得油相；将油相和内水相置于搅拌器内，高速乳匀，形成W/O乳液；然后将W/O乳液加入到聚乙烯醇溶液中，高速乳匀，形成W/O/W复乳；
第二步，将W/O/W复乳加入纯化水中，室温下磁力搅拌，除去有机溶剂，超速离心，收集所得微球，用蒸馏水洗涤多次后，再离心收集，加入赋形剂，冷冻干燥，即得一种免疫调节剂多肽缓释微球制剂。
8.根据权利要求7所述的免疫调节多肽缓释微球制剂制备方法，其特征是：所述的有机溶剂选自二氯甲烷、乙醚、丙酮、四氢呋喃等，优选二氯甲烷。
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