CN103837592A - 一种同位素稀释la-icp-ms原位测定生物组织样品中铁含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法，包括：对生物切片样品采用组织防脱材料构建样品边界的方式，在边界内加入定量的同位素稀释剂与组织样品进行同位素充分交换；优化了同位素稀释剂的添加方式、同位素平衡时间、以及原位的同位素比测量技术的条件；采用了同位素稀释法-LA-ICP-MS技术对均匀的山羊脑和牛肝组织切片样品中的铁进行了原位定量，其测量结果与微波消解-同位素稀释方法的测量结果相一致。本发明可进一步应用于临床中生物组织切片样品中金属元素的原位、微区定量测量及成像分析中，对于建立组织样品中铁元素的分布变化与典型神经性疾病的联系具有重要的临床意义。

Description

一种同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法

技术领域

本发明涉及无机质谱原位分析技术领域，尤其涉及一种同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法。

背景技术

激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)是在质谱检测的基础上结合激光剥蚀进样技术而成的一种固体微区分析新技术。该技术固体进样前处理相对简单，引入等离子体的干气溶胶较湿法进样干扰少，且其原位(in-situ)、微区、快速的分析优势，以及高灵敏度、低检出限、小于10μm空间分辨率、可进行多种元素含量和同位素组成测量的能力已成为生物医学研究中一种很有潜力的分析方法，近年来已成为质谱分析技术应用的前沿。在生物临床领域中的应用报道中，研究对象涉及植物、动物脑和其他生物组织切片样品等。然而，LA-ICP-MS技术在生物临床领域的应用中，由于目前与待测样品基体相匹配的标准物质或标准样品还十分匮乏，而该技术本身受样品基体效应、分馏效应、质量歧视效应影响又十分严重，导致LA-ICP-MS在准确定量测量方面存在较大困难。现阶段大多数LA-ICP-MS应用研究集中在对元素含量的相对测量，即用相对计数表示含量的大小，不能给出绝对量值，难以满足生物医学研究中对生物组织样品原位、微区元素分布准确定量分析的要求。

同位素稀释质谱法(IDMS)是国际公认的高准确度分析方法之一，如果能将灵敏、准确的同位素稀释技术与可以实现原位、微区分析的LA-ICP-MS相结合，将为解决LA-ICP-MS进行生物样品原位微区准确定量元素测量提供一条理想的途径。目前，基于IDMS技术LA-ICP-MS定量方法研究，主要包括两种方案：第一，固体稀释剂标记技术(solid-spiking fordirect analysis)。通过采用溶液稀释剂与固体样品混合、均匀化、干燥等步骤，使稀释剂与固体样品中待测元素发生同位素交换，制备出可用于标记待测固体样品的固体稀释剂，该固体稀释剂可以与待测样品混合、均匀、压片后，用于LA-ICP-MS测量的样品。该方法由于采用了IDMS技术，使得LA-ICP-MS在定量方面的准确性有所提高，减小了测量不确定度，然而却不能应用于组织切片的原位、微区分析。第二，溶液稀释剂在线引入技术。即通过溶液稀释剂在线引入到激光剥蚀样品池，在池中与剥蚀固体样品产生的气溶胶混合并发生同位素交换，混合气溶胶引入到ICP-MS中进行测量。这种方式制样过程相对简单，适用性较强，没有样品与稀释剂之间混合、均匀化的过程，因此可应用于组织切片样品的原位、微区定量分析。然而，此方法在应用中还存在两个技术难点，一是如何确定与待测样品发生反应的稀释剂质量；二是如何确定稀释剂与样品之间的同位素交换是否达到平衡。因此，迄今为止，将IDMS方法与LA-ICP-MS相结合，用于组织切片样品的原位、微区绝对定量分析还未见报道。

发明内容

为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法。本发明通过对生物切片样品采用组织防脱材料构建样品边界的方式，在边界内加入定量的同位素稀释剂与组织样品进行同位素充分交换；优化了同位素稀释剂的添加方式、同位素平衡时间、以及原位的同位素比测量技术的条件；采用同位素稀释法-LA-ICP-MS技术对实验室自行制备的均匀的山羊脑和牛肝组织切片样品中的铁进行了原位定量测量。本发明具有操作简便、定量结果准确可靠、重现性好等优点，克服了目前生物切片样品中金属元素难以进行原位定量分析的难题，适用于生物切片样品中金属元素的原位绝对定量分析。

本发明所述的方法，包括以下步骤：

(1)山羊脑和牛肝组织切片样品的制备：将山羊脑组织样品经过混合、匀浆，在-20℃下冷冻后，采用全自动冷冻切片机制作20～50μm厚的山羊脑组织切片样品；称取牛肝粉末标准样品分散在30％的明胶水溶液中，涡旋均匀化混合5分钟后，用移液管取样20～50μL滴加到载玻片上，室温下干燥后形成一个模拟的组织切片样品，由载玻片在滴加样品前后分别称重的质量变化得到模拟切片的质量；

(2)组织防脱边界的构建及同位素稀释剂的加入：使用免疫组化笔分别在山羊脑和牛肝组织切片周围绘制一个边界，用移液器往边界内的组织样品上分两次滴加约0.1～0.3g的浓缩⁵⁷Fe稀释剂溶液；

(3)组织切片样品与稀释剂达到同位素平衡的条件优化：采用组织防脱技术分别将4个山羊脑组织切片样品构建边界，然后在边界内滴加同位素稀释剂溶液，分别保持3，6，9，12分钟后，蒸干溶剂以控制同位素交换的时间，然后测定⁵⁶Fe／⁵⁷Fe的比值，根据计算的山羊脑组织切片样品中Fe元素含量，得到最佳的同位素平衡时间为3分钟；

(4)LA-ICP-MS测量经过同位素交换后的组织切片样品中⁵⁶Fe／⁵⁷Fe的比值及定量计算：激光剥蚀系统采用线扫描方式，平行测定5片组织样品，每片样品扫描4～7条线，每条线长度约为0.8～1.5cm；选取⁵⁶Fe和⁵⁷Fe做为待测同位素，根据同位素稀释法计算公式得到样品中铁元素的含量。

本发明所述的方法，所述步骤(3)中所用的⁵⁷Fe同位素稀释剂溶液采用去离子水作为溶剂。在同位素平衡过程中采用电加热板蒸发掉稀释剂中的溶剂，从而控制同位素交换的时间，待溶剂临近将蒸干时，放置室温下自然干燥待测。

本发明所述的方法，所述步骤(4)中激光烧蚀仪LSX213的工作条件为：激光能量2.0～4.5mJ／脉冲，扫描频率10～20Hz，光斑尺寸50～200μm，扫描速度30～60μm/s，烧蚀方式：线扫描。

本发明所述的方法，所述步骤(4)中电感耦合等离子体质谱仪Element2的分辨率为4000，消除同多原子离子⁴⁰Ar¹⁶O⁺对⁵⁶Fe⁺的谱线干扰；工作条件为：功率1100～1400W，样品气流速0.90～1.20L／min，辅助气流速1.00～1.40L／min，冷却气流速15～20L／min，采样时间0.01～0.03s，峰采集个数100～150。

采用上述技术方案，本发明可以达到的技术效果是：

(1)自主开发的“组织防脱边界的构建”方法操作简便、容易实现，成功在生物组织切片周围构建边界，使稀释剂完全附着在组织样品表面进行同位素交换而不会扩散，加入的稀释剂质量可由减量法获得。

(2)优化的稀释剂添加方式及同位素平衡的条件保证了既不破坏组织切片样品本身，又能实现样品与稀释剂间的充分同位素交换平衡，确保了原位同位素稀释法测量结果的有效性。

(3)采用同位素稀释LA-ICP-MS基准方法对组织切片中的铁元素进行了原位定量测定，保证了测量结果的准确性和可靠性。

附图说明

图1为实施例1山羊脑组织切片样品的制备过程图；

图2为实施例1LA-ICP-MS测定山羊脑组织切片样品中⁵⁶Fe、⁵⁷Fe的强度值(左)及⁵⁶Fe／⁵⁷Fe比值(右)结果图；

图3为实施例2牛肝模拟组织切片样品的制备过程图；

图4为实施例2LA-ICP-MS测定牛肝模拟组织切片样品中⁵⁶Fe、⁵⁷Fe的强度值(左)及⁵⁶Fe／⁵⁷Fe比值(右)结果图。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：

实施例1

实施例样品为实验室自行制备的山羊脑组织切片样品。

(1)山羊脑组织切片样品的制备：将100g山羊脑组织样品经过混合、匀浆，在-20℃下冷冻后，采用全自动冷冻切片机对脑组织进行切片，厚度为20μm，组织切片的质量可由载玻片在样品放置前后分别称重的质量变化得到，样品制备过程如图1。平行制备10片山羊脑组织切片样品，选取其中的5片用于进行ID-LA-ICP-MS分析，另外取平行制备的另外5片切片样品，将组织样品用塑料刀片刮下，收集后采用微波消解，采用同位素稀释HR-ICP-MS测量其中铁的含量。

(2)山羊脑组织切片样品“组织防脱边界”的构建及同位素稀释剂的加入：待组织切片称量后，使用免疫组化笔在组织切片周围绘制一个边界，用移液器往边界内的组织样品上分两次滴加约0.3g的浓缩⁵⁷Fe稀释剂溶液，通过这种方式，可以实现组织样品与稀释剂的同位素交换，且稀释剂不会扩散到周围载玻片上。在同位素平衡过程中采用电加热板蒸发掉稀释剂中的溶剂，从而控制同位素交换的时间，待溶临近将蒸干时，放置室温下自然干燥待测。

(3)组织切片样品与稀释剂达到同位素平衡的条件优化：采用组织防脱技术分别将4个山羊脑组织切片样品构建边界，然后在边界内滴加同位素稀释剂溶液，分别保持3，6，9，12分钟后，蒸干溶剂以控制同位素交换的时间，然后测定⁵⁶Fe／⁵⁷Fe的比值。根据同位素稀释法公式计算4个山羊脑组织切片样品中Fe元素含量分别为72.5±3.6mg.kg^-1，结果表明：在上述不同的同位素平衡时间中，样品与稀释剂均进行了充分的同位素交换，达到了同位素平衡，所以最终Fe元素含量的计算结果没有显著性差异(t检验，p＞0.05)，确定最佳同位素平衡时间为3分钟。

(4)LA-ICP-MS对样品进行测量：对经同位素交换过的山羊脑组织切片样品进行测量，产生的气溶胶直接输送到ICP炬管。平行测定5片组织样品，每片样品扫描5条线，每条线长度约为1cm，信号采集中⁵⁶Fe、⁵⁷Fe的强度值(左)及⁵⁶Fe／⁵⁷Fe比值(右)如图2所示。ICP-MS采用电感耦合等离子体质谱仪Element2，分辨率为4000，消除同多原子离子⁴⁰Ar¹⁶O⁺对⁵⁶Fe⁺的谱线干扰。工作条件为：功率1300W，样品气流速1.20L／min，辅助气流速1.00～1.40L／min，冷却气流速15L／min，采样时间0.01s，峰采集个数100。激光烧蚀仪LSX213的工作条件为：激光能量3.0mJ／脉冲，扫描频率20Hz，光斑尺寸50μrn，扫描速度40μm／s，烧蚀方式为线扫描。

(5)山羊脑组织样品中铁元素同位素稀释法结果的计算：

在IDMS方法中，选取的测量同位素为⁵⁶Fe和⁵⁷Fe，样品测定结果的计算公式为：

$\mathrm{Cy}=\frac{\mathrm{Rx}-\mathrm{Rb}}{\mathrm{Rb}-\mathrm{Ry}}\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{R}_{\mathrm{iy}}{M}_i}{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{RixMi}}\frac{\mathrm{mx}}{\mathrm{my}}\mathrm{Cx}$

式中：R_b、R_x、R_y分别表示混合样品(混合气溶胶)、稀释剂溶液和组织切片样品中Fe元素的⁵⁶Fe／⁵⁷Fe的比值；R_ix、R_iy分别表示Fe的每种同位素的丰度；M_i表示Fe的每种同位素的摩尔质量；C_x、C_y分别代表稀释剂和组织切片样品中Fe的浓度；m_x、m_y分别代表稀释剂溶液和组织切片样品的称样量。

(6)定量结果分析：对于山羊脑组织切片样品，因在制备过程中经过混合、均匀化等过程，其中的Fe的分布是均匀的，其含量还可以通过微波消解-同位素稀释的方法进行测量得到。因此，同位素稀释LA-ICP-MS原位测定的牛肝模拟组织切片中铁含量与微波消解-同位素稀释方法测量结果的比较见表1，可以看出两种定量方法的结果基本吻合，证明采用组织防脱材料构建样品边界的方式，在边界内加入同位素稀释剂与组织样品进行同位素充分交换后进行原位定量方法的可行。

表1山羊脑组织切片中铁含量的测定结果比较

实施例2

实施例样品为实验室自行制备的牛肝模拟组织切片样品。

称取0.3g的牛肝粉末标准样品分散在30％的明胶水溶液中，40℃下水浴加热，涡旋均匀化混合5分钟后，用移液管取样30μL滴加到载玻片上，室温下干燥后形成一个模拟的组织切片样品，由载玻片在滴加样品前后分别称重的质量变化得到模拟牛肝粉切片的质量，样品制备过程如图3。平行制备10片模拟牛肝组织切片样品，选取其中的5片用于进行ID-LA-ICP-MS分析，另外取平行制备的另外5片切片样品，将组织样品用塑料刀片刮下，收集后采用微波消解，采用同位素稀释HR-ICP-MS测量其中铁的含量。其它条件均与山羊脑组织切片样品的相同。LA-ICP-MS对同位素交换的牛肝模拟组织切片样品进行测量，采集得到样品中⁵⁶Fe、⁵⁷Fe的强度值(左)及⁵⁶Fe/⁵⁷Fe比值(右)如图4所示。

由于在制备过程中经过涡旋均匀化等过程，所以牛肝模拟组织切片样品中Fe的分布是均匀的，其含量还可以通过微波消解-同位素稀释的方法进行测量得到。同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量方法的有效性和可靠性通过比较与微波消解-同位素稀释的方法测量结果进行验证。表2所示为两种测量方法结果的比较，可以看出虽然ID-LA-ICP-MS得到测量精度稍大，二者的结果还是一致的，验证了本发明定量结果的准确可靠，为无机质谱定量蛋白质技术领域提供了切实可行的方法。

表2牛肝模拟组织切片中铁含量的测定结果比较

本发明通过对生物切片样品采用组织防脱材料构建样品边界的方式，在边界内加入定量的同位素稀释剂与组织样品进行同位素充分交换；优化了同位素稀释剂的添加方式、同位素平衡时间、以及原位的同位素比测量技术的条件；采用了同位素稀释法-LA-ICP-MS技术原位绝对定量了实验室自行制备的均匀的山羊脑和牛肝组织切片样品中的铁。本发明具有操作简便、定量结果准确可靠、重现性好等优点，克服了目前生物切片样品中金属元素难以进行原位定量分析的难题，适用于生物切片样品中金属元素的原位绝对定量分析。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各自变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法，其特征在于所述方法包括：对生物切片样品采用组织防脱材料构建样品边界的方式，在边界内加入定量的同位素稀释剂与组织样品进行同位素充分交换；优化了同位素稀释剂的添加方式、同位素平衡时间、以及原位的同位素比测量技术的条件；采用同位素稀释法-LA-ICP-MS技术对实验室自行制备的均匀的山羊脑和牛肝组织切片样品中的铁进行了原位定量测量。

2.根据权利要求1所述的同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法，其特征是按照以下步骤进行：

(1)山羊脑和牛肝组织切片样品的制备：将山羊脑组织样品经过混合、匀浆，在-20℃下冷冻后，采用全自动冷冻切片机制作20～50μm厚的山羊脑组织切片样品；称取牛肝粉末标准样品分散在30％的明胶水溶液中，涡旋均匀化混合5分钟后，用移液管取样20～50μL滴加到载玻片上，室温下干燥后形成一个模拟的组织切片样品，由载玻片在滴加样品前后分别称重的质量变化得到模拟切片的质量；

(2)组织防脱边界的构建及同位素稀释剂的加入：使用免疫组化笔分别在山羊脑和牛肝组织切片周围绘制一个边界，用移液器往边界内的组织样品上分两次滴加约0.1～0.3g的浓缩⁵⁷Fe稀释剂溶液；

(3)组织切片样品与稀释剂达到同位素平衡的条件优化：采用组织防脱技术分别将4个山羊脑组织切片样品构建边界，然后在边界内滴加同位素稀释剂溶液，分别保持3，6，9，12分钟后，蒸干溶剂以控制同位素交换的时间，然后测定⁵⁶Fe／⁵⁷Fe的比值，根据计算的山羊脑组织切片样品中Fe元素含量，确定最佳同位素平衡时间为3分钟；

(4)LA-ICP-MS测量经过同位素交换后的组织切片样品中⁵⁶Fe／⁵⁷Fe的比值及定量计算：激光剥蚀系统采用线扫描方式，平行测定5片组织样品，每片样品扫描4～7条线，每条线长度约为0.8～1.5cm；选取⁵⁶Fe和⁵⁷Fe做为待测同位素，根据同位素稀释法计算公式得到样品中铁元素的含量。

3.根据权利要求2所述的同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中所用的⁵⁷Fe同位素稀释剂的溶液采用去离子水作为溶剂，在同位素平衡过程中采用电加热板蒸发掉稀释剂中的溶剂，从而控制同位素交换的时间，待溶剂临近将蒸干时，放置室温下自然干燥待测。

4.根据权利要求2所述的同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法，其特征在于：所述步骤(4)中激光烧蚀仪LSX213的工作条件为：激光能量2.0～4.5mJ／脉冲，扫描频率10～20Hz，光斑尺寸50～200μm，扫描速度30～60μm／s，烧蚀方式：线扫描。

5.根据权利要求2所述同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法，其特征在于：所述步骤(4)中电感耦合等离子体质谱仪Element2的分辨率为4000，消除同多原子离子⁴⁰Ar¹⁶O⁺对⁵⁶Fe⁺的谱线干扰；工作条件为：功率1100～1400W，样品气流速0.90～1.20L／min，辅助气流速1.00～1.40L／min，冷却气流速15～20L／min，采样时间0.01～0.03s，峰采集个数100～150。

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