CN103858756B - 一种根系发达的红景天无菌苗的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种根系发达的红景天无菌苗的培养方法，属于现代生物方法领域。该方法包括以下步骤：（1）、高山红景天野生苗的采集；（2）、对采集得到的高山红景天野生苗的茎进行消毒处理；（3）、高山红景天幼茎的切段处理；（4）、培养基的配制；（5）、根系发达的高山红景天无菌苗的培养。本发明克服了现有高山红景天组织培养过程中苗长势弱、生根难、根数较少、苗龄短等缺点和不足，提供一种根系发达的红景天无菌苗的培养方法，以获得优质的高山红景天再生植株。

Description

一种根系发达的红景天无菌苗的培养方法
技术领域
本发明涉及了一种根系发达的红景天无菌苗的培养方法，属于现代生物方法领域。
背景技术
高山红景天（Rhodiolas活性炭halinensisA．Bor．）别名库页红景天，系景天科红景天属(RhodiolaL．)，是一种生长在高海拔低温山区的多年生双子叶草本植物。在我国多分布于东北，是长白山地区的稀有珍贵药用植物之一。高山红景天的根、茎、叶、花、种子均可入药，有效成分为红景天甙、黄酮类化合物及多种微量元素，红景天不但具有抗氧化、抗疲劳、抗缺氧、抗寒冷、抗衰老、抗微波辐射等类似“适应原”功效。由于医药食品工业的大量需求，野生高山红景天被人为无计划采挖，导致资源日趋枯竭，当地政府已经禁止采挖。自20世纪80年代初我国已开始红景天人工引种栽培的研究，由于高山红景天长期生长在极其恶劣而多变的自然环境中，不耐高温、潮湿气候以及易发病等原因，对高山红景天的大规模培养增加了难度。
活性炭在培养基中能吸附有害物质，活性炭在培养基中能吸附培养物在培养过程中分泌的酚类、醌类等物质，防止导致褐变的有害物质积累，褐化现象的产生一般认为是外植体向外溢出的酚类与蒽类等化合物氧化所致，没有加入活性炭的培养基中的无菌苗，在组培过程中出现褐化现象，而加入活性炭的培养基中的无菌苗，在组培过程中很少出现褐化现象，这说明活性炭在克服外植体褐化问题上有良好的效果。
在无菌苗的生长培养基中，既有植物代谢产生的有害产物，也有促进植物生长添加的生长调节物质。相关研究发现，在植物培养基中添加活性炭，活性炭可以通过自身的吸附能力而发挥作用，对试管苗的生长发育起到促进作用，不同种属植物间的活性炭使用量尚有差异。为此，通过在培养基中加入不同浓度的活性炭，寻求适宜的高山红景天无菌苗生长、增殖的活性炭用量，为高山红景天的规模化快速繁殖提供参考十分必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有高山红景天组织培养过程中苗长势弱、生根难、根数较少、苗龄短等问题，提供一种根系发达的红景天无菌苗的培养方法，以获得优质的高山红景天再生植株。
本发明的目的是这样实现的，该方法包括以下步骤：
（1）、高山红景天野生苗的采集：在每年的7月份，在长白山海拔高度为1700-2500m处采集高山红景天的野生幼苗，幼苗选取时要选择幼茎，选取距离根部2cm以上部位，在幼茎的选取时要注意保持嫩茎的新鲜；
（2）、对采集得到的高山红景天野生苗的茎进行消毒处理：利用自来水流水冲洗10min，在超净工作台中用75%的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗2次，再用10%的NaClO溶液浸泡10min，用无菌水冲洗4次，备用；
（3）、高山红景天幼茎的切段处理：将已经经过消毒处理的高山红景天幼茎用培养皿盛好，放在超净工作台上，切取成长度为1.0cm左右茎段，备用。
（4）、培养基的配制：基本培养基选用的是1/2MSB5培养基2.37g/L+蔗糖15g/L+琼脂6g/L，选取1个1L容量的器皿，称量2.37g的基本培养基之后，加完培养基之后，用蒸馏水定容至1L，所述培养基的pH值为5.83，将配好的培养基在121℃进行高压蒸汽灭菌20min，灭菌之后，1L的培养基分装成20个小器皿，备用。
（5）、根系发达的高山红景天无菌苗的培养：在超净工作台中，将切好备用的高山红景天茎段转接到活性炭浓度为0.4g/L的培养基中，每个小器皿中接种4个，放在人工智能气候箱中培养。在培养过程中，每天对高山红景天的生长情况进行观察，在培养了60天之后，将根系发达的高山红景天无菌苗从培养瓶中取出即得。
（6）、培养条件的选择：高山红景天的培养均在人工智能气候箱内进行，温度为24±2℃；光照强度为6000-8000lx，光周期为16h光照/8h黑暗。
本发明方法具有以下优点和积极效果：
1、本发明通过在培养基中加入不同浓度的活性炭，确定适宜的高山红景天无菌苗生长、增殖的活性炭用量，旨在为高山红景天的规模化快速繁殖提供参考。
2、本发明中通过在高山红景天的培养中添加活性炭作为吸附剂，降低了实验成本。
3、本发明中在高山红景天的组织培养中加入活性炭，实现了一步成苗的简化培养程序。
4、本发明通过在高山红景天组织培养时加入活性炭，有利于红景天的根系生长，并且利于有效次生代谢产物的积累。
附图说明
图1是本发明7月份在长白山海拔1700-2500m高度采集到的高山红景天幼苗示意图。
图2是本发明高山红景天在添加不同浓度活性炭的培养基中生长情况的对比图。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步说明：
（1）、高山红景天野生苗的采集：在每年的7月份，在长白山海拔高度为1700-2500m处采集高山红景天的野生幼苗，幼苗选取时要选择幼茎，选取距离根部2cm以上部位，在幼茎的选取时要注意保持嫩茎的新鲜。
（2）、对采集得到的高山红景天野生苗的茎进行消毒处理：利用自来水流水冲洗10min，在超净工作台中用75%的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗2次，再用10%的NaClO溶液浸泡10min，用无菌水冲洗4次，备用。
（3）、高山红景天幼茎的切段处理：将已经经过消毒处理的高山红景天幼茎用培养皿盛好，放在超净工作台上，切取成长度为1.0cm左右茎段，备用。
（4）、培养基的配制：基本培养基选用的是1/2MSB5培养基2.37g/L+蔗糖15g/L+琼脂6g/L（MSB5培养基购自青岛海博生物技术有限公司，货号：HB8487）。选取11个1L容量的三角烧瓶，分别称量2.37g的基本培养基之后，对每个三角烧瓶按照活性炭的浓度进行标号，分别为0号、1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、10号，分别按照标号的顺序在三角瓶中添加0g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L不同浓度的活性炭，即为0号—0g/L、1号—0.1g/L、2号—0.2g/L、3号—0.3g/L、4号—0.4g/L、5号—0.5g/L、6号—0.6g/L、7号—0.7g/L、8号—0.8g/L、9号—0.9g/L、10号—1.0g/L；加完培养基之后，用蒸馏水定容至1L，所有培养基的pH值均为5.83，将配好的培养基在121℃高压蒸汽灭菌20min，灭菌之后，将每个标号的1L的三角烧瓶中的培养基分装成20个小三角瓶，每瓶50ml培养基，备用。
（5）、根系发达的高山红景天无菌苗的培养：在超净工作台中，将步骤（3）中切好备用的高山红景天茎段分别转接到步骤（4）中备用的不同浓度活性炭的培养基中，每种标号的培养基接种5个小三角瓶，每瓶4个茎段，每组实验重复4次。
（6）、培养条件的选择：高山红景天的培养均在人工智能气候箱内进行，温度为24±2℃；光照强度为6000-8000lx，光周期为16h光照/8h黑暗。
（7）、结果统计：在高山红景天的培养过程中，每天对每种不同活性炭浓度下的高山红景天的生长情况进行观察统计，观察不同活性炭浓度对高山红景天生根数量和速率、株高、节间距、及生长情况的影响，并且分别进行数据统计；在培养了60天之后，将高山红景天无菌苗从培养瓶中取出，统计高山红景天苗的生根情况。
统计结果得出，当活性炭浓度为0.4g/L时，最适宜高山红景天生长。
上述方法步骤（4）中采用的1/2MSB5培养基及其配方是：
①大量元素：NH4NO333g/L，KNO338g/L，CaCl2·2H2O8.8g/L，MgSO4·7H2O7.4g/L，KH2PO43.4g/L。
②微量元素：KI0.166g/L，H3BO31.240g/L，MnSO4·4H2O4.460g/L，ZnSO4·7H2O1.720g/L，Na2MoO4·2H2O0.050g/L，CuSO4·5H2O0.005g/L，CoCl2·6H2O0.005g/L。
③铁盐:FeSO4·7H2O5.560g/L，Na2-EDTA·2H2O7.460g/L。
④B5有机成分：肌醇20g/L，烟酸0.1g/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.1g/L，　　盐酸硫胺素(维生素B1)0.1g/L，甘氨酸0.4g/L。
数据统计：在添加不同浓度活性炭的培养基中高山红景天无菌苗的生长情况统计分析。
在附图2中：
A：在基本培养基中添加活性炭浓度0.0g/L时，高山红景天的生长状态，植株瘦弱，根系较少，较易干枯死亡；
B：在基本培养基中添加活性炭浓度0.1g/L时，高山红景天的生长状态，植株瘦弱，根系较少，较易干枯死亡；
C：在基本培养基中添加活性炭浓度0.2g/L时，高山红景天的生长状态，植株瘦弱，根系较少，较易萎蔫死亡；
D：在基本培养基中添加活性炭浓度0.3g/L时，高山红景天的生长状态，植株长势一般，叶片呈嫩绿色，根系略有增多；
E：在基本培养基中添加活性炭浓度0.4g/L时，高山红景天的生长状态，植株粗壮，叶片饱满厚重，呈深绿色，根系较多，密集分布，较适于移栽在室外生长；
F：在基本培养基中添加活性炭浓度0.5g/L时，高山红景天的生长状态，植株长势较好，根系有所减少；
表1
注：表1中的数据均为4次重复实验所得出的平均数。
如表1所示，在添加不同浓度的活性炭的培养基中生长的高山红景天的生长情况对比数据，通过数据得出，在活性炭浓度为0.4g/L时，高山红景天的株高最高，节间距最长，节段数最多，平均生根数最多，根均长较长，开始生根苗龄较短。

Claims (1)

1.一种根系发达的红景天无菌苗的培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)、高山红景天野生苗的采集；
(2)、对采集得到的高山红景天野生苗的茎进行消毒处理；
(3)、高山红景天幼茎的切段处理；
(4)、培养基的配制；
(5)、根系发达的高山红景天无菌苗的培养；
其特征在于：该方法的具体步骤是：
(1)、高山红景天野生苗的采集：在每年的7月份，在长白山海拔高度为1700-2500m处采集高山红景天的野生幼苗，幼苗选取时要选择幼茎，选取距离根部2cm以上部位，在幼茎的选取时要注意保持嫩茎的新鲜；
(2)、对采集得到的高山红景天野生苗的茎进行消毒处理：利用自来水流水冲洗10min，在超净工作台中用75％的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗2次，再用10％的NaClO溶液浸泡10min，用无菌水冲洗4次，备用；
(3)、高山红景天幼茎的切段处理：将已经经过消毒处理的高山红景天幼茎用培养皿盛好，放在超净工作台上，切取成长度为1.0cm左右茎段，备用；
(4)、培养基的配制：基本培养基选用的是1/2MSB5培养基2.37g/L+蔗糖15g/L+琼脂6g/L，选取1个1L容量的器皿，称量1/2MSB5培养基之后，按0.4g/L的浓度添加活性炭，加完培养基之后，用蒸馏水定容至1L，最终培养基的pH值为5.83，将配好的培养基在121℃进行高压蒸汽灭菌20min，灭菌之后，1L的培养基分装成20个小器皿，备用；
(5)、根系发达的高山红景天无菌苗的培养：在超净工作台中，将切好备用的高山红景天茎段转接到配制好的培养基中，每个小器皿中接种4个，放在人工智能气候箱中培养；在培养过程中，每天对高山红景天的生长情况进行观察，在培养了60天之后，将根系发达的高山红景天无菌苗从培养瓶中取出即得；
(6)、培养条件的选择：高山红景天的培养均在人工智能气候箱内进行，温度为24±2℃；光照强度为6000-8000lx，光周期为16h光照/8h黑暗；
所述的1/2MSB5培养基配方是：
①大量元素：NH4NO333g/L，KNO338g/L，CaCl2·2H2O8.8g/L，MgSO4·7H2O7.4g/L，KH2PO43.4g/L，
②微量元素：KI0.166g/L，H3BO31.240g/L，MnSO4·4H2O4.460g/L，ZnSO4·7H2O1.720g/L，Na2MoO4·2H2O0.050g/L，CuSO4·5H2O0.005g/L，CoCl2·6H2O0.005g/L。
③铁盐:FeSO4·7H2O5.560g/L，Na2-EDTA·2H2O7.460g/L，
④B5有机成分：肌醇20g/L，烟酸0.1g/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.1g/L，盐酸硫胺素(维生素B1)0.1g/L，甘氨酸0.4g/L。
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