CN109900623A - 一种单细胞中银纳米颗粒含量的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单细胞中银纳米颗粒含量的分析方法，包括：a)对含有银颗粒的单细胞阵列用同位素稀释剂进行处理，获得含有同位素稀释剂的单细胞阵列；b)采用激光剥蚀‑电感耦合等离子体质谱法(LA‑ICP‑MS)测定阵列中单细胞109Ag/107Ag的比值，根据所述109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量。本发明提供了一种在单细胞水平研究细胞与纳米材料相互作用的过程和机制，采用同位素稀释法结合LA‑ICP‑MS定量分析了单细胞中的银纳米颗粒的含量，定量分析结果准确，分析通量高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种单细胞中银纳米颗粒的分析方法。
背景技术
电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS方法)是以等离子体为离子源的一种质谱型元素分析方法，主要用于进行多种元素的同时测定。ICP-MS的工作原理是样品由载气(氩气)引入雾化系统进行雾化后，以气溶胶形式进入等离子体中心区，在高温和惰性气氛中被去溶剂化、汽化解离和电离，转化成带正电荷的正离子。正离子经离子采集系统进入质量分析器，质量分析器根据质荷比进行分离，然后根据元素质谱峰强度测定样品中相应元素的含量。ICP-MS方法目前已经广泛应用于各领域化学计量学的痕量元素分析。
激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法LA-ICP-MS是将激光剥蚀系统LA与ICP-MS联用的分析方法，是一种可以用于测定小体积固体样品中金属元素的组成和含量的技术。目前，LA-ICP-MS已经广泛应用于生物、地质、宝石、指纹和土壤等样品的分析。LA-ICP-MS作为一种成熟的元素分析和成像技术，可提供生物样品中元素分布的空间信息。
目前，已经有人将LA-ICP-MS应用于单细胞中金属含量的测定。但有如下瓶颈亟待解决：1)缺少合适的单细胞标准物质，而且由于基体效应和元素分馏等影响，难以准确定量：2)基于LA-ICP-MS的单细胞分析通量低。
同位素稀释法是目前常用的定量方法，它是在样品中加入已知浓度的同位素稀释剂，通过检测待测元素的同位素比值，计算出待测元素的浓度。同位素稀释法具有灵敏度高、准确度好以及不受基体干扰等特点。本发明人考虑，如果将同位素稀释法与激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱结合，则可以很好的解决单细胞中元素准确定量的难题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种单细胞中银纳米颗粒含量的分析方法，包括：
a)对含有银颗粒的单细胞阵列用同位素稀释剂进行处理，获得含有同位素稀释剂的单细胞阵列；
b)采用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法测定单细胞阵列中单细胞109Ag/107Ag的比值，根据所述109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量。
优选的，所述步骤b)包括：
用点激光剥蚀对含有同位素稀释剂的单细胞阵列进行处理；
选取109Ag、107Ag和31P作为待测同位素进行测量，计算得到109Ag/107Ag的比值，根据所述109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量。
优选的，所述点激光剥蚀进行处理时的剥蚀深度为15-25μm。
优选的，所述点激光剥蚀进行处理时激光能量为2.0J/cm2-3.0J/cm2，激光频率为8-15Hz，光斑尺寸为45μm-70μm。
优选的，所述步骤b)中用电感耦合等离子体质谱法进行处理的条件为功率1000-2000W、雾化气流速为0.8L/min-1.2L/min、辅助气流速为0.7L/min-1.2L/min。
优选的，所述计算得到109Ag/107Ag的比值，根据所述109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量，具体为：
根据公式(1)测量得到单细胞中银纳米颗粒的含量：
其中：msp，ms分别是稀释剂和单细胞中Ag元素的质量；Ab sp，Ab s分别为稀释剂和单细胞中同位素109Ag的丰度；Rsp，Rs，Rm分别为在稀释剂、单细胞和混合样品中同位素109Ag和同位素107Ag的比值。
优选的，所述步骤a)中同位素稀释剂为2％HNO3的109Ag溶液。
优选的，对含有银颗粒的单细胞阵列用同位素稀释剂进行处理具体为：
利用喷墨打印机将同位素稀释剂109Ag溶液打印到单细胞阵列上，溶液点与点之间的间距设定为150μm-240μm。
优选的，在步骤a)之前还包括制备带有银纳米颗粒的单细胞阵列的步骤。
优选的，所述制备带有银纳米颗粒的单细胞阵列的步骤具体为：
用磷酸盐缓冲溶液清洗微孔阵列，真空脱气后，在微孔中加入单细胞悬液，用磷酸盐缓冲液进行冲洗得到在微孔中的单细胞阵列。
本发明公开了一种单细胞中银纳米颗粒含量的分析方法。本发明先采用同位素稀释剂对含有银颗粒的单细胞阵列进行稀释，获得含有同位素稀释剂的单细胞阵列，然后采用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法测定单细胞中109Ag/107Ag的比值，根据所述109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量。本发明提供了一种在单细胞水平研究细胞与纳米材料相互作用的过程和机制，采用同位素稀释法结合LA-ICP-MS对单细胞中的银纳米颗粒进行了定量分析，具有定量结果准确、分析通量高的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明中利用同位素稀释法结合LA-ICP-MS高通量分析单细胞阵列样品的流程图；
图2为本发明中获得的单细胞阵列样品的照片；
图3为本发明分析单细胞和同位素稀释剂溶液的质谱图；
图4为本发明中的单细胞银含量的分布直方图。
具体实施方式
本发明提供了一种单细胞银纳米颗粒含量的分析方法。按照本发明，在制备单细胞时，优选使用RAW264.7细胞在培养瓶中本领域技术人员熟知的方式进行培养，包括但不限于用含有10％胎牛血清的高糖DMEM/F12培养。单细胞培养满足要求后，例如在培养瓶中覆盖达到70％以上，优选达到80％以上时，用胰蛋白消化传代，然后贴壁生长后，加入银纳米颗粒溶液孵育，银纳米颗粒溶液的浓度优选为2mg/L-5mg/L。单细胞与银纳米颗粒孵育完成后，优选用磷酸盐缓冲溶液PBS溶液(含有135mM NaCl，4.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMNaH2PO4，pH值为7.4)清洗细胞，随后用胰蛋白酶消化，收集细胞，再进行清洗，优选使用0.8％-1.0％NaCl溶液进行离心清洗，收集细胞后重新加入培养基悬浮成单细胞悬液，用细胞计数板计数细胞浓度。
按照本发明，制备单细胞阵列时，先将单细胞微孔阵列用磷酸盐缓冲溶液清洗，然后真空脱气。真空脱气后，加入前述制备的单细胞悬液，离心处理，优选使用磷酸盐缓冲溶液PBS清洗后，获得填充在微孔中的单细胞阵列。本发明提供的单细胞阵列，操作方法简单，易于实现，细胞捕获效率高。
按照本发明，制备单细胞阵列后，将同位素稀释剂溶液打印在单细胞阵列上，同位素稀释剂优选为109Ag溶液，溶剂优选为2-4％的HNO3溶液。将同位素稀释剂打印在单细胞阵列上时，优选使用商用喷墨打印机将同位素稀释剂109Ag溶液精确打印到单细胞阵列上，溶液点与点的间距优选与单细胞之间的间距一致。本发明提供的方法可以将同位素稀释剂溶液精确的、高通量的打印到单细胞阵列上，可以确保LA同时剥蚀单细胞样品和同位素稀释剂溶液。
按照本发明，将同位素稀释剂打印到单细胞阵上后，用LA-ICP-MS测定单细胞109Ag/107Ag的比值和定量计算。其中，激光剥蚀优选使用点剥蚀的方式。激光剥蚀系统NWR213的操作参数优选为：激光能量2.0J/cm2-3.0J/cm2、激光频率8-15Hz、光斑尺寸40-70μm，剥蚀深度优选为15-25μm，载气He流量优选为550mL/min-650mL/min。
按照本发明，电感耦合等离子体质谱NexION300D的操作参数为：功率优选为1000-2000W、雾化气流速优选为0.8L/min-1.2L/min、辅助气流速优选为0.7L/min-1.2L/min、冷却气流速优选为15L/min-20L/min、驻留时间优选为8ms-12ms，采集模式采用时间分辨。测试时，优选选用109Ag、107Ag、31P作为待测同位素，根据同位素稀释法计算公式得到单细胞中银元素的含量。LA-ICP-MS结合同位素稀释法能够对单细胞中的银纳米颗粒进行准确的定量分析，同时提高了LA-ICP-MS分析单细胞的通量。
本发明建立了一种同位素稀释法结合LA-ICP-MS定量分析单细胞中银纳米颗粒的方法。与现有技术相比，本发明定量分析结果准确，分析通量较高，克服了目前LA-ICP-MS在应用于单细胞分析时的技术瓶颈，同时适用于单细胞中其他金属纳米颗粒的准确定量分析。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
(1)单细胞样品的制备：RAW264.7细胞使用高糖DMEM/F12培养基培养，培养基中加入10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗溶液，在37℃90％湿度和5％CO2、95％空气的恒温培养箱中培养。RAW264.7细胞在培养瓶中培养至80-90％覆盖时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，贴壁生长24h后加入2mg/L的20nm银纳米颗粒溶液孵育12h。RAW264.7细胞与银纳米颗粒孵育完成后，首先用磷酸盐缓冲溶液PBS清洗细胞。随后，使用0.25％胰蛋白酶消化，1200rpm离心3min后收集细胞。然后，用0.9％NaCl溶液离心洗涤三次，收集细胞后重新加入培养基悬浮成单细胞悬液，用细胞计数板计数细胞浓度。
(2)单细胞阵列的制备：单细胞微阵列用PBS清洗，真空脱气30min后，取出加入密度为106个/mLRAW264.7单细胞悬液，2500rpm离心2min，PBS清洗去除多余细胞后，获得填充在微孔中的单细胞阵列。填充过程如图1所示，得到的单细胞阵列样品如图2所示。
(3)在单细胞阵列上打印同位素稀释剂溶液：利用商用喷墨打印机将同位素稀释剂109Ag溶液精确打印到单细胞阵列上，溶液点与点之间上下左右的间距设定为200μm，与单细胞之间的间距一致。
(4)LA-ICP-MS测定单细胞阵列样品：LA同时剥蚀单细胞和同位素稀释剂溶液点，经He气载入ICP-MS测定。分析单细胞的个数为1000个，其中109Ag、107Ag和31P的质谱图如图3所示。激光剥蚀系统NWR213的操作参数为：激光能量2.2J/cm2、激光频率10Hz、光斑尺寸60μm，剥蚀深度20μm，剥蚀方式为点剥蚀，载气He流量600mL/min，激光剥蚀采用点剥蚀方式。电感耦合等离子体质谱NexION300D的操作参数为：功率1600W，雾化气流速为1L/min，辅助气流速0.9L/min，冷却气流速为18L/min，驻留时间为10ms，采集模式-时间分辨。
(5)依据测定过的109Ag/107Ag的比值计算单细胞中银元素的含量，同位素稀释法计算公式如下：
公式(1)中，msp、ms分别是稀释剂和单细胞中Ag元素的质量；Ab sp，Ab s分别为稀释剂和单细胞中同位素109Ag的丰度；Rsp、Rs、Rm分别为在稀释剂、单细胞和混合样品中同位素109Ag和同位素107Ag的比值。
(6)已知20nm银纳米颗粒含有2.48×105个Ag原子，根据得到的每个细胞中的Ag含量，可以计算得到单细胞中银纳米颗粒的个数。选取109A、107Ag和31P作为待测同位素，根据待测同位素稀释法计算公式得到单细胞中银元素的含量，已知银纳米颗粒中的原子数，计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量。
(7)定量结果分析：利用同位素稀释法结合LA-ICP-MS分析1000个单细胞和酸消散3.0×106个细胞所得单细胞中Ag含量和银纳米颗粒个数的定量分析结果见表1，两种定量方法结果基本一致，单个细胞中Ag含量的分布直方图见图4。
表1细胞中Ag和银纳米颗定量结果
本发明通过使用喷墨打印机将同位素稀释剂打印到单细胞阵列上，同位素稀释剂与细胞样品完全平衡后，优化了同位素比测定的仪器参数。本发明采用同位素稀释法结合LA-ICP-MS定量分析了单细胞中的Ag和银纳米颗粒的个数，定量结果准确，分析的通量提高了5倍以上。
以上对本发明所提供的单细胞中银纳米颗粒的分析方法进行了详细介绍。本文中应用具体的实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种单细胞中银纳米颗粒含量的分析方法，包括：
a)对含有银颗粒的单细胞阵列用同位素稀释剂进行处理，获得含有同位素稀释剂的单细胞阵列；
b)采用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法测定单细胞阵列中单细胞109Ag/107Ag的比值，根据所述109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤b)包括：
用点激光剥蚀对含有同位素稀释剂的单细胞阵列进行处理；
选取109Ag、107Ag和31P作为待测同位素进行测量，计算得到109Ag/107Ag的比值，根据所述109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述点激光剥蚀进行处理时的剥蚀深度为15-25μm。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述点激光剥蚀进行处理时激光能量为2.0J/cm2-3.0J/cm2，激光频率为8-15Hz，光斑尺寸为45μm-70μm。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述步骤b)中用电感耦合等离子体质谱法进行处理的条件为功率1000-2000W、雾化气流速为0.8L/min-1.2L/min、辅助气流速为0.7L/min-1.2L/min。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述计算得到109Ag/107Ag的比值，根据所述109Ag/107Ag的比值计算得到单细胞中银纳米颗粒的含量，具体为：
根据公式(1)测量得到单细胞中银纳米颗粒的含量：
其中：msp，ms分别是稀释剂和单细胞中Ag元素的质量；Ab sp，Ab s分别为稀释剂和单细胞中同位素109Ag的丰度；Rsp，Rs，Rm分别为在稀释剂、单细胞和混合样品中同位素109Ag和同位素107Ag的比值。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤a)中同位素稀释剂为2％HNO3的109Ag溶液。
8.根据权利要求1至7任一项所述的分析方法，其特征在于，对含有银颗粒的单细胞阵列用同位素稀释剂进行处理具体为：
利用喷墨打印机将同位素稀释剂109Ag溶液打印到单细胞阵列上，溶液点与点之间的间距设定为150μm-240μm。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，在步骤a)之前还包括制备带有银纳米颗粒的单细胞阵列的步骤。
10.根据权利要求9所述的分析方法，其特征在于，所述制备带有银纳米颗粒的单细胞阵列的步骤具体为：
用磷酸盐缓冲溶液清洗微孔阵列，真空脱气后，在微孔中加入单细胞悬液，用磷酸盐缓冲液进行冲洗得到在微孔中的单细胞阵列。
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