CN109725083A - 基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于气相色谱‑同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，包括如下步骤：(1)准备样品、待测目标物的标准品和同位素标记物；(2)根据样品中目标物的含量，配制与其含量接近的标准品溶液和同位素标记物溶液；(3)取一定量的样品，在样品中加入同等量的同位素标记物溶液，准确称量各自质量；采用单点法或括号法校准；按照同样的过程配制混合标准溶液；(4)将配制好的含有标记物的样品、标准混合溶液分别进行气相色谱‑红外光谱分析；(5)分析完成后，选取出峰时间段进行谱图累加，得到出峰时间段的红外光谱图，从红外光谱图上得到非标记的目标物与标记物特征峰处的红外吸光度；(6)计算样品中目标物的浓度。

Description

基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准 方法

技术领域

本发明涉及生物化学检测领域，特别是涉及一种基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法。

背景技术

计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，研究建立高准确度的测量方法是计量学研究的重要内容之一。基准测量方法是一种具有最高计量学品质的测量方法，其操作可以被完全地描述和理解，最终不确定度可以用SI单位表述，测量结果不依赖被测量的测量标准。基准方法是形成量值源头的依据。

随着生物技术的发展，生命科学已经经历了从“描述生物学”向“实验生物学”再向“创造生物学”发展的过程，当今的生命科学已经成为了精准分析和定量的科学。人们借助信息技术和工程学的帮助，依靠对生命体的各类生命现象的准确分析、精确定量，得以实现对生命体全方位的调控与干预。

通过建立量值溯源传递体系来保证检测结果的准确一致已经成为共识，是计量界的通行做法并在传统的物理计量与化学计量领域得到广泛和成功的应用。例如，美国国家计量院NIST通过胆固醇计划的实施建立了国内的胆固醇的量值溯源传递体系，使得临床胆固醇检测假阳性率从1949年的23.7％下降到2000年的3％，不仅每年可以节约近1亿美元的检测费用，而且极大程度的保护了国民健康。

量值溯源传递体系的建立一是要有量值的源头，二是要有量值传递方法，尤其是要有具有较高测量准确度的“基准”方法，才能保证国家基准复现的量值能够准确的传递到下一级的标准物质或工作计量器具上。因此，高准确度的计量方法研究在计量及量值溯源传递中具有举足轻重的作用。

1995年国际计量局物质的量咨询委员会(CCQM)首次会议上，国际计量局原局长T.J.Quinn对“基准方法”进行了定义：基准方法(Primary Method)是具有最高计量品质(也即最高的准确度)的方法，成为基准方法具有两个特征，第一是操作可以被完全地描述和理解，第二是不确定度可直接用SI单位(International System of Units)表述。因此，CCQM认定只有重量法、同位素稀释质谱法、库仑法、凝固点下降法和滴定法5种方法是基准方法。CCQM在1998年根据基准方法的定义，将基准方法进一步分为直接基准法和比例基准法。

直接基准法是指在测量未知物含量时不需要相同的标准作为参考，所得到的测量结果能够直接溯源至SI单位(如重量法和库仑法)。

比例基准法则是通过测量未知物与已知量的比例进行定量，需要以相同量的测量结果作为参考标准，其操作必须通过测量等式完全描述(如同位素稀释质谱法)。参考量的测量结果可以直接溯源至SI单位，与比例基准法结合后便可以保证测量结果能够直接溯源到SI单位。同时，如果一个方法的操作不能通过测量等式完全描述，则不能作为比例基准方法。

在基准方法的定义中“最高计量品质”要求基准方法的测量结果应具有足够小的测量不确定度，同时测量结果能够溯源至SI单位。而“不确定度表述”则要求方法的操作测量等式可以以SI单位进行表达，从而保证不确定度溯源的完整性。Quinn博士提出“用基准方法的定义测定物质的量是非常复杂的”。因此CCQM认为基准方法需要至少满足下述两个条件：首先，基准方法对定义的物质必须是特定的；其次，所有参数、依赖其他物质或基体的修正数值，必须是已知的或能以适当的不确定度进行计算。

在化学计量和生物计量上，最常用的计量基准方法是同位素稀释质谱法，该方法同样采用同位素标记化合物作为内标，通过在样品和标准中添加同位素标记物后采用单点法、括号法或标准曲线法对样品中的目标物含量进行测定。但是由于质谱采用的是离子光学系统，其稳定性不如光学系统，而且由于离子的空间电场效应，其动态范围受限制。因此，建立一种基于光谱技术的准确度更高、重复性更好的计量基准方法是尤为必要和迫切的。

发明内容

本发明建立了一种基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，该方法采用待测目标物的同位素标记物作为内标，与传统计量学基准方法——同位素稀释质谱法非常类似，可用单点法、括号法或标准曲线法计算样品中目标化合物的含量，符合计量基准方法的定义，是一种比例基准法。

本发明采用的技术方案具体如下：

一种基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，包括如下步骤：

(1)准备样品、待测目标物的标准品和同位素标记化合物；

(2)根据样品中目标物的含量，配制与其含量接近的标准品溶液和同位素标记化合物溶液。为了实现准确计量，通常采用天平称量即重量法配制上述溶液；

(3)取一定量的样品，在样品中加入同等量的同位素标记物溶液，准确称量各自质量。与配制样品与标记物混合物类似，将标准品溶液与标记物溶液混合得到混合标准溶液，准确称量各自质量；

(4)将配制好的含有标记物的样品、混合标准溶液分别进行气相色谱-红外光谱分析。由于同位素标记后相应化学键两端的原子质量差异，导致相应化学键键能的差异和伸缩、弯曲等振动的差异，引起化合物标记原子所在化学键的红外吸收谱图吸收峰波数产生位移，从而使得目标物与标记物虽然保留时间一致，但是吸收峰能够彼此区分；

(5)分析完成后，选取出峰时间段进行谱图累加，得到出峰时间段的红外光谱图，从红外光谱图上得到非标记目标物与标记物特征峰处的红外吸光度；

(6)如果采用单点法校准，根据公式1计算样品中目标物的浓度：

其中：

c——样品中目标物的质量浓度(g/g)；

m_r,std——标准中非标记与标记物的质量比；

I_r,s——样品中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

m_i——样品中加入的标记物的质量(g)；

I_r,std——标准中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

w——称量样品的质量(g)。

如果采用括号法校准，根据公式2计算样品中目标物的浓度：

其中：

c——样品中目标物的质量浓度(g/g)；

R_s——样品中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

I₁——低标中非标记与标记物的质量比；

I₂——高标中非标记与标记物的质量比；

m_i——样品中加入的标记物的质量(g)；

R₁——低标中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

R₂——高标中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

M——称量样品的质量(g)。

如果采用标准曲线法校准，根据系列标准品中非标记物与标记物的质量比与测得红外特征峰吸光度比绘制标准曲线，根据测定的样品中红外特征峰吸光度比在标准曲线上读出样品中非标记与标记物的质量比I_s，根据公式3计算样品中目标物的浓度：

式中：

c——样品中目标物的质量浓度(g/g)；

m_s——样品中加入的标记物的质量(g)；

M——称量样品的质量(g)；

I_s——标准中非标记与标记物的质量比。

其中，所述步骤(1)中：样品为容易气化的低沸点化合物，通常来说其沸点低于300℃，以保证其适合采用气相色谱进行分析。对于高沸点的化合物，可以采用衍生化的方式形成酯类等，降低化合物的沸点，使之适合于气相色谱的分离分析。同位素标记物为目标物的稳定同位素标记物，通常采用D、¹³C或¹⁵N进行标记。选取标记物的原则是标记后引起的质量差异足够大，从而可以导致目标物和对应的同位素标记物红外谱图上的特征吸收峰出现明显的位移，以便于后续的分析和结果计算。

其中，所述步骤(2)中，为了保证测量的准确度，充分发挥出基准方法高准确度的特点，采用重量法配制各个标准溶液和内标溶液，即各个溶质和溶剂都采用天平称量的方式，并根据称量的结果计算其质量浓度。配制的标准溶液中目标物的含量应当与样品中目标物的含量接近，通常差别不大于10％。

其中，所述步骤(3)中，当采用单点法校准时，取适量标准品溶液并加入同等量的同位素标记物溶液，准确称量各自质量并计算重量法配制的含量值，使其中非标记物与标记物的红外吸光度比值与样品中目标物与标记物红外吸光度比值接近。当采用括号法校准时，取与样品中同等加入量的标记物溶液和适量标准品溶液配制高标溶液，准确称量各自质量并计算重量法配制的含量值，使其中目标物与标记物的红外吸光度比值略高于样品中目标物与标记物的红外吸光度比值；按照同样的过程配制低标溶液，使其中目标物与标记物的红外吸光度比值略低于样品中目标物与标记物的红外吸光度比值；

混合标准溶液的配制需要将上述配制的目标物的标准溶液和同位素标记物溶液混合，这些混合标准溶液同样采用重量法配制。采用单点法或括号法分析时，还需要保证工作标准中目标物与标记物在红外光谱图上特征峰吸光度的比例与样品中的比例接近，通常比例差别不大于10％；括号法时还需低标的比例小于样品的比例，高标的比例大于样品的比例。

其中，所述步骤(4)中，红外光谱中目标物和标记物的特征峰应当有显著区分，否则应当重新选择同位素标记物。应当注意特征峰的出现可以是由于带有同位素标记原子的化学键直接振动导致的；也可以是由于相邻的原子中被同位素标记从而导致目标物与标记物中含有同样原子的键产生不同的红外振动频率，虽然这个化学键不含有同位素标记原子本身。

其中，所述步骤(5)中，气相色谱-红外光谱联用分析完成后，选取出峰时间段进行谱图累加，得到出峰时间段的红外光谱图，从红外光谱图上得到非标记与标记物特征峰的红外吸收强度。

其中，所述步骤(6)中，根据实验的方式，可采用单点法、括号法或标准曲线法按照公式1～3计算样品中目标物的含量。注意计算结果为质量浓度，如果要得到容量浓度，还需要测定溶液密度后进行换算。

本发明的气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物计量基准方法与现有同位素稀释质谱方法相比，其突出效果在于：

(1)本发明建立的气相色谱-同位素稀释红外光谱计量基准方法没有质谱的离子化过程，从而进一步降低了离子化过程中的由于离子抑制和歧视效应等引入的误差，提高了测量的准确度；

(2)本发明建立的气相色谱-同位素稀释红外光谱计量方法采用光学系统进行检测，测定的信号为红外光的吸光度，较质谱系统的离子光学系统更加稳定，从而具有优异的分析重复性；

(3)本发明建立的气相色谱-同位素稀释红外光谱法无需真空系统，光谱仪的价格也较质谱仪的价格便宜，因此整个方法的分析成本更低。

下面结合具体实施例对本发明的气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物计量基准方法作进一步说明。

附图说明

图1为标记与非标记的亚麻酸乙酯GC-IR分析谱图；

图2为非标记亚麻酸乙酯红外吸收光谱图；

图3为同位素标记亚麻酸乙酯红外吸收光谱图；

图4为标记和非标记亚麻酸乙酯红外吸收光谱的比较，椭圆圈处显示由于同位素标记造成的波数位移，非标记的特征吸收为2970cm^-1，标记的吸收为2983cm^-1。

具体实施方式

气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物计量基准方法：

结合图1-4所示，单点法校准：以正己烷为溶剂，分别配制亚麻酸乙酯和D₅-标记的亚麻酸乙酯溶液，重量法配制的理论浓度分别14.20mg/g和13.94mg/g。称取55.91mg非标记亚麻酸乙酯的溶液与60.29mg的标记亚麻酸乙酯溶液混合，作为模拟样品；同时称量58.62mg非标记亚麻酸乙酯溶液和62.26mg标记亚麻酸乙酯溶液混合，作为单点校准的标准品。将标准品和样品分别进行GC-IR分析，分别读取亚麻酸乙酯和同位素标记亚麻酸乙酯特征吸收峰即波数为2970cm^-1和2983cm^-1处对应的吸光度，计算标准品和模拟样品中红外吸收度的比值，并根据标准品中的亚麻酸乙酯和同位素标记亚麻酸乙酯的质量比，计算模拟样品中亚麻酸乙酯的浓度。根据测定值与实际配制值的差异，计算与理论值的相对误差；根据多次测量的结果，计算相对标准偏差作为重复性的表征。实验中，重复测定6次模拟样品，分析结果平均值与理论值的相对误差为0.40％，6次重复测定的相对标准偏差为0.35％，表现出很好的方法准确度与重复性。

括号法校准：以正己烷为溶剂，分别配制亚麻酸乙酯和D₅-标记的亚麻酸乙酯溶液，重量法配制的理论浓度分别14.20mg/g和13.94mg/g。称取58.62mg非标记亚麻酸乙酯的溶液与62.26mg的标记亚麻酸乙酯溶液混合，作为模拟样品；称量55.91mg非标记亚麻酸乙酯溶液和60.29mg标记亚麻酸乙酯溶液混合，作为校准时的低标溶液；同时称量67.11mg非标记亚麻酸乙酯溶液和60.32mg标记亚曼算乙酯溶液混合作为高标溶液。将高标溶液、低标溶液和样品分别进行GC-IR分析，分别读取亚麻酸乙酯和同位素标记亚麻酸乙酯特征吸收峰即波数为2970cm^-1和2983cm^-1处对应的吸光度，计算高标溶液、低标溶液和模拟样品中红外吸收度的比值，并根据公式2计算模拟样品中亚麻酸乙酯的浓度。根据测定值与实际配制值的差异，计算与理论值的相对误差；根据多次测量的结果，计算相对标准偏差作为重复性的表征。实验中，重复测定6次模拟样品，分析结果平均值与理论值的相对误差为3.9％，6次重复测定的相对标准偏差为4.2％，结果不如单点法校准。

标准曲线法校准：以正己烷为溶剂，分别配制亚麻酸乙酯和D₅-标记的亚麻酸乙酯溶液，重量法配制的理论浓度分别14.20mg/g和13.94mg/g。称量92.86mg非标记亚麻酸乙酯溶液和58.91mg标记亚麻酸乙酯溶液混合，作为模拟样品；同时按照下表称取适量的非标记亚麻酸乙酯溶液和标记亚麻酸乙酯溶液混合作为系列标准溶液。

标准品	亚麻酸乙酯质量/mg	D<sub>5</sub>-标记的亚麻酸乙酯溶液/mg
			STD1	5.06	51.922
STD2	29.211	54.477
			STD3	61.14	51.236
STD4	118.209	55.565
			STD5	150.061	58.526

将系列标准溶液和样品分别进行GC-IR分析，分别读取亚麻酸乙酯和同位素标记亚麻酸乙酯特征吸收峰即波数为2970cm^-1和2983cm^-1处对应的吸光度，计算标准溶液和模拟样品中红外吸收度的比值，并根据公式3计算模拟样品中亚麻酸乙酯的浓度。根据测定值与实际配制值的差异，计算与理论值的相对误差；根据多次测量的结果，计算相对标准偏差作为重复性的表征。实验中，重复测定6次模拟样品，分析结果平均值与理论值的相对误差为1.2％，6次重复测定的相对标准偏差为1.7％，结果也不如单点法校准。

为突出本发明实施例的效果，与传统技术采用的同位素稀释质谱法进行对比试验：

对比例1

以正己烷为溶剂，分别配制亚麻酸乙酯和D₅-标记的亚麻酸乙酯溶液，重量法配制的理论浓度分别14.20mg/g和13.94mg/g。称取60.52mg非标记亚麻酸乙酯的溶液与60.04mg的标记亚麻酸乙酯溶液混合，作为模拟样品；同时称量69.16mg非标记亚麻酸乙酯溶液和59.45mg标记亚麻酸乙酯溶液混合，作为单点校准的标准品。将标准品和样品分别进行GC-MS分析，分别读取亚麻酸乙酯和同位素标记亚麻酸乙酯分子离子峰m/z＝306.48和m/z＝311.48提取色谱图上色谱峰的峰面积，计算标准品和模拟样品中峰面积的比值，并根据标准品中的亚麻酸乙酯和同位素标记亚麻酸乙酯的质量比，计算模拟样品中亚麻酸乙酯的浓度。根据测定值与实际配制值的差异，计算与理论值的相对误差；根据多次测量的结果，计算相对标准偏差作为重复性的表征。实验中，重复测定6次模拟样品，分析结果平均值与理论值的相对误差为3.4％，6次重复测定的相对标准偏差为5.0％。

以上对比例和实施例进行试验结果对比，得出以下结论：

本发明的气相色谱-同位素稀释红外光谱法较传统的同位素稀释质谱法具有更好的准确度和重复性。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)准备样品、待测目标物的标准品和同位素标记物；

(2)根据样品中目标物的含量，配制与其含量接近的标准品溶液和同位素标记物溶液；

(3)取一定量的样品，在样品中加入同等量的同位素标记物溶液，准确称量各自质量；与配制样品和标记物混合物类似，将标准品溶液与标记物溶液混合得到混合标准溶液，准确称量各自质量；

(4)将配制好的含有标记物的样品、混合标准溶液分别进行气相色谱-红外光谱分析；

(5)分析完成后，选取出峰时间段进行谱图累加，得到出峰时间段的红外光谱图，从红外光谱图上得到非标记目标物与标记物特征峰处的红外吸光度；

(6)若采用单点法校准，根据公式1计算样品中目标物的浓度，

其中：

c——样品中目标物的质量浓度(g/g)；

m_r,std——标准中非标记与标记物的质量比；

I_r,s——样品中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

m_i——样品中加入的标记物的质量(g)；

I_r,std——标准中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

w——称量样品的质量(g)；

若采用括号法校准，根据公式2计算样品中目标物的浓度，

其中：

c——样品中目标物的质量浓度(g/g)；

R_s——样品中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

I₁——低标中非标记与标记物的质量比；

I₂——高标中非标记与标记物的质量比；

m_i——样品中加入的标记物的质量(g)；

R₁——低标中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

R₂——高标中非标记与标记物的红外特征吸收峰吸光度比；

M——称量样品的质量(g)；

若采用标准曲线法校准，根据系列标准品中非标记物与标记物的质量比与测得红外特征峰吸光度比绘制标准曲线，根据测定的样品中红外特征峰吸光度比在标准曲线上读出样品中非标记与标记物的质量比I_s，根据公式3计算样品中目标物的浓度，

式中：

c——样品中目标物的质量浓度(g/g)；

m_s——样品中加入的标记物的质量(g)；

M——称量样品的质量(g)；

I_s——标准中非标记与标记物的质量比。

2.根据权利要求1所述的基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，其特征在于：步骤(1)中，所述样品为易气化的低沸点化合物，其沸点低于300℃；对于高沸点的化合物，采用衍生化的方式形成酯类，降低化合物的沸点，使之适合于气相色谱的分离分析；同位素标记物为目标物的稳定同位素标记物，采用D、¹³C或¹⁵N进行标记；选取标记物的原则是标记后引起的质量差异足够大，其原则为标记后引起的红外位移波数不小于5cm^-1。

3.根据权利要求1所述的基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，其特征在于：所述步骤(2)中，采用重量法配制各个标准溶液和内标溶液，即各个溶质和溶剂都采用天平称量的方式，并根据称量的结果计算其质量浓度；配制的标准溶液中目标物的含量应与样品中目标物的含量接近，即差别不大于10％。

4.根据权利要求1所述的基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，其特征在于：所述步骤(3)中，当采用单点法校准时，混合标准溶液配制取适量标准品溶液并加入同等量的同位素标记物溶液，准确称量各自质量并计算重量法配制的含量值，使其中非标记物与标记物的红外吸光度比值与样品中目标物与标记物红外吸光度比值接近；

当采用括号法校准时，混合标准溶液配制取与样品中同等加入量的标记物溶液和适量标准品溶液配制高标溶液，准确称量各自质量并计算重量法配制的含量值，使其中目标物与标记物的红外吸光度比值略高于样品中目标物与标记物的红外吸光度比值；按照同样的过程配制低标溶液，使其中目标物与标记物的红外吸光度比值略低于样品中目标物与标记物的红外吸光度比值；

当采用标准曲线法校准时，混合标准溶液配制取与样品中同等加入量的标记物溶液和适量标准品溶液，保持标记物溶液的量基本不变，配制一系列不同的非标记目标物与标记物的混合溶液，使其中的非标记目标物与标记物的比例范围覆盖样品中的非标记物与标记物的比例；配制过程中准确称量各自质量并计算重量法配制的含量值。

5.根据权利要求1所述的基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，其特征在于：所述步骤(4)中，红外光谱中目标物和标记物的特征峰应当有显著区分，否则应当重新选择同位素标记物；

应当注意特征峰的出现可由带有同位素标记原子的化学键直接振动导致的；也可由相邻的原子中被同位素标记从而导致目标物与标记物中含有同样原子的键产生不同的红外振动频率。

6.根据权利要求1所述的基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，其特征在于：所述步骤(5)中，应选择在纵坐标为吸光度的方式下进行累加；若纵坐标为透过率，则应首先将其转换为吸光度以后，再进行谱图累加。

7.根据权利要求1所述的基于气相色谱-同位素稀释红外光谱的化合物含量计量基准方法，其特征在于：所述步骤(6)中，根据实验的方式，可采用单点法、括号法或标准曲线法按照公式1～3计算样品中目标物的含量；计算结果为质量浓度；如要得到容量浓度，还需测定溶液密度后进行换算。