CN104777255B - 香附药材指纹图谱的构建方法及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种香附药材指纹图谱的构建方法及其检测方法，包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的配制；(3)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由16个共有特征峰构成的香附药材指纹图谱。本发明经大量实验和研究，确定了制备供试品溶液和对照品溶液的方法，及高效液相色谱仪的色谱条件的最优参数，由此构建出香附药材的指纹图谱。采用本申请方法构建的指纹图谱以及检测方法可以准确地鉴定香附药材，精密度高，且节约试剂。

Description

香附药材指纹图谱的构建方法及其检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种香附药材指纹图谱的构建方法及其检测方法。
背景技术
香附为莎草科植物莎草的干燥根茎。性辛，微苦，微甘，平。气香，味微苦。具有疏肝解郁，理气宽中，调经止痛之功效。用于肝郁气滞，胸肋胀痛，疝气疼痛，乳房胀痛，脾胃气滞，脘腹痞闷，胀满疼痛，月经不调，闭经痛经等症。
香附为干燥根茎入药，目前存在着多种根茎入药的香附已混淆品，例如水香附、竹节香附等，而现有技术中对于检测香附真伪的方法较为复杂，且结果误差较大。因此，有必要建立一种全面、直观、快速的检测方法。
发明内容
基于此，本发明提供了一种香附药材指纹图谱的构建方法。
具体的技术方案：
一种香附药材指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
精密称取α-香附酮对照品，加甲醇稀释，得对照品溶液；
(2)供试品溶液的配制：
精密称取香附药材粉末，加入甲醇，超声提取或回流提取20-40min，过滤，即得所述供试品溶液；
(3)测定：
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由16个共有特征峰构成的香附药材指纹图谱。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱方式；流速为0.8-1.2ml/min；检测波长为252-256nm；柱温23-27℃。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-45min，流动相A的体积百分数由40％变化至80％；45-60min，流动相A的体积百分数维持80％。
在其中一个实施例中，检测波长为254nm，柱温为25℃。
本发明的另一目的是提供一种香附药材指纹图谱的检测方法。
具体的技术方案如下：
一种香附药材指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
精密称取α-香附酮对照品，加甲醇稀释，得对照品溶液；
(2)供试品溶液的配制：
精密称取香附药材粉末，加入甲醇，超声提取或回流提取20-40min，过滤，即得所述供试品溶液；
(3)测定：
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，即得。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱方式；流速为0.8-1.2ml/min；检测波长为252-256nm；柱温23-27℃。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-45min，流动相A的体积百分数由40％变化至80％；45-60min，流动相A的体积百分数维持80％。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱方式为：0-45min，流动相A的体积百分数由40％变化至80％；45-60min，流动相A的体积百分数维持80％。；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm；柱温25℃。
本发明的有益效果如下：
本发明经发明人的大量实验和研究，确定了制备供试品溶液和对照品溶液的方法，及高效液相色谱仪的色谱条件的最优参数，由此构建出香附药材的指纹图谱。采用本申请方法构建的指纹图谱以及检测方法可以准确地鉴定香附药材，精密度高，且节约试剂。
附图说明
图1a为溶剂峰比较图；
图1b为标准品α-香附酮HPLC图；
图2为不同流动相HPLC图；
图3为流动相不同起始梯度HPLC图；
图4为流动相不同梯度HPLC图；
图5为不同流速HPLC图；
图6为不同柱温HPLC图；
图7为不同波长HPLC图；
图8为不同色谱柱HPLC图；
图9为六种提取溶剂HPLC图；
图10为不同提取体积HPLC图；
图11为不同种提取方法HPLC图；
图12为不同提取时间HPLC图；
图13为香附样品导出HPLC图谱；
图14为香附药材指纹图谱的对照谱图；
图15为实施例2待测药材的HPLC谱图。
具体实施方式
以下通过实施例对本申请做进一步阐述。
实施例1香附药材指纹图谱的构建方法
一、仪器、试药与材料
1、仪器
KQ－100B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；T-214型电子分析天平(Denver公司)；Waters e2695高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器(Waters公司)。
2、试剂
冰乙酸(色谱纯，天津市化学试剂研究所)；甲醇、乙腈(色谱纯，Honeywell公司)；水为超纯水。
对照品为α-香附酮对照品(供鉴别用,中国药品生物制品检定所，批号110748200507)
3、材料
香附药材(广州白云山星群(药业)股份有限公司提供，共8批，批号为XG1405-01、XG1307-01、XG1104-01、XG1111-02、20110501、20111201、广西、广东)
二、方法与结果
1、色谱条件
色谱柱：Kromasil 100-C18，250×4.6mm，以甲醇(A)-水(B)为流动相系统梯度洗脱(0-45min，40％→80％A；45-60min，80％A)，流速为1.0mL·min-1，检测波长254nm；柱温25℃，进样量10μL。
2、对照品溶液的制备
用微量进样器吸取α-香附酮对照品约50μl，加甲醇适量，配制每1ml含10μl的溶液，作为对照品溶液。
3、供试品溶液的制备
取香附药材粉末(过60目筛)约1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，密塞，称重，超声处理(功率160W,频率59kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
4、方法学考察
4.1溶剂峰的考察
取香附药材粉末(过60目筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，密塞，称重，超声处理(功率160W,频率59kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，HPLC分析香附药材样品和甲醇溶剂空白，得图1。
由图1a可知，通过比较甲醇和香附药材图谱，可以发现，溶剂对主要的色谱峰无太大影响。
图1b为α-香附酮对照品的标准HPLC谱图。
4.2流动相组成的选择
取香附药材粉末(过60目筛)约1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，密塞，称重，超声处理(功率160W,频率59kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液HPLC分析，流动相组成及梯度见表1，得图2。
表1 四种流动相组成信息
由图2可知,甲醇-水系统峰形较好，出峰较多，故选择甲醇-水系统，且香附药材主要集中在后30min出峰。
4.3流动相起始梯度的选择
表2 几种起始梯度信息
由图3可知，若选择起始梯度较小，10％开始，则前面梯度要变化较大使后面峰前移；若选择较大的起始梯度，40％开始，则前5min的峰挤一堆，应剔除。故选择40％A为起始梯度。
4.4梯度的确定
表3 不同梯度信息
由图4可知，选择保留时间适宜，分离度较好的梯度即XF13。
4.5流速的确定
由图5可知，流速为1.0ml/min时，图中主要峰的保留时间较为适宜且基线平稳，故选择流速为1.0ml/min。
4.6柱温的确定
如图6所示，柱温增加，出峰变快，保留时间前移，s峰前面的峰分离度变好，但s峰形变差，分离度降低，后面的峰容易挤一块，故选择25℃为最佳柱温。
4.7检测波长的考察
在上述色谱条件下，比较245、254、265、300和320nm五个波长下的特征峰，在254nm波长下出峰较多且特征峰明显，故选择254nm作为最佳吸收波长。结果见图7。
4.8色谱柱的考察
表4 不同色谱柱信息
由图8可知，Kromasil与Athena比其他两根色谱柱色谱峰的峰形及分离度要好，本实验选择Kromasil色谱柱。
4.9提取溶剂比较
取约1g香附药材粉末样品6份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇、75％甲醇、75％乙醇20ml，密塞，称重，超声处理(功率160W,频率59kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液HPLC分析主要色谱峰峰面积见表5，结果见图9。
表5 六种提取溶剂主要色谱峰峰面积
由图9及峰面积数据可知，随着提取溶剂极性增大，峰面积减小，因为香附中的主成分极性较小，故选择峰面积较大，提取效果最好的提取溶剂甲醇。
4.10提取体积比较
取约1g香附药材粉末样品4份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别加入甲醇10ml，20ml，25ml，30ml，密塞，称重，超声处理(功率160W,频率59kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液HPLC分析，主要色谱峰峰面积见表6，结果见图10。
表6 四种提取体积主要色谱峰峰面积
峰号 10ml 20ml 25ml 30ml 20*2 25*2.5 30*3
1 3108106 1541031 1230837 1034266 3082062 3077092.5 3102798
2 117925 55548 38178 44877 111096 95445 134631
3 231073 114165 90281 75822 228330 225702.5 227466
4 97392 48569 38111 32377 97138 95277.5 97131
5 94660 46225 37101 31018 92450 92752.5 93054
6 253543 126581 99442 85895 253162 248605 257685
7 616382 314060 245830 199955 628120 614575 599865
8 653669 319209 256255 213620 638418 640637.5 640860
9 120965 59918 47505 39860 119836 118762.5 119580
由图10及换算后的峰面积数据可知，10ml提取体积与30ml提取体积提取较完全。考虑节约溶剂，选择10ml为提取体积。
4.11提取方法比较
取约1g香附药材粉末样品2份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10ml，密塞，称重，分别密塞超声30min(功率160W，频率59kHz)和80℃水浴回流30min，放冷后，甲醇补重，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液HPLC分析，主要色谱峰峰面积见表7，结果见图11。
表7 两种提取方法主要色谱峰峰面积
结合图11和表7，超声与回流的提取效果相当，考虑方法的便捷，选择超声提取方式。
4.12超声提取时间的比较
取约1g香附药材粉末样品4份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，密塞，称重，分别超声处理(功率160W,频率59kHz)15、30、45和60分钟，放冷，再称定重量，用5甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液HPLC分析，主要色谱峰峰面积见表8，结果见图12。
表8 四种提取时间主要色谱峰峰面积
峰号 15min 30min 45min 60min
1 2945317 3046081 3110581 3195392
2 149475 155604 154075 164048
3 218845 225781 229008 237177
4 87351 92287 91441 94981
5 76945 80568 86642 88804
6 260311 267718 274047 280822
7 660102 708016 751581 712634
8 519293 531908 537184 546636
9 110874 116818 107564 112142
结合图12和表8，30min、45min和60min的提取效果相当，节约时间，选择超声提取30min。
5、方法学
色谱条件:
色谱柱：Kromasil 100-C18，250×4.6mm，以甲醇(A)-水(B)为流动相系统梯度洗脱(0-45min，40％→80％A；45-60min，80％A)，流速为1.0mL·min-1，检测波长254nm；柱温25℃，进样量10μL。
5.1精密度考察
取批号为XG140501的香附药材供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录色谱指纹图谱，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，符合要求。具体数据见表9、表10。
表9 相对保留时间精密度
峰号 1 2 3 4 5 RSD％
1 0.4376 0.4368 0.4364 0.4372 0.4374 0.033
2 0.5295 0.5295 0.5292 0.5296 0.5295 0.005
3 0.5472 0.5471 0.5466 0.5472 0.5470 0.024
4 0.5749 0.5749 0.5746 0.5749 0.5749 0.003
5 0.7947 0.7946 0.7943 0.7946 0.7949 0.015
6 0.8839 0.8838 0.8837 0.8839 0.8810 0.004
7 1 1 1 1 1 0
8 1.1174 1.1173 1.1176 1.1174 1.1172 0.012
9 1.2040 1.2018 1.2021 1.2016 1.2014 0.154
10 1.2138 1.2135 1.2139 1.2133 1.2130 0.046
11 1.26163 1.2612 1.2616 1.2610 1.2605 0.058
12 1.4532 1.4524 1.4525 1.4519 1.4514 0.088
13 1.5244 1.5231 1.5232 1.52295 1.5221 0.104
14 1.5750 1.5738 1.5738 1.5735 1.5727 0.104
15 1.6581 1.6564 1.6565 1.6563 1.6552 0.123
16 1.6836 1.6818 1.6819 1.6817 1.6806 0.128
表10 相对峰面积精密度
峰号 1 2 3 4 5 RSD％
1 0.1846 0.1788 0.1778 0.1821 0.1801 1.73
2 0.1976 0.1973 0.2061 0.1925 0.1972 0.15
3 0.1527 0.1516 0.1627 0.1547 0.1508 0.88
4 0.1517 0.1533 0.1543 0.1535 0.1563 2.11
5 0.2412 0.2352 0.2387 0.2367 0.2360 1.53
6 0.6024 0.5969 0.6075 0.6136 0.6184 1.86
7 1 1 1 1 1 0
8 0.2369 0.2477 0.2438 0.2421 0.2438 2.05
9 0.5149 0.5108 0.5106 0.5062 0.5028 1.68
10 0.3248 0.3315 0.3303 0.3305 0.3335 1.87
11 0.6967 0.6946 0.7005 0.7013 0.6893 0.76
12 13.2806 13.2367 13.2506 13.3405 13.1919 0.47
13 0.6496 0.6483 0.6470 0.6540 0.6451 0.49
14 1.0667 1.0546 1.0514 1.0554 1.0470 1.32
15 7.7258 7.7125 7.7268 7.7659 7.7071 0.17
16 0.7064 0.6948 0.6904 0.6872 0.6857 2.10
5.2重复性考察
取批号为XG140501的香附药材供试品6份，精密称定，按“供试品溶液制备方法”项下制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，以相对保留时间和相对峰面积的值为指标，计算其RSD，其RSD均小于3.0％，符合要求。具体数据见表11、表12。
表11 相对保留时间重复性
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD％
1 0.4352 0.4347 0.4356 0.4372 0.4368 0.4382 0.48
2 0.5289 0.5282 0.5287 0.5291 0.5289 0.5295 0.08
3 0.5451 0.54471 0.5459 0.5469 0.5467 0.5465 0.17
4 0.5740 0.5736 0.5741 0.5744 0.5744 0.5749 0.11
5 0.7937 0.7937 0.7937 0.7944 0.7941 0.7944 0.06
6 0.8835 0.8834 0.8833 0.8837 0.8835 0.8837 0.01
7 1 1 1 1 1 1 0
8 1.1176 1.1174 1.1176 1.1178 1.1177 1.1174 0.01
9 1.2022 1.2018 1.2020 1.2025 1.2024 1.2016 0.04
10 1.2139 1.2135 1.2137 1.2142 1.2142 1.2132 0.04
11 1.2618 1.2612 1.2615 1.2617 1.2621 1.2607 0.07
12 1.4540 1.4528 1.4529 1.4523 1.4526 1.4507 0.16
13 1.5249 1.5234 1.5238 1.5233 1.5238 1.5215 0.16
14 1.5760 1.5741 1.5744 1.5737 1.5741 1.5717 0.19
15 1.6583 1.6563 1.6568 1.6561 1.6572 1.6545 0.16
16 1.6836 1.6815 1.6820 1.6812 1.6824 1.6797 0.16
表12 相对峰面积重复性
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD％
1 0.1859 0.1834 0.1881 0.1842 0.1863 0.1934 2.77
2 0.2614 0.2560 0.2583 0.2372 0.2506 0.2515 2.75
3 0.17806 0.1811 0.1666 0.1638 0.1797 0.1808 1.10
4 0.1711 0.1701 0.1708 0.1560 0.1645 0.1674 1.56
5 0.2429 0.2409 0.2397 0.2317 0.2422 0.2408 0.61
6 0.5477 0.5438 0.5465 0.5061 0.5322 0.5539 0.80
7 1 1 1 1 1 1 0
8 0.2554 0.2535 0.2529 0.2518 0.2464 0.2470 2.35
9 0.5157 0.5126 0.5194 0.4922 0.5124 0.5143 0.20
10 0.3396 0.3380 0.3279 0.3221 0.3340 0.3296 2.12
11 0.7115 0.7000 0.6979 0.6666 0.7074 0.6984 1.32
12 13.4374 13.4677 13.2200 12.8852 13.5948 13.4356 0.01
13 0.6556 0.6604 0.6573 0.6448 0.6692 0.6665 1.17
14 0.1859 0.1834 0.1881 0.1842 0.1863 0.1934 0.52
15 0.2614 0.2560 0.2583 0.2372 0.2506 0.2515 0.03
16 0.17806 0.1811 0.1666 0.1638 0.1797 0.1808 2.44
5.3稳定性考察
取同一份供试品溶液，于室温下放置，分别在0、4、8、12、15、24h进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于3.0％，实验结果表明，供试品溶液在24h内稳定性良好。具体数据见表13、表14。
表13 相对保留时间稳定性
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD％
1 0.4382 0.4358 0.4352 0.4340 0.4343 0.4343 0.63
2 0.5295 0.5282 0.5281 0.5279 0.5281 0.5278 0.23
3 0.5465 0.5457 0.5456 0.5446 0.5451 0.5448 0.21
4 0.5749 0.5734 0.5733 0.5733 0.5733 0.5730 0.24
5 0.7944 0.7931 0.7937 0.7934 0.7933 0.7935 0.08
6 0.8837 0.8828 0.8832 0.8833 0.8832 0.8833 0.03
7 1 1 1 1 1 1 0
8 1.1174 1.1187 1.1178 1.1178 1.1177 1.1181 0.04
9 1.2016 1.2040 1.2025 1.2026 1.2026 1.2031 0.09
10 1.2132 1.2158 1.2142 1.2143 1.2142 1.2148 0.10
11 1.2607 1.2638 1.2620 1.2623 1.2621 1.2628 0.12
12 1.4507 1.4546 1.4534 1.4548 1.4541 1.4546 0.19
13 1.5215 1.5261 1.5245 1.5259 1.5252 1.5257 0.20
14 1.5717 1.5760 1.5751 1.5768 1.5761 1.5765 0.21
15 1.6545 1.6596 1.6580 1.6594 1.6587 1.6591 0.19
16 1.6797 1.6849 1.6833 1.6846 1.6839 1.6843 0.19
表13 相对峰面积稳定性
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD％
1 0.2545 0.2515 0.2530 0.2531 0.2634 0.2639 2.57
2 0.2431 0.2423 0.2248 0.2267 0.2538 0.2493 1.76
3 0.1808 0.1765 0.1548 0.1775 0.1810 0.1832 0.92
4 0.1563 0.1555 0.1567 0.1539 0.1623 0.1620 2.52
5 0.2352 0.2440 0.2396 0.2315 0.2534 0.2444 2.71
6 0.6094 0.5298 0.5316 0.6112 0.6393 0.6271 2.02
7 1 1 1 1 1 1 0
8 0.2443 0.2445 0.2439 0.2351 0.2507 0.2488 1.31
9 0.5171 0.5072 0.5138 0.5032 0.5382 0.5375 2.74
10 0.3296 0.3258 0.3272 0.3011 0.3403 0.3373 1.62
11 0.7095 0.7027 0.7002 0.6883 0.7341 0.7291 1.93
12 13.7132 13.4847 13.5107 13.1871 14.1492 14.0416 1.67
13 0.6665 0.6686 0.6646 0.6424 0.6853 0.68 1.35
14 1.1574 1.0939 1.1528 1.0591 1.1483 1.15 0.33
15 7.8385 7.8549 7.8136 0.7594 8.1132 8.03 1.73
16 0.6705 0.6735 0.6733 0.6264 0.6546 0.66 1.13
三、香附药材指纹图谱研究结果
1、所有样品
样品选用不同批次的香附药材，共10批，见表15。
表15 所有样品信息
2、香附药材图谱
使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)，导入样品后，参照图谱为S1，对照图谱生成方法采用平均数法，时间窗宽度分别设在0.1-0.5之间，相似度结果稳定，所以选择时间窗宽度为0.1，自动匹配生成对照谱图，整体输出见图13。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版，导入对照图谱，输出图像，得到图14。
从图13比较各批色谱图，均有稳定的16个峰，且分离度良好。因此确定此16个峰为共有峰。
3、计算相似度
计算所有10批药材的相似度依次为0.999、0.988、0.966、0.996、0.981、0.771、0.997、0.913、0.996、0.975，除批次为20111201的香附药材相似度为0.771外，其余批次相似度均大于0.9，说明香附药材样品具有良好相似性。
实施例2香附药材指纹图谱的检测方法
本实施例一种香附药材指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
用微量进样器吸取α-香附酮对照品约50μl，加甲醇适量，配制每1ml含10μl的溶液，作为对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
取待测药材粉末(过60目筛)约1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，密塞，称重，超声处理(功率160W,频率59kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
(3)测定：
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，即得。
高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱方式为：0-45min，流动相A的体积百分数由40％变化至80％；45-60min，流动相A的体积百分数维持80％。；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm；柱温25℃。
谱图如图15所示。
通过与图14比较，可知，该药材样品的指纹图谱与对照谱图的相似度为0.95，可以认为该药材样品为香附药材。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种香附药材指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
精密称取α-香附酮对照品，加甲醇稀释，得对照品溶液；
(2)供试品溶液的配制：
精密称取香附药材粉末，加入甲醇，超声提取或回流提取20-40min，过滤，即得所述供试品溶液；
(3)测定：
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由16个共有特征峰构成的香附药材指纹图谱；
高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱方式；流速为0.8-1.2ml/min；检测波长为252-256nm；柱温23-27℃；
所述梯度洗脱方式为：0-45min，流动相A的体积百分数由40％变化至80％；45-60min，流动相A的体积百分数维持80％。
2.根据权利要求1所述的香附药材指纹图谱的构建方法，其特征在于，检测波长为254nm，柱温为25℃。
3.一种香附药材指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
精密称取α-香附酮对照品，加甲醇稀释，得对照品溶液；
(2)供试品溶液的配制：
精密称取香附药材粉末，加入甲醇，超声提取或回流提取20-40min，过滤，即得所述供试品溶液；
(3)测定：
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，即得；
高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱方式；流速为0.8-1.2ml/min；检测波长为252-256nm；柱温23-27℃；
所述梯度洗脱方式为：0-45min，流动相A的体积百分数由40％变化至80％；45-60min，流动相A的体积百分数维持80％。
4.根据权利要求3所述的香附药材指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，水为流动相B，采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱方式为：0-45min，流动相A的体积百分数由40％变化至80％；45-60min，流动相A的体积百分数维持80％；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm；柱温25℃。
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