CN103830744A - 一种缓释型鞣花酸-环糊精复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种缓释型鞣花酸的制备方法，制备一种以环糊精为缓释剂的鞣花酸-环糊精复合物。在碱性条件下，将鞣花酸以离子态溶于水中，加入一定量的环糊精,特定温度条件下，反应10-120min后，酸化，获得鞣花酸-环糊精沉淀，加入一定重量的助溶剂，经过超声融合反应后,用胶体磨粉碎,制成胶体溶液,经喷雾干燥制得白色粉末状产品。这种缓释型鞣花酸具有缓释时间长，有效释放时间达到120h；解决了鞣花酸难溶，不易为人体吸收的难题。体外肝癌细胞抑制效果比鞣花酸增强4倍以上。

Description

一种缓释型鞣花酸-环糊精复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种高效合成鞣花酸-环糊精包合物的工艺路线：在碱性条件下，将鞣花酸以离子态溶于水中，加入一定量的环糊精,一定温度条件下，隔绝氧气反应10-120min后，酸化，获得鞣花酸-环糊精沉淀，加入一定重量的助溶剂，经过超声融合反应后，用胶体磨粉碎，制成胶体溶液，经喷雾干燥制得白色粉末状产品。

背景技术

鞣花酸 (C₁₄H₆O₈ )又名并没食子酸、胡颓子酸，是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚组分。它是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。天然的鞣花酸存在于多种植物的果实中，呈反式没食子酸单宁结构，是一种良好的抗氧化剂，近十几年来, 人们就鞣花酸的抗突变、抗癌变效力及其对化学物质诱导癌变的抑制作用进行了相当多的研究。在对鼠和人体组织移植所做的体内和体外试验中, 鞣花酸表现出对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用。

                                                                

                          鞣花酸结构式

李淑琴等的“鞣花酸的生理功能及工艺开发研究现状”，《天然产物研究与开发》，Vol13,No5,P71-73。描述了鞣花酸的合成和应用情况。研究认为食物中的鞣花酸在体内的吸收是有限的。例如, 给小鼠口服鞣花酸发现只有少量被吸收, 这就阻止了机体组织与足够高浓度的鞣花酸接触而使之不能有效的作为一种体内抗癌剂。但如何高效的使用鞣花酸，或者如何提高其应用效果并未有人研究过。

环糊精的结构是公知的，环糊精是由6个或更多的吡喃葡萄糖分子形成的环状低聚糖的总称，由环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉所产生。 常见的环糊精有α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，δ-环糊精四种，组成它们的吡喃葡萄糖分子数为6，7，8，9。环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，在其空洞结构中，外侧上端（较大开口端）由C2和C3的仲羟基构成，下端（较小开口端）由C6的伯羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区。它的疏水性空洞内可嵌入各种有机化合物，形成包接复合物，并改变被包络物的物理和化学性质。

由于鞣花酸自身的特殊分子结构，使其特别难以和环糊精形成包埋复合物。

发明内容

为了克服现有鞣花酸使用上的不方便，如水溶性、脂溶性都差，难以为生物体吸收的问题，本发明目的之一在于提供一种鞣花酸-环糊精复合物，具有极佳的缓释效果和抗癌活性。

本发明所述的鞣花酸-环糊精复合物，其原料的重量配比为：鞣花酸：环糊精：水=1：1-20：10-200。

本发明所述的环糊精为α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精或δ-环糊精，优选β-环糊精，所述的β-环糊精结构如下所示：

本发明目的之二在于提供一种鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，为解决鞣花酸和环糊精融合度不佳的问题，本发明通过对鞣花酸进行预处理，再将处理后的鞣花酸和环糊精进行超声融合反应，配以合适的助溶剂，获得鞣花酸-环糊精复合物，优化了包埋工艺，解决鞣花酸难溶，不易为人体吸收的难题，以获得最佳的缓释效果和抗癌活性。

本发明所述的鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，其技术方案为：在碱性条件下，将鞣花酸以离子态溶于水中，加入配比量的环糊精,特定温度条件下，反应10-120min后，酸化，获得鞣花酸-环糊精沉淀，加入一定重量的助溶剂，经过超声融合反应后，加入一定数量的水，用胶体磨粉碎，制成胶体溶液，经喷雾干燥制得白色粉末状产品。

所述碱性条件通过添加以下一种或多种化合物于水中获：氨，碳酸钠，氢氧化钠，氢氧化钾；优化的碱性条件为PH值9-12。所述酸化使用的酸为以下一种或多种化合物：氯化氢，硫酸，硝酸，亚硫酸，酸化的PH值范围为3-6。

所述反应温度为10-70℃。

所述助溶剂为二甲亚砜、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种。添加量为鞣花酸-环糊精沉淀重量的5-8倍。

所述进行超声融合反应所用的超声波为频率为20kHz-1100kHz，功率为0.5-1.0W/cm的超声。优选频率为800kHz，功率为0.8W/cm的超声波。

所述制备方法更具体的合成方法为：

第一步，离子型鞣花酸水溶液的制备：将配方量的鞣花酸加入到如上配比量的的水中，搅拌成悬浮液，于10-70℃下，缓慢滴加一定浓度的碱性水溶液，控制PH值9-12，直到鞣花酸完全溶解于水中，形成透明的溶液；

本过程涉及的反应式如下：

第二步，鞣花酸-环糊精沉淀的制备:向上述反应溶液中加入配方量的环糊精，控制在10-70℃，搅拌反应10-120min，得到澄清透明的溶液；向该溶液中滴加一定浓度的酸，约30min加完，控制PH值3-6，获得鞣花酸-环糊精沉淀，沉淀经过真空抽滤，和母液分离，用水洗涤滤饼，100℃烘干备用；

本过程涉及的反应式如下：

 

第三步， 将获得鞣花酸-环糊精，加入配方量的助溶剂，室温下搅拌成糊状，放入到超声波发生容器中，室温下，用频率为20-1100kHz，功率为0.5-1.0W/cm的超声波处理上述混合物，进行超声融合反应30-60min后，向处理后的混合物中加入等比例溶剂的水，搅拌均匀后，加入胶体磨中，研磨成淡黄色胶体溶液，将制的的胶体溶液经过喷雾干燥机干燥，去除水份，获得白色鞣花酸-环糊精复合物粉末。

本方法制备的鞣花酸-环糊精复合物加入到肝癌细胞培养皿中，经过24小时培养后，取培养液经过高效液相色谱检测，其鞣花酸浓度仍有刚添时的50%，而相同添加鞣花酸的对比样中，鞣花酸已检测不出，具有明显的缓释效果；经体外肝癌细胞培养实验表明，可以有效提高鞣花酸抑制肝癌细胞生长的活性和延长抑制时间。

将等浓度的鞣花酸和本方法制备的鞣花酸-环糊精复合物加入到肝癌细胞培养皿中，经过48h培养后，经过半致死量对比实验，当鞣花酸-环糊精包合物的浓度是纯鞣花酸的四分之一时，仍可获得相同的抑制肝癌细胞的效果。

 本发明提供的鞣花酸包埋办法，具有包埋均匀，缓释时间长，工艺简单，收率高，是一种提高鞣花酸效能的良好方法。包埋后形成的鞣花酸-环糊精复合物具有性能稳定，易储存的特点。

附图说明

图1为鞣花酸-环糊精包合物和鞣花酸体外释放曲线；

图2为不同剂量鞣花酸-环糊精包合物和鞣花酸作用48h下人肝癌细胞生长曲线。

具体实施方式

实施例1

将5g 98%含量的鞣花酸加入到200ml的水的三口玻璃烧瓶中，搅拌成悬浮液，于30℃下，缓慢滴加10%浓度的氢氧化钠水溶液，控制PH值10-11，停止加氢氧化钠水溶液，此时鞣花酸完全溶解于水中，形成透明的溶液。

鞣花酸-β-环糊精沉淀的制备:

向鞣花酸水溶液中加入β-环糊精25g，控制在30-35℃，搅拌反应60min，得到澄清透明的溶液。向该溶液中滴加10%的氯化氢水溶液，控制PH值5-6，停止加氯化氢水溶液，此时，溶液中生成淡黄色的鞣花酸-环糊精沉淀，冷却到5℃，使沉淀完全，沉淀经过真空抽滤，和母液分离，用100ml水洗涤滤饼，100℃烘干得淡黄色固体粉末28g。

将上述获得鞣花酸-β-环糊精28g，加入140g二甲亚砜，室温下搅拌成糊状，放入到超声波发生容器中，室温下，用频率为800kHz，功率为0.8W/cm的超声波处理上述混合物，进行超声融合反应40min后，向处理后的混合物中加入140ml的水，室温下搅拌成糊状，加入胶体磨中，研磨成淡黄色胶体溶液，将制的的胶体溶液经过喷雾干燥机干燥，去除水份及溶剂，获得白色鞣花酸-β-环糊精包合物粉末30g,产品含水分6.7%，液相色谱测的产品鞣花酸含量为17.12%，鞣花酸回收率为98%。

实施例2 

将5克98%含量的鞣花酸加入到400毫升的水的三口玻璃烧瓶中，搅拌成悬浮液，于70℃下，缓慢滴加10%浓度的氢氧化钠水溶液，控制PH值11-12，停止加氢氧化钠水溶液，此时鞣花酸完全溶解于水中，形成透明的溶液。

鞣花酸-β-环糊精沉淀的制备:

向鞣花酸水溶液中加入β-环糊精40g，控制在30-35℃，搅拌反应60min，得到澄清透明的溶液。向该溶液中滴加10%的硫酸水溶液，控制PH值4-5，停止加硫酸水溶液，此时，溶液中生成淡黄色的鞣花酸-β-环糊精沉淀，冷却到5℃，使沉淀完全，沉淀经过真空抽滤，和母液分离，用100ml水洗涤滤饼，100℃烘干得淡黄色固体粉末42g。

将上述获得鞣花酸-β-环糊精42g，加入250g N,N-二甲基甲酰胺，50g丙酮的混合溶剂，室温下搅拌成糊状，放入到超声波发生容器中，室温下，用频率为1100kHz，功率为0.5W/cm的超声波处理上述混合物，进行超声融合反应50min后，向处理后的混合物中加入300ml的水，室温下搅拌成糊状，加入胶体磨中，研磨成淡黄色胶体溶液，将制的的胶体溶液经过喷雾干燥机干燥，去除水份，获得白色鞣花酸-β-环糊精包合物粉末45g，产品含水分9.5%，液相色谱测的产品鞣花酸含量为11.54%，鞣花酸回收率为96%。

实施例3

将5克98%含量的鞣花酸加入到1000毫升的水的三口玻璃烧瓶中，搅拌成悬浮液，于10℃下，缓慢滴加10%浓度的氢氧化钠水溶液，控制PH值9-10，停止加氢氧化钠水溶液，此时鞣花酸完全溶解于水中，形成透明的溶液。

鞣花酸-β-环糊精沉淀的制备.

向鞣花酸水溶液中加入β-环糊精100g，控制在30-35℃，搅拌反应60min，得到澄清透明的溶液。向该溶液中滴加10%的氯化氢水溶液，控制PH值3-4，停止加氯化氢水溶液，此时，溶液中生成淡黄色的鞣花酸-环糊精沉淀，冷却到5℃，使沉淀完全，沉淀经过真空抽滤，和母液分离，用100ml水洗涤滤饼，100℃烘干得淡黄色固体粉末94g。

将上述获得鞣花酸-β-环糊精94g，加入750g丙酮，室温下搅拌成糊状，放入到超声波发生容器中，室温下，用频率为20kHz，功率为1.0W/cm的超声波处理上述混合物，进行超声融合反应60min后，向处理后的混合物中加入750ml的水，室温下搅拌成糊状，加入胶体磨中，研磨成淡黄色胶体溶液，将制的的胶体溶液经过喷雾干燥机干燥，去除水份及溶剂，获得白色鞣花酸-β-环糊精包合物粉末95g,产品含水分5.0%，液相色谱测的产品鞣花酸含量为4.43%，鞣花酸回收率为80%。

实施例4：鞣花酸-环糊精包合物抑制肝癌细胞生长实验。

实验材料和药物：

（1）药物：本发明所制备的鞣花酸-环糊精包合物和常规制备的鞣花酸，分别取适量溶于DMSO，分装备用；

（2）细胞株的选用和培养：人肝癌细胞HepG2，采用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1%谷氨酰胺的DMEM培养液，置37℃，5%CO₂和100%饱和湿度的细胞培养箱培养。

实验方法

（1）鞣花酸释放率测定：取适量鞣花酸-环糊精包合物粉末溶于DMSO，加入到细胞培养液中，温度保持在37℃，分别在0h，6h, 12h，24h，48h，72h，96h，120h取样，经高效液相色谱检测游离鞣花酸浓度。同时设同浓度的常规鞣花酸组（以普通鞣花酸加入细胞培养液）作为对照。累计释放率%=(∑

V)／M，式中

为释放液的平均浓度，V为释放液体积，M为鞣花酸-环糊精包合物中鞣花酸的总质；

（2）MTT法测定细胞生存率：人肝癌HepG2细胞以4×10³每孔的密度接种于96孔细胞板，培养16-20h，调整鞣花酸-环糊精包合物浓度，使有效鞣花酸浓度为0，15，30，45，60和75μM，处理细胞48h后，以MTT法测定细胞生存率。同时设同浓度的常规鞣花酸组（以普通鞣花酸处理细胞）。以DMSO（溶剂）处理的细胞作为对照。生存率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

结果

（1）鞣花酸-环糊精包合物在体外6h内释放超过50%，在24h释放达72%，之后逐渐缓慢、稳定释放，随时间增加，累计释放率逐渐增加。而普通鞣花酸，加入细胞培养液48h内浓度迅速下降，至120h时鞣花酸浓度不及初始浓度的10%。检测结果见图1所示；

（2）与细胞共孵育48h后，鞣花酸-环糊精包合物和普通鞣花酸均明显抑制人肝癌HepG2细胞的生长，鞣花酸-环糊精包合物IC₅₀仅为普通纯鞣花酸的四分之一，显示出更好的细胞毒活性，且具有显著性差异。检测结果见图2所示。

以DMSO（溶剂）处理的细胞生存率作为100%，平均数±SD，*P＜0.05，鞣花酸-环糊精包合物和普通鞣花酸相比较。

结论

从上述实验结果可以看出，与纯鞣花酸相比，本发明所述的鞣花酸-环糊精包合物具有明显的缓释效果，在体外对肝癌细胞生长抑制作用更强、抑瘤持续时间也更长。

上述内容，仅是本发明代表性实施例，并非对本发明作任何形式的限制，凡是根据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种缓释型鞣花酸-环糊精复合物，其特征在于，其原料的重量配比为：鞣花酸：环糊精：水=1：1-20：10-200。

2.根据权利要求1所述的缓释型鞣花酸-环糊精复合物，其特征在于，所述的环糊精为α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精或δ-环糊精，优选β-环糊精。

3.权利要求1或2所述的缓释型鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，其特征在于，在碱性条件下，将鞣花酸以离子态溶于配方量的水中，加入配比量的环糊精,特定温度条件下，反应10-120min后，酸化，获得鞣花酸-环糊精沉淀，加入一定重量的助溶剂，经过超声融合反应后，加入一定数量的水，用胶体磨粉碎，制成胶体溶液，经喷雾干燥制得白色粉末状产品。

4.根据权利要求3所述的缓释型鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，其特征在于，所述碱性条件通过添加以下一种或多种化合物于水中获：氨、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；优化的碱性条件为PH值9-12。

5.根据权利要求3所述的缓释型鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，其特征在于，所述酸化使用的酸为以下一种或多种化合物：氯化氢、硫酸、硝酸或亚硫酸；酸化的PH值范围为3-6。

6.根据权利要求3所述的缓释型鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，其特征在于，所述反应温度为10-70℃。

7.根据权利要求3所述的缓释型鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，其特征在于，所述助溶剂为二甲亚砜、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；添加量为鞣花酸-环糊精沉淀重量的5-8倍。

8.根据权利要求3所述的缓释型鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，其特征在于，所述进行超声融合反应所用的超声波为频率为20kHz-1100kHz，功率为0.5-1.0W/cm的超声。

9.权利要求4-8任一项所述的缓释型鞣花酸-环糊精复合物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

第一步，离子型鞣花酸水溶液的制备：将配方量的鞣花酸加入到如上配比量的的水中，搅拌成悬浮液，于10-70℃下，缓慢滴加一定浓度的碱性水溶液，控制PH值9-12，直到鞣花酸完全溶解于水中，形成透明的溶液；

第二步，鞣花酸-环糊精沉淀的制备:向上述反应溶液中加入配方量的环糊精，控制在10-70℃，搅拌反应10-120min，得到澄清透明的溶液；向该溶液中滴加一定浓度的酸，约30min加完，控制PH值3-6，获得鞣花酸-环糊精沉淀，沉淀经过真空抽滤，和母液分离，用水洗涤滤饼，100℃烘干备用；

第三步，将获得鞣花酸-环糊精，加入配方量的助溶剂，室温下搅拌成糊状，放入到超声波发生容器中，室温下，用频率为20-1100kHz，功率为0.5-1.0W/cm的超声波处理上述混合物，进行超声融合反应30-60min后，向处理后的混合物中加入等比例溶剂的水，搅拌均匀后，加入胶体磨中，研磨成淡黄色胶体溶液，将制的的胶体溶液经过喷雾干燥机干燥，去除水份，获得白色鞣花酸-环糊精复合物粉末。

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