CN103823034A - 一种金银花对照提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药提取物和中药质量控制技术领域，特别涉及一种金银花对照提取物，含有质量比例为0.20~0.40:1.00:0.30~0.50:0.15~0.45:0.10~0.40:0.15~0.45的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C，总质量分数超过70%。制备方法：水提醇沉得到粗提物；粗提物溶解调节pH为酸性，离心；上清液用大孔吸附树脂柱、硅胶柱、凝胶柱分离达到目标含量。本发明的金银花对照提取物，目标成分含量高，可作为混合对照品使用，用于处方中含有金银花的中药的质量控制，进行准确地定性定量测定，检测高效、成本低，结果准确；制备成本较低。

Description

一种金银花对照提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药提取物和中药质量控制技术领域，特别涉及一种金银花对照提取物，还涉及金银花对照提取物的制备方法。

背景技术

现行中药标准中，单一成分控制质量的模式难以很好地反映中药质量，采用多成分或特征色谱峰群综合控制质量的方法越来越引起人们的重视。然而，商品化对照品的供不应求和高昂的检测成本限制了多成分质量控制在实际生产、科研和监管领域的应用。使用对照提取物既可以解决单体对照品制备难度大、紧缺的问题，又可以达到多指标成分控制的目的，对中药的质量控制和标准执行都具有十分重要的意义。

金银花药用历史悠久，为常用的清热解毒药。临床报道多用于内外科炎症，如治疗肺结核并发呼吸道感染，肺炎，急性细菌性痢疾，婴幼儿腹泻，子宫颈糜烂，眼科急性炎症，外科化脓性疾患以及荨麻疹等。咖啡酰奎宁酸类成分是其主要抗菌有效成分，主要以绿原酸和异绿原酸B形式存在，在制备金银花提取物和制剂过程中，上述两种成分发生异构化，部分转化为新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C，并且达到一定比例。

现行药品标准中，处方中含有金银花的中药一般仅以绿原酸作为指标成分，控制金银花的投料。例如，《中国药典》2010年版一部品种银黄口服液等，《中国药典》2010年版第一增补本品种银黄颗粒、银翘解毒片、银翘解毒软胶囊等。但是，绿原酸是一种多种植物共有的成分，甚至在废弃烟叶中也能分离得到，提取率达到1.71%。所以，仅以绿原酸作为质量控制指标成分，控制这些中药的质量显然是不够的，会给制假分子以可乘之机，以绿原酸代替金银花药材进行投料。药品质量监管部门也认识到这一问题，《中国药典》2010年版第二增补本品种银黄片以及金银花提取物的[鉴别]项对上述6种咖啡酰奎宁酸均作出了规定。但其[含量测定]项下，仍仅对绿原酸的含量进行了规定，这并不能制止少投料的问题。为了杜绝该类中药制剂存在的金银花药材不投料、少投料的问题，应该同时控制其中6种咖啡酰奎宁酸的含量。

由于这些成分在纯化过程中容易相互转化，难以获得高纯度的单体化合物，导致单一对照品价格昂贵，限制了用常规外标法来实现其含量测定的设想。我们课题组研究出一种一测多评法（QAMS）对银黄片中6种咖啡酰奎宁酸的含量测定。QAMS采用仅测定一个价廉、易得的成分，实现多成分同步测定的模式，克服了多指标质量控制面临的对照品短缺和高昂检测成本问题。但研究中发现，该方法也存在一些问题，比如相对校正因子引入的误差、待测成分色谱峰不易准确定位等。

《中国中药杂志》第38卷第13期第2147页有刘绍勇、张文明等发表的文章《对照提取物用于金银花药材的质量控制方法研究》，公开了使用金银花对照提取物对金银花药材进行检测的方法，其对照提取物中主要含有新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C等6种成分，与含金银花提取物的制剂（如银黄片）所含的6种咖啡酰奎宁酸类成分不尽相同，缺少隐绿原酸，因而不能全面控制该类成分在制剂中的含量。并且其中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分的质量分数分别为 3.81%、11.29%、20.99%、4.63%、7.04%、17.02%，质量比例约为0.34:1.00:1.86:0.41:0.62:1.51，与制剂中的相应成分比例相差悬殊。测定同一制剂中上述成分含量时，使用同一对照提取物溶液，其中的某些成分可能会超出线性范围，影响测定结果的准确性。综上，为了全面、准确地控制含有金银花提取物的药品制剂质量，需要制备含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分，并且其比例与制剂相仿的金银花对照提取物。

发明内容

为了解决以上现有技术中对金银花提取物及其药品制剂检测中存在的检测标准不全面、使用多种对照品检测成本高的问题，本发明提供了一种可以同时对金银花提取物及其药品制剂中的6种咖啡酰奎宁酸类成分进行检测的金银花对照提取物，可用于处方中含有金银花的中药的质量控制，对上述6种成分进行准确地定性、定量测定。

本发明还提供了所述金银花对照提取物的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种金银花对照提取物，含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分，其质量比例为0.20~0.40:1.00:0.30~0.50:0.15~0.45:0.10~0.40:0.15~0.45，6种成分占金银花对照提取物的总质量分数超过70%。

所述的金银花对照提取物，优选新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分的质量百分含量分别为8.41%、29.65%、12.05%、9.92%、6.32%、11.91%。

所述的金银花对照提取物，优选新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分的质量百分含量分别为9.50%、30.59%、9.92%、13.50%、6.45%、5.94%。

所述的金银花对照提取物的制备方法，包括以下步骤：

（1）取药材金银花，加水煎煮三次，三次分别加重量5~10倍的水煎煮0.5~1小时，煎液滤过，滤液合并，减压浓缩至70℃时相对密度为1.13～1.18的浓缩液；浓缩液中加入乙醇，搅拌均匀，静置12~24小时，取上清液减压回收乙醇，干燥即得金银花粗提物；

（2）将金银花粗提物加水混匀，粗提物与水的重量比为1：1~5，超声处理30~60分钟，调节pH为酸性，混匀，离心得上清液；

（3）取步骤（2）离心后得到的上清液，以大孔吸附树脂柱分离，金银花粗提物与大孔树脂填料重量体积比例为1kg：20~30L，以水为洗脱剂，洗脱2~3柱体积，弃去洗脱液，然后以甲醇或乙醇溶液洗脱3~4柱体积，收集洗脱液，减压回收溶剂得干浸膏；

（4）取步骤（3）得到的干浸膏，加甲醇或乙醇溶液溶解，用硅胶柱分离，所得目标洗脱液减压回收溶剂得干浸膏；

（5）取步骤（4）得到的干浸膏，加甲醇或无水乙醇溶解，用凝胶柱分离，所得目标洗脱液减压回收溶剂得干浸膏；

（6）取步骤（5）得到的干浸膏，重复步骤（5）1~3次，以HPLC外标法分别测定6种目标成分的含量，直至新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分质量比例关系为0.20~0.40:1.00:0.30~0.50:0.15~0.45:0.10~0.40:0.15~0.45，并且其总质量分数超过70%。

所述的制备方法，优选步骤（1）浓缩液中加入乙醇的量为浓缩液体积的1~1.5倍。

所述的制备方法，优选步骤（2）调节粗提物水溶液pH范围为1~4。

所述的制备方法，优选步骤（3）中大孔树脂型号为D101、D201、D301、HP20、SP70、SP700、SP825、XAD-16或AB-8。

所述的制备方法，优选步骤（3）中甲醇或乙醇溶液的浓度为40~95%。

所述的制备方法，优选步骤（4）中用硅胶柱分离步骤如下：

步骤（3）得到的干浸膏，加甲醇或乙醇溶液溶解，与干浸膏重量1~2倍的硅胶进行拌样，搅拌均匀，挥干溶剂，以硅胶柱分离，柱床硅胶与拌样硅胶重量比为1~3：1，用二氯甲烷或三氯甲烷：甲醇或无水乙醇20：1~0装柱，并作为初始洗脱剂，洗脱3~4个柱体积，弃去；用二氯甲烷或三氯甲烷：甲醇或无水乙醇9~0：1作为洗脱剂，洗脱3~6个柱体积，合并洗脱液，减压回收溶剂得到干浸膏。

所述的制备方法，优选步骤（5）中凝胶柱分离步骤如下：

取步骤（4）得到的干浸膏，加甲醇或无水乙醇溶解，干浸膏重量与甲醇或无水乙醇体积比为1g：1~5ml，以凝胶柱分离，干浸膏溶液体积与凝胶柱柱体积比为1：10~20，用甲醇或无水乙醇洗脱4~5个柱体积，收集洗脱液，每0.1~0.3柱体积收集一份，以高效液相色谱仪检测，合并含有6种目标成分的洗脱液，减压回收溶剂得干浸膏。

本发明的有益效果：

1）本发明提供了一种金银花对照提取物，其中目标成分含量高，可作为混合对照品使用，用于处方中含有金银花的中药的质量控制，对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C等6种成分同时进行准确地定性定量测定，检测高效、成本低，结果准确；

2）除硅胶柱填料外，制备方法中所用原料和溶剂均可回收利用，分离成本较低。

附图说明

附图1为实施例1步骤（1）得到的金银花粗提物HPLC色谱图；

附图2为实施例1步骤（5）得到的金银花对照提取物HPLC色谱图；

附图3为实施例2步骤（1）得到的金银花粗提物HPLC色谱图；

附图4为实施例2步骤（5）得到的金银花对照提取物HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

（1）取金银花10.5g，加水煎煮三次，第一、二次加100ml水煎煮1小时，第三次加50ml水煎煮1小时，煎液滤过，滤液合并，减压浓缩至70℃相对密度为1.15，约15ml；然后加入20ml乙醇，搅拌均匀，静置12小时，取上清液减压回收乙醇，经干燥即得金银花粗提物2.1g。经HPLC外标法测定，该粗提物6种目标成分的总含量约为8.9%。粗提物的液相色谱图见附图1，其中6种咖啡酰奎宁酸类成分的含量见下表1：

表1金银花粗提物中6种目标成分含量

（2）取步骤（1）制得的金银花粗提物，加水10ml，超声30分钟溶解，加稀盐酸调节pH至3.0，混匀，7000转/分种，离心15分钟得上清液；

（3）取步骤（2）离心后得到的上清液，以D101大孔吸附树脂柱（柱体积为50ml）分离，金银花粗提物重量与大孔树脂填料体积比例为1kg：23.8L，以水为洗脱剂，洗脱100ml，弃去洗脱液。然后以50%乙醇溶液洗脱200ml，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到0.71g浸膏；

（4）取步骤（3）得到的浸膏，加50%乙醇5ml使溶解，取1.2g硅胶进行拌样，搅拌均匀，60℃水浴加热至溶剂挥干。以硅胶柱（200~300目，柱床硅胶1.5g）分离，用二氯甲烷：甲醇20：1装柱，并作为初始洗脱剂，洗脱30ml，弃去，用二氯甲烷：甲醇9：1作为洗脱剂，洗脱60ml，合并洗脱液，减压回收溶剂，得到0.37g浸膏；

（5）取步骤（4）得到的浸膏，加甲醇1.8ml溶解，以Sephadex LH-20凝胶柱（柱体积35ml）分离，用160ml甲醇洗脱，每5ml收集一份。以高效液相色谱仪检测，合并含有6种目标成分的洗脱液，减压回收溶剂，得到0.11g金银花对照提取物。经HPLC外标法测定，该对照提取物中6种咖啡酰奎宁酸的总质量分数约为78.3%。对照提取物的液相色谱图见附图2，其中6种咖啡酰奎宁酸类成分的含量见下表2：

表2金银花对照提取物中6种目标成分含量

步骤（1）和（5）中高效液相检测条件优选：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.4％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算不低于2000。

实施例2

（1）取金银花350g，加水煎煮三次，第一、二次加3L水煎煮1小时，第三次加2L水煎煮1小时，煎液滤过，滤液合并，减压浓缩至70℃相对密度为1.14，约500ml；然后加入乙醇约700ml，搅拌均匀，静置12小时，取上清液减压回收乙醇，经干燥即得金银花粗提物81g。

经HPLC外标法测定，该粗提物6种目标成分的总含量约为8.4%。粗提物的液相色谱图见附图3，其中6种咖啡酰奎宁酸类成分的含量见下表3：

表3金银花粗提物中6种目标成分含量

（2）取步骤（1）制得的粗提物，加400ml水混匀，超声30分钟使溶解，加稀盐酸调节pH至2.8，混匀，7000转/分种，离心15分钟得上清液；

（3）取步骤（2）离心后得到的上清液，以D101大孔吸附树脂柱（柱体积约为2L）分离，金银花粗提物重量与大孔树脂填料体积比例为1kg：24.7L，以6L水洗脱，弃去洗脱液，然后以50%乙醇溶液8L洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到浸膏41g；

（4）取步骤（3）得到的浸膏，加50%乙醇100ml溶解，取70g硅胶进行拌样，搅拌均匀，60℃水浴加热至溶剂挥干，以硅胶柱（200~300目，柱床硅胶100g）分离，用二氯甲烷：甲醇20：1装柱，并作为初始洗脱剂，洗脱1.5L，弃去；用二氯甲烷：甲醇9：1作为洗脱剂，洗脱3L，合并洗脱液，减压回收溶剂，得到浸膏14g；

（5）取步骤（4）得到的浸膏，加20ml甲醇溶解，以Sephadex LH-20凝胶柱分离（柱体积400ml），用1.6L甲醇洗脱，每40ml收集一份。以高效液相色谱仪检测，合并含有6种目标成分的洗脱液，减压回收溶剂。得到的浸膏以上述凝胶柱再次分离，得到3.9g金银花对照提取物。经HPLC外标法测定，该对照提取物中6种咖啡酰奎宁酸的总质量分数为75.9%。对照提取物的液相色谱图见附图4，其中6种咖啡酰奎宁酸类成分的含量见下表4：

表4金银花对照提取物中6种目标成分含量

实施例3

取海南一家药品生产企业批号为090901h的银黄片作为样品，照《中国药典》2010年版第二增补本银黄片[含量测定]项下规定的方法制备供试品溶液。以实施例1和2中获得的金银花对照提取物、单一对照品分别制备对照溶液（对照品来源：绿原酸，中国食品药品检定研究院提供，批号110753-201314，新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C均购于成都普思生物科技有限公司，批号分别为ps100603-07、ps100512-06、ps08103101、ps08103102、ps100623-03。），以外标法测定样品中的6种咖啡酰奎宁酸成分的含量，结果见下表5：

表5外标法测定结果对照表

实施例1所得对照提取物与单一对照品测定结果相比，6种成分的相对平均偏差分别为0.96%、0.63%、1.13%、1.47%、0.87%、0.60%；实施例2所得对照提取物与单一对照品测定结果相比，6种成分的相对平均偏差分别为1.44%、0.45%、0.76%、0.73%、1.31%、0.90%。所有相对平均偏差??2%，对照提取物与单一对照品测定结果没有显著差异。（注：相对平均偏差=两数之差/两数之和）

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (10)

1.一种金银花对照提取物，其特征在于含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分，其质量比例为0.20~0.40:1.00:0.30~0.50:0.15~0.45:0.10~0.40:0.15~0.45，6种成分占金银花对照提取物的总质量分数超过70%。

2.根据权利要求1所述的金银花对照提取物，其特征在于新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分的质量百分含量分别为8.41%、29.65%、12.05%、9.92%、6.32%、11.91%。

3.根据权利要求1所述的金银花对照提取物，其特征在于新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分的质量百分含量分别为9.50%、30.59%、9.92%、13.50%、6.45%、5.94%。

4.一种权利要求1所述的金银花对照提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取药材金银花，加水煎煮三次，三次分别加重量5~10倍的水煎煮0.5~1小时，煎液滤过，滤液合并，减压浓缩至70℃时相对密度为1.13～1.18的浓缩液；浓缩液中加入乙醇，搅拌均匀，静置12~24小时，取上清液减压回收乙醇，干燥即得金银花粗提物；

（2）将金银花粗提物加水混匀，粗提物与水的重量比为1：1~5，超声处理30~60分钟，调节pH为酸性，混匀，离心得上清液；

（3）取步骤（2）离心后得到的上清液，以大孔吸附树脂柱分离，金银花粗提物与大孔树脂填料重量体积比例为1kg：20~30L，以水为洗脱剂，洗脱2~3柱体积，弃去洗脱液，然后以甲醇或乙醇溶液洗脱3~4柱体积，收集洗脱液，减压回收溶剂得干浸膏；

（4）取步骤（3）得到的干浸膏，加甲醇或乙醇溶液溶解，用硅胶柱分离，所得目标洗脱液减压回收溶剂得干浸膏；

（5）取步骤（4）得到的干浸膏，加甲醇或无水乙醇溶解，用凝胶柱分离，所得目标洗脱液减压回收溶剂得干浸膏；

（6）取步骤（5）得到的干浸膏，重复步骤（5）1~3次，以HPLC外标法分别测定6种目标成分的含量，直至新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 6种成分质量比例关系为0.20~0.40:1.00:0.30~0.50:0.15~0.45:0.10~0.40:0.15~0.45，并且其总质量分数超过70%。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤（1）浓缩液中加入乙醇的量为浓缩液体积的1~1.5倍。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤（2）调节粗提物水溶液pH范围为1~4。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤（3）中大孔树脂型号为D101、D201、D301、HP20、SP70、SP700、SP825、XAD-16或AB-8。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤（3）中甲醇或乙醇溶液的浓度为40~95%。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤（4）中用硅胶柱分离步骤如下：

步骤（3）得到的干浸膏，加甲醇或乙醇溶液溶解，与干浸膏重量1~2倍的硅胶进行拌样，搅拌均匀，挥干溶剂，以硅胶柱分离，柱床硅胶与拌样硅胶重量比为1~3：1，用二氯甲烷或三氯甲烷：甲醇或无水乙醇20：1~0装柱，并作为初始洗脱剂，洗脱3~4个柱体积，弃去；用二氯甲烷或三氯甲烷：甲醇或无水乙醇9~0：1作为洗脱剂，洗脱3~6个柱体积，合并洗脱液，减压回收溶剂得到干浸膏。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤（5）中凝胶柱分离步骤如下：

取步骤（4）得到的干浸膏，加甲醇或无水乙醇溶解，干浸膏重量与甲醇或无水乙醇体积比为1g：1~5ml，以凝胶柱分离，干浸膏溶液体积与凝胶柱柱体积比为1：10~20，用甲醇或无水乙醇洗脱4~5个柱体积，收集洗脱液，每0.1~0.3柱体积收集一份，以高效液相色谱仪检测，合并含有6种目标成分的洗脱液，减压回收溶剂得干浸膏。

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