CN103837621B - 一种枳实药材指纹图谱、其建立方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种枳实药材指纹图谱、其建立方法及用途。具体地，本发明涉及一种枳实药材高效液相色谱（HPLC）指纹图谱及其建立方法，以及枳实药材HPLC指纹图谱和/或标准指纹图谱在鉴别枳实药材中的用途。具体地，枳实药材HPLC指纹图谱的建立方法，包括下述步骤：（1）枳实供试品的制备，和（2）高效液相色谱分析方法。本发明还涉及一种鉴别枳实药材的方法。本发明适于对枳实药材真伪和质量进行鉴别。

Description

一种枳实药材指纹图谱、其建立方法及用途

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种枳实药材指纹图谱、其建立方法及用途。具体地，本发明涉及一种枳实药材高效液相色谱（HPLC）指纹图谱及其建立方法，以及枳实药材HPLC指纹图谱和/或标准指纹图谱在鉴别枳实药材中的用途。本发明还涉及一种鉴别枳实药材质量（是否合格）的方法。

背景技术

中药指纹图谱是指某种（或某产地）中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材或中成药药物特性的共有峰的图谱。指纹图谱从中医整体观念和中药药效来自多种化学物质综合作用的观点出发，能够建立比较客观、整体和多指标的综合评价体系，并通过图谱的整体特征，能够比较全面地反映出中药所含化学成分的种类与数量，是一种综合的、可量化的质量控制手段。与测定单一组分相比，它的优势在于能够提供更丰富、有效的质和量的信息，因此指纹图谱技术可以更客观、科学、合理地进行中药质量控制。中药指纹图谱能较为宏观和综合地反映中药的内在质量已被国内外研究者所认可。

枳实为常用中药药材，古有“橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳”的名句，其在经典名方中多有使用，《伤寒杂病论》中用枳实之方有十七，如枳实薤白桂枝汤、大柴胡汤等。枳实为芸香科植物酸橙CitrusaruantiumL.及其栽培变种或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥幼果，具有破气消积，化痰散痞的功效。

枳实中的主要活性成分为挥发油、黄酮类化合物和少量生物碱类化合物。其中，挥发油类主要成分为右旋柠檬烯、枸橼酸等；生物碱类成分主要为辛弗林、N-甲基酪胺；黄酮类成分主要为柚皮苷、新橙皮苷及橙皮苷（张红，孙明江，王凌.枳实的化学成分及药理作用研究进展.中药材，2009，32(11):1787-1789）。

2010版药典规定，以辛弗林作为枳实质量控制的指标（国家药典委员会编，中华人民共和国药典2010年版，北京：化学工业出版社，2010，一部：230）。这种采用单一指标进行中药质量控制的方法不能全面反映中药内在化学成分的种类和数量，进而反映中药质量，此外，测定辛弗林含量的方法相对比较复杂。因此，目前亟需新的有效检测和鉴定枳实药材且操作相对简便的方法。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种枳实药材HPLC指纹图谱的建立方法并且得到了枳实药材HPLC标准指纹图谱。本发明人惊奇地发现，该建立方法和枳实药材HPLC标准指纹图谱能够用于鉴定或者鉴别枳实药材质量是否合格，具有较高的可信度和极高的灵敏度。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种枳实药材HPLC指纹图谱的建立方法，包括下述步骤：

（1）枳实供试品（例如供试品溶液）的制备，和

（2）高效液相色谱分析方法。

根据本发明任一项所述的建立方法，其中，所述步骤（1）包括：

1）称取枳实药材，加入5－15倍量（ml/g）的蒸馏水回流提取1－5次，每次1－5h；

2）将提取物过滤，合并滤液；将滤液浓缩，得到浓缩液；

3）向浓缩液中加入无水乙醇，至乙醇含量为50%－90%，均匀搅拌，静置1－24小时，离心，得到沉淀；

4）用50%－90%乙醇洗涤沉淀，离心，合并上清，浓缩除醇，将得到的提取液冷冻干燥，得到供试品；

优选地，还包括：

5）精密称取供试品，用50%－90%的甲醇定容，以微孔滤膜过滤，得到枳实供试品溶液。

根据本发明任一项所述的建立方法，其特征在于如下的A－H项中的任意一项或者多项：

A.步骤1）中，加入8－12倍量（例如8、9、10、11、12）的蒸馏水；

B.步骤1）中，回流提取2－4次（例如2、3或4次）；

C.步骤1）中，回流提取2－4小时（例如2、3或4小时）；

D.步骤3）中，至乙醇含量为60%－80%（例如65%－75%、60%、65%、70%、75%或80%）；

E.步骤3）中，静置时间为5－15小时（例如8－12小时、8、9、10、11或12小时）；

F.步骤4）中，乙醇浓度为60%－80%（例如65%－75%、60%、65%、70%、75%或80%）；

G.步骤3）和4）中，所述离心独立地为5－50min，1500－5000rpm（例如为15－30min，2000－3000rpm或者25min，2500rpm）；和

H.步骤5）中，甲醇浓度为60%－80%（例如65%－75%、60%、65%、70%、75%或80%）。

根据本发明任一项所述的建立方法，其中，所述步骤（1）包括：

（1－1）称取枳实药材10g，加入100mL蒸馏水回流提取2次，每次2h，过滤，合并两次滤液；适当浓缩后，加入无水乙醇，至乙醇含量为70%，均匀搅拌，静置过夜，25min，2500rpm离心，用70%乙醇洗涤沉淀，25min，2500rpm离心，合并上清，浓缩除醇，将得到的提取液冷冻干燥，得到供试品；

优选地，还包括：

（1－2）精密称取枳实中等极性部位样品0.0200g，用50%甲醇定容至10mL容量瓶中，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到枳实供试品溶液。

根据本发明任一项所述的建立方法，其中，所述步骤（2）包括：

色谱柱填料为AgilentTC-C₁₈；流动相为含0.1%甲酸的乙腈-水梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0min→20min→45min→60min→75min→77min，乙腈3%→20%→20%→30%→80%→100%；流速1.0mL/min；检测波长为240－310nm；柱温30℃；进样量为2－20μL；得到枳实药材指纹图谱；

具体地，所述步骤（2）包括：

色谱柱填料为AgilentTC-C₁₈，规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相为含0.1%甲酸的乙腈-水梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0min→20min→45min→60min→75min→77min，乙腈3%→20%→20%→30%→80%→100%；流速1.0mL/min；检测波长为240-310nm；柱温30℃；进样量为20μL；得到枳实药材指纹图谱。

在上述条件下分析供试品或供试品溶液，得到枳实药材指纹图谱。

不拘于理论的限制，本发明人进行了大量的实验研究，在生成的谱图中提取不同波长段的色谱图，发现当检测波长为240－310nm时，得到的图谱5分钟前的杂质峰最小，样品特征峰最丰富。

本发明的另一方面涉及一种枳实药材HPLC指纹图谱，其由本发明中任一项所述的建立方法得到。

本发明的再一方面涉及一种枳实药材标准HPLC指纹图谱，其有17个共有特征峰，保留时间分别为：18.55min、20.07min、21.47min、21.76min、23.15min、27.64min、28.19min、29.78min、33.94min、37.03min、39.11min、43.42min、48.18min、65.71min、69.30min、74.43min和75.93min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<0.10%、<0.07%、<0.06%或<0.05%。

本发明中，枳实药材标准HPLC指纹图谱还可以为使用单批次或者多批次枳实道地药材并且按照本发明中任一项所述的建立方法得到的HPLC指纹图谱；可选地，将使用多批次枳实道地药材并且按照本发明中任一项所述的建立方法得到的HPLC指纹图谱通过平均数法或者中位数法制成对照谱图，作为枳实药材标准HPLC指纹图谱。

按照本发明提供的方法，测定了8批枳实药材，确定了17个共有特征峰。

不拘于理论的限制，对于共有峰的选取，可以通过指纹图谱相似度评价软件进行。

不拘于理论的限制，尽管药材的指纹图谱受很多因素影响，比如产地、炮制方法等，因此不能说如果不具有全部17个峰，就不是枳实药材。但可以肯定的是，如果图谱的全貌和标准图谱完全不能匹配，则可以认为是伪品。

本发明的再一方面涉及一种鉴别枳实药材质量的方法，包括将待检枳实药材的HPLC指纹图谱与枳实药材标准HPLC指纹图谱进行比较的步骤；具体地，所述待检枳实药材的HPLC指纹图谱为使用待检枳实药材并且按照本发明中任一项所述的建立方法得到；具体地，所述枳实药材标准HPLC指纹图谱为本发明所述的枳实药材标准HPLC指纹图谱。

根据本发明任一项所述的鉴别方法，其中，待检枳实药材的HPLC指纹图谱与枳实药材标准HPLC指纹图谱的相似度如果不低于0.85，则为质量合格；如果低于0.85，则为不合格；具体地，所述相似度通过国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件得到。

不拘于理论的限制，2010版药典中，一般是规定在给定检测条件下，样品与标准指纹图谱的相似度不低于某个值（这个值通常在0.85－0.95之间）（相似度的计算可以通过把标准品和样品的色谱图导入到相似度评价软件中进行），如果低于这个值（0.85），则认为其品质是不合格的。

本发明的再一方面涉及本发明的枳实药材HPLC指纹图谱和/或本发明的枳实药材标准HPLC指纹图谱在鉴别枳实药材真伪或者鉴别枳实药材质量（是否合格）中的用途。

本发明中，所述乙醇或者甲醇的含量或者浓度，如果没有特别说明，均为体积浓度或者体积百分含量。

有益效果：

1.将枳实药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差异。

2.该方法提取了一段波长的色谱图，可以更全面的反应样品的特征峰信息。

3.该方法稳定性和重现性较好。

4.适于对枳实药材真伪和品质进行鉴别。

附图说明

图1：第1批枳实药材的HPLC指纹图谱；其中1－17为枳实药材共有特征峰。可作为标准指纹图谱。

图2：8批样品根据中位数法生成的对照谱图；其中1－17为枳实药材共有特征峰。可作为标准指纹图谱。

图3：为实施例3中检测到的两批质量有问题的药材与标准指纹图谱对比图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：枳实药材HPLC指纹图谱的建立和验证

1、仪器与试药

岛津(SHIMADZU)LC20A高效液相色谱仪，配有LC-20AT二元泵、SPD-M20A二级管阵列检测器、CTO-20A柱温箱和SIL-20AC自动进样器、LCsolution色谱工作站管理软件以及在线脱气装置。

水为纯净水；甲醇及乙腈均为色谱纯；其余试剂为分析纯。

8批枳实药材均购自正规药店的道地药材（附带有根据药典的检测报告）。

2、枳实药材HPLC指纹图谱的建立

2.1供试品溶液的制备：称取第1批枳实药材10g，加入100mL蒸馏水回流提取2次，每次2h，过滤，合并两次滤液。适当浓缩后，加入无水乙醇，至乙醇含量为70%，均匀搅拌，静置过夜，离心（25min，2500rpm），用70%乙醇洗涤沉淀，离心（25min，2500rpm），合并上清，浓缩除醇，将得到的提取液冷冻干燥，得到枳实中等极性部位样品。精密称取上述样品0.0200g，用50%甲醇定容至10mL容量瓶中，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到枳实供试品溶液。

2.2高效液相色谱分析：色谱柱填料为AgilentTC-C₁₈，规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸）梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0min→20min→45min→60min→75min→77min，乙腈3%→20%→20%→30%→80%→100%；流速1.0mL/min；检测波长为240－310nm；柱温30℃；进样量为20μL。

得到第1批枳实药材的HPLC指纹图谱，如附图1。

如附图1所示，该指纹图谱有17个共有特征峰，保留时间分别为：18.55min、20.07min、21.47min、21.76min、23.15min、27.64min、28.19min、29.78min、33.94min、37.03min、39.11min、43.42min、48.18min、65.71min、69.30min、74.43min和75.93min，这17个特征峰构成了枳实药材的指纹特征，可作为枳实药材的标准指纹图谱。

另外，不拘于理论的限制，附图1最左边有一个较为明显的峰。这是因为在进行反相C₁₈HPLC分析时，所有极性较大，超过了C₁₈分离能力的样品都会在最前面出峰，这个峰通常是很多化合物的混合峰，通常被认为是杂质，无意义。

3、方法学验证：

3.1精密度试验：取2.1项供试品溶液按2.2项下条件连续6次进样，考察各个共有峰相对保留时间以及相对峰面积的RSD。结果显示，相对保留时间RSD<0.07%，相对峰面积RSD≦5.0%，精密度良好。

3.2稳定性试验：取2.1项供试品溶液按2.2项下条件，在0、2、4、6、12、24h分别进样，考察各个共有峰相对保留时间以及相对峰面积的RSD。结果显示，相对保留时间RSD<0.05%，相对峰面积RSD<5.0%，稳定相良好，可判断样品24h内基本稳定。

3.3重复性试验：按2.1项供试品溶液制备方法平行处理6份样品，按2.2项条件分别测定，考察各个共有峰相对保留时间以及相对峰面积的RSD。结果显示，相对保留时间RSD<0.06%，相对峰面积RSD≦6.5%，该方法重复性良好。

4、相似度评价：

按照上面的第2项中相同的方法得到第2－8批枳实药材的HPLC指纹图谱。均存在17个特征峰。8批样品根据中位数法生成的指纹谱图如附图2所示。

将8批样品的HPLC图谱导入国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件进行评价，所获得的相似度结果见下面的表1。

表1：相似度评价结果

由表1的结果可见，将第2批至第8批枳实药材按照上面的第2项中的方法重复进行实验，得到的指纹图谱与第1批的指纹图谱（附图1）相似度极高，并且与8批样品根据中位数法生成的指纹谱图（附图2）的相似度也极高。

实施例2：枳实药材HPLC指纹图谱中特征峰的定性鉴别

1、仪器和试药：Aglient1100液相色谱仪；Aglient6300IonTrap质谱仪；水为纯净水；甲醇及乙腈均为色谱纯；其余试剂为分析纯；药材购自正规药店。

2、色谱、质谱条件：色谱柱填料为AgilentTC-C₁₈，规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸）梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0min→20min→45min→60min→75min→77min，乙腈3%→20%→20%→30%→80%→100%；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量为5μL；离子源为ESI，负离子模式扫描，雾化器压力为40psi，干燥器流量为10.0L/min，离子源温度为350℃，质量扫描范围为200-1000。

3、特征峰定性鉴别结果：将获得的特征峰一级、二级质谱数据与参考文献比对，鉴定部分特征峰可能为下面的表2中所列化合物。

参考文献如下：

[1]贾强，白杨，马燕，彭维等.枳实和枳壳化学成分的HPLC-ESI-MS分析.中草药，2005，36(2):169-172.[2]李哲，宋瑞，徐风国，徐磊等.大鼠灌服枳实提取液后体内黄酮类代谢产物的LC-MS-MS分析.中国药科大学学报，2010，41(6):539-547.[3]柳文媛，周晨，闫翠敏，谢双陆等.HPLC-DAD-ESI-MS/MS法用于枳实提取物的化学成分分析及多组分同时定量测定（英文）.中国天然药物，2012，10(6):0456-0463.

表2的结果表明，本发明的标准指纹图谱中包含了枳实中已知的多个化合物，具有高度的可靠性。

另外，不拘于理论的限制，没有鉴定的峰有两种可能，一种是某个峰尽管在紫外检测器上响应很好，但不易被离子化，因此在质谱上可能没有响应；还有一种就是测定的某个峰质量数，通过文献未能检索到相对应的化合物。此外，其它没有鉴定的化合物，并不代表不重要，因此不能仅用表1中所列的9个特征峰进行药材的鉴别。

实施例3：标准指纹图谱在鉴别枳实药材中的应用

1、仪器与试药

岛津(SHIMADZU)LC20A高效液相色谱仪，配有LC-20AT二元泵、SPD-M20A二级管阵列检测器、CTO-20A柱温箱和SIL-20AC自动进样器、LCsolution色谱工作站管理软件以及在线脱气装置。

水为纯净水；甲醇及乙腈均为色谱纯；其余试剂为分析纯。

待检枳实药材为随机购买；标准样品为实施例1的第1批枳实药材。

2、枳实药材HPLC指纹图谱的测定

2.1供试品溶液的制备：称取枳实药材10g，加入100mL蒸馏水回流提取2次，每次2h，过滤，合并两次滤液。适当浓缩后，加入无水乙醇，至乙醇含量为70%，均匀搅拌，静置过夜，离心（25min，2500rpm），用70%乙醇洗涤沉淀，离心（25min，2500rpm），合并上清，浓缩除醇，将得到的提取液冷冻干燥，得到枳实中等极性部位样品。精密称取上述样品0.0200g，用50%甲醇定容至10mL容量瓶中，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到枳实供试品溶液。

2.2高效液相色谱分析：色谱柱填料为AgilentTC-C₁₈，规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸）梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0min→20min→45min→60min→75min→77min，乙腈3%→20%→20%→30%→80%→100%；流速1.0mL/min；检测波长为240－310nm；柱温30℃；进样量为20μL。

3、测定结果分析：测定了多批随机购买的枳实药材，检测到其中2批与第1批枳实药材的标准指纹图谱比对有明显的大峰缺失（如附图3，其中10号峰和12号峰缺失）。

另外，采用国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件的相似度评价。结果表明这两批药材与标准指纹图谱的相似度在0.3以下。

因此，可以判断该批次枳实药材质量不合格。

此外，根据实施例2提供的色谱峰定性鉴别结果，这两个峰分别是柚皮苷和新橙皮苷，是枳实中非常重要的两个黄酮类活性成分，这从另一个方面验证了上述“该批次枳实药材质量不合格”的结论是正确的。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (29)

1.一种枳实药材HPLC指纹图谱的建立方法，包括下述步骤：

(1)枳实供试品的制备，和

(2)高效液相色谱分析方法；

所述步骤(1)包括：

1)称取枳实药材，加入5－15倍量的蒸馏水回流提取1－5次，每次1－5h，所述倍量表示每克枳实药材中加入蒸馏水的毫升数；

2)将提取物过滤，合并滤液；将滤液浓缩，得到浓缩液；

3)向浓缩液中加入无水乙醇，至乙醇含量为50％－90％，均匀搅拌，静置1－24小时，离心，得到沉淀；

4)用50％－90％乙醇洗涤沉淀，离心，合并上清，浓缩除醇，将得到的提取液冷冻干燥，得到供试品；

所述步骤(2)包括：

色谱柱填料为AgilentTC-C₁₈；流动相为含0.1％甲酸的乙腈-水梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0min→20min→45min→60min→75min→77min，乙腈3％→20％→20％→30％→80％→100％；流速1.0mL/min；检测波长为240－310nm；柱温30℃；进样量为2－20μL；得到枳实药材指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其中，所述步骤(1)还包括：

5)精密称取供试品，用50％－90％的甲醇定容，以微孔滤膜过滤，得到枳实供试品溶液。

3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于如下的A－H项中的任意一项或者多项：

A.步骤1)中，加入8－12倍量的蒸馏水；

B.步骤1)中，回流提取2－4次；

C.步骤1)中，回流提取2－4小时；

D.步骤3)中，至乙醇含量为60％－80％；

E.步骤3)中，静置时间为5－15小时；

F.步骤4)中，乙醇浓度为60％－80％；

G.步骤3)和4)中，所述离心独立地为5－50min，1500－5000rpm；和

H.步骤5)中，甲醇浓度为60％－80％。

4.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤1)中，加入8、9、10、11或12倍量的蒸馏水。

5.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤1)中，回流提取2、3或4次。

6.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤1)中，回流提取2、3或4小时。

7.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤3)中，至乙醇含量为65％－75％。

8.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤3)中，至乙醇含量为60％、65％、70％、75％或80％。

9.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤3)中，静置时间为8-12小时。

10.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤3)中，静置时间为8、9、10、11或12小时。

11.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤4)中，乙醇浓度为65％－75％。

12.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤4)中，乙醇浓度为60％、65％、70％、75％或80％。

13.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤3)和4)中，所述离心独立地为15－30min，2000－300rpm。

14.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤3)和4)中，所述离心独立地为25min，2500rpm。

15.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤5)中，甲醇浓度为65％－75％。

16.根据权利要求3所述的建立方法，其中，步骤5)中，甲醇浓度为60％、65％、70％、75％或80％。

17.根据权利要求1所述的建立方法，其中，所述步骤(1)包括：

称取枳实药材10g，加入100mL蒸馏水回流提取2次，每次2h，过滤，合并两次滤液；适当浓缩后，加入无水乙醇，至乙醇含量为70％，均匀搅拌，静置过夜，25min，2500rpm离心，用70％乙醇洗涤沉淀，25min，2500rpm离心，合并上清，浓缩除醇，将得到的提取液冷冻干燥，得到供试品。

18.根据权利要求17所述的建立方法，其中，所述步骤(1)还包括：

精密称取供试品0.0200g，用50％甲醇定容至10mL容量瓶中，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到枳实供试品溶液。

19.根据权利要求1所述的建立方法，其中，所述步骤(2)包括：

色谱柱填料为AgilentTC-C₁₈，规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相为含0.1％甲酸的乙腈-水梯度洗脱；梯度洗脱条件为：0min→20min→45min→60min→75min→77min，乙腈3％→20％→20％→30％→80％→100％；流速1.0mL/min；检测波长为240-310nm；柱温30℃；进样量为20μL；得到枳实药材指纹图谱。

20.一种鉴别枳实药材质量的方法，包括将待检枳实药材的HPLC指纹图谱与枳实药材标准HPLC指纹图谱进行比较的步骤；所述待检枳实药材的HPLC指纹图谱为使用待检枳实药材并且按照权利要求1至19中任一项所述的建立方法得到；所述枳实药材标准HPLC指纹图谱选自如下的(1)至(3)中的任意一项：

(1)其有17个共有特征峰，保留时间分别为：18.55min、20.07min、21.47min、21.76min、23.15min、27.64min、28.19min、29.78min、33.94min、37.03min、39.11min、43.42min、48.18min、65.71min、69.30min、74.43min和75.93min；或者所述枳实药材标准HPLC指纹图谱17个共有特征峰的保留时间与上述列举的17个数值的RSD<0.10％；

(2)使用单批次或多批次枳实道地药材并且按照权利要求1至19中任一项所述的建立方法得到的枳实药材HPLC指纹图谱；和

(3)将使用多批次枳实道地药材并且按照权利要求1至19中任一项所述的建立方法得到的HPLC指纹图谱通过平均数法或者中位数法制成对照谱图。

21.根据权利要求20所述的鉴别方法，其中，所述枳实药材标准HPLC指纹图谱17个共有特征峰的保留时间与(1)中列举的17个数值的RSD<0.07％。

22.根据权利要求20所述的鉴别方法，其中，所述枳实药材标准HPLC指纹图谱17个共有特征峰的保留时间与(1)中列举的17个数值的RSD<0.06％。

23.根据权利要求20所述的鉴别方法，其中，所述枳实药材标准HPLC指纹图谱17个共有特征峰的保留时间与(1)中列举的17个数值的RSD<0.05％。

24.根据权利要求20-23任一项所述的鉴别方法，其中，待检枳实药材的HPLC指纹图谱与枳实药材标准HPLC指纹图谱的相似度如果不低于0.85，则为质量合格；如果低于0.85，则为不合格。

25.根据权利要求24所述的鉴别方法，其中，所述相似度通过国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件得到。

26.枳实药材HPLC指纹图谱和/或枳实药材标准HPLC指纹图谱在鉴别枳实药材真伪或者鉴别枳实药材质量中的用途；所述枳实药材HPLC指纹图谱由权利要求1至19中任一项所述的建立方法得到；所述枳实药材标准HPLC指纹图谱选自如下的(1)至(3)中的任意一项：

(1)其有17个共有特征峰，保留时间分别为：18.55min、20.07min、21.47min、21.76min、23.15min、27.64min、28.19min、29.78min、33.94min、37.03min、39.11min、43.42min、48.18min、65.71min、69.30min、74.43min和75.93min；或者所述枳实药材标准HPLC指纹图谱17个共有特征峰的保留时间与上述列举的17个数值的RSD<0.10％；

(2)使用单批次或多批次枳实道地药材并且按照权利要求1至19中任一项所述的建立方法得到的枳实药材HPLC指纹图谱；和

(3)将使用多批次枳实道地药材并且按照权利要求1至19中任一项所述的建立方法得到的HPLC指纹图谱通过平均数法或者中位数法制成对照谱图。

27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述枳实药材标准HPLC指纹图谱17个共有特征峰的保留时间与(1)中列举的17个数值的RSD<0.07％。

28.根据权利要求26所述的用途，其中，所述枳实药材标准HPLC指纹图谱17个共有特征峰的保留时间与(1)中列举的17个数值的RSD<0.06％。

29.根据权利要求26所述的用途，其中，所述枳实药材标准HPLC指纹图谱17个共有特征峰的保留时间与(1)中列举的17个数值的RSD<0.05％。