CN103813714A - 脉冲电场处理方法及通过该方法获得的包含生物活性分子的乳制品 - Google Patents

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Abstract

本发明处理了乳中的生物活性成分在用于保存的巴斯德消毒法期间失活的问题。本发明公开了用脉冲电场（PEF）处理全脂乳、脱脂乳、半脱脂乳或乳清或其他包含乳成分或级分的液体组合物的方法。本发明基于这样的发现，通过选择一种或多种特定的处理参数，如PEF处理室设计、所施加的比能、场强、脉冲类型、起始温度，有可能有效地从组合物消除微生物，同时保留组合物中生物活性成分的活性。

Description

脉冲电场处理方法及通过该方法获得的包含生物活性分子的乳制品
本发明涉及用于降低液体组合物或黏性组合物中的微生物负荷量（load）的方法、用于延长液体组合物或黏性组合物的货架期的方法、脉冲电场（PEF）巴斯德消毒法、经PEF处理的组合物及其他方法和组合物。
背景技术和本发明待解决的问题
微生物学安全性是对食品最重要的要求。可见于食品中的微生物可以引起多种疾病，例如李斯特菌病。高营养、有功能价值以及良好的味道是对食品的其他重要要求。常规的生产和保存方法确保微生物学安全性，但味道和营养含量因这些方法而受到不利的影响。因此，必须开发出新的方法来最小化所述方法对营养和健康成分的影响。此外，对新方法的要求是它们在生态学和经济上合理。
乳是具有营养价值的食品，除必需的大量营养物外，乳还包含维生素和其他生物活性分子，其具有以多种方式有益于消费者的健康促进性质或活性。通常，在大规模生产方法中，通过热巴斯德消毒法或超高热处理（UHT）来保证乳的微生物学安全性。如文献中大量地报道，两种方法都导致天然存在于乳中的生物活性分子的实质性降解。特别地，许多天然存在于乳中的维生素和生物活性蛋白质对热敏感。此外，用热来保存食品的保存方法不利地影响食品的风味。
因此，需要新的保存方法，其优选不用热来进行保存。一种可能的非热保存法是应用脉冲电场（PEF）。此方法用电流来灭活微生物并保持食品的微生物学安全性。成分和风味基本上不受此方法影响。所述方法灭活微生物的潜在机制称为电穿孔。由于高压交变电场，细胞膜是可透化的，结果使细胞裂解。
M.Walking-Ribeiro等人,Int.J.Food Microbiol.144(2011)379-386比较和组合了PEF、微量过滤和常规热巴斯德消毒法在微生物灭活上的效率。此出版物未讨论与不同处理相关的生物活性分子的丧失，实际上，此出版物中用于乳的PEF处理的条件使得生物活性分子不可能在所述方法的过程中保持其活性。
US2008/0317823提出了压力处理生物活性组合物来延长其保存期（货架期）的方法。此文件中公开的压力处理耗费能量和成本。此外，压力处理是分批方法，而连续处理对提高基于乳的产品的微生物学安全性有利。
Toepfl,S.,Heinz,V.und Knorr,D.(2006)在Pulsed Electric FieldTreatment of Foods,Ed:Raso,J.und Heinz,V.,p.197-221,Elsevier,Oxford,UK中描述了目前脉冲电场技术在食品工业中的应用的知识。
鉴于以上，本发明的目的是提供用于降低含有生物活性分子的液体或黏性食品中的微生物负荷量，同时保持存在于所述食品中的生物活性分子的活性和功能性的方法。
换言之，本发明的目的是提供用于提高或保证含有生物活性分子的液体组合物或黏性组合物的微生物学安全性的方法，其中所述方法不降低或不以很大程度降低存在于所述食品中的生物活性分子的活性或含量。
特别地，本发明的目的是保持天然存在于乳中的生物活性分子的生物学活性。然而，可存在于乳中的微生物，尤其是活微生物的数目需要大大地减少，优选低于检测水平。
本发明的目的是提供非热巴斯德消毒法，其就提高食品安全性和减少微生物计数而言与热巴斯德消毒法一样有效，但其不存在热巴斯德消毒法的不足。这类不足是蛋白质变性和生物活性分子丧失、存在于乳中的分子的生物活性丧失、风味改变及有时颜色改变。
更具体而言，本发明处理了在热巴斯德消毒或保存期间乳中生物活性成分失活的问题。热巴斯德消毒法通常用液态乳进行。温度为约72℃，保持时间不少于15秒（Kessler2006,International Dairy Federation,175页），其对生物活性成分，尤其是诸如乳铁蛋白、IgA、IgG、TGF-β1和TGF-2的生物活性蛋白质而言是太高的处理强度。
本发明还涉及获得与未处理的组合物相比具有降低的微生物负荷量的组合物，或具有与产品的安全性和/或货架期不相关的微生物负荷量的组合物，尤其是乳的问题。
本发明还处理了获得液体或干燥形式的组合物，如基于乳或包含乳成分的组合物的问题，所述组合物包括奶粉、乳清粉、酪蛋白粉、乳蛋白粉等，其中天然存在于乳中的生物活性分子在干燥，尤其是经喷雾干燥的组合物中保持活性。可以进行低温冷冻干燥或喷雾干燥的方法而不破坏生物活性分子的活性，或不彻底破坏所述活性。
本发明涉及以上目的，并提供用于获得上述益处的方法、用途和组合物。本发明所涉及的目的和问题是本发明的部分。
发明概述
本发明基于这样的发现，可以以有效方式使用脉冲电场来消除可见于乳中的甚至有抗性的微生物菌株。有趣地，可以鉴定出这样的处理参数使得可大量保持天然存在于乳中，尤其是原料乳中的生物活性分子的活性。
就天然存在于乳中的蛋白质的完整性和维生素的活性而言，本发明的方法与热巴斯德消毒法相比尤其有利。包含在本发明的组合物中的蛋白质在很大程度上保持其天然组成，因此可以在很大程度上发挥其生物学活性。因此，本发明还提供包含一种或多种天然存在于乳中的特定蛋白质的经PEF处理的组合物，其中大量的所述蛋白质以天然形式存在。
根据一个方面，本发明涉及包括对组合物进行PEF处理的步骤的方法。
根据一个方面，本发明涉及用于处理组合物的方法，所述方法包括对所述组合物进行PEF处理的步骤。
在一方面，本发明提供获得组合物的方法，所述组合物在营养上和/或微生物学上安全，且包含以活性形式存在于原料乳中的生物活性分子，和/或提供存在于原料乳中的生物活性分子的健康益处。
在一方面，本发明提供获得组合物的方法，所述组合物以天然形式包含存在于原料乳中的生物活性蛋白质，和/或提供存在于原料乳中的天然蛋白质的健康益处。
根据一个方面，本发明涉及用于提高和/或保证组合物的安全性的方法，所述方法包括对所述组合物进行PEF处理的步骤。
根据一个方面，本发明涉及延长组合物的货架期，尤其是在冷藏条件下的货架期的方法，所述方法包括对所述组合物进行PEF处理的步骤。
根据一个方面，本发明涉及用于降低组合物中的微生物负荷量的方法，所述方法包括对所述组合物进行PEF处理的步骤。
根据一个方面，本发明涉及用于基本上去除组合物中的微生物计数的方法，所述方法包括对所述组合物进行PEF处理的步骤。
根据一个方面，本发明提供了方法，其用于在微生物存在于组合物中的情况下或在微生物存在于所述组合物中时灭活所述组合物中的所述微生物的方法，所述方法包括对所述组合物进行PEF处理的步骤。因此，即使并未预期所述组合物中可能存在微生物，尤其是病原微生物，也优选将所述方法作为谨慎的安全措施进行。
在一方面，本发明提供用于降低包含一种或多种生物活性分子的液体组合物或黏性组合物的微生物负荷量的方法，所述方法包括对所述组合物进行脉冲电场（PEF）处理的步骤，其中在所述PEF处理中，将所述产品暴露于每千克组合物600千焦或更小的比能。
在一方面，本发明提供用于降低包含一种或多种生物活性分子的液体组合物或黏性组合物的微生物负荷量的方法，所述方法包括对所述组合物进行脉冲电场（PEF）处理的步骤，其中在所述PEF处理中，将所述组合物暴露于场强为5至50kV/cm的PEF。
在一方面，本发明提供用于降低包含一种或多种生物活性分子的液体组合物或黏性组合物的微生物负荷量的方法，所述方法包括对所述组合物进行脉冲电场（PEF）处理的步骤，其中在所述PEF处理前立即将所述组合物的温度调节为20℃至45℃。
在一方面，本发明提供用于降低包含一种或多种天然存在于乳中的生物活性分子的液体组合物或黏性组合物的微生物负荷量的方法，所述方法包括对所述组合物进行脉冲电场（PEF）处理的步骤，其中在所述PEF处理中，使所述组合物暴露于每千克组合物600千焦或更小的比能，且其中使所述组合物暴露于场强为10至20kV/cm的PEF。
在另一方面，本发明提供通过本发明的方法中的任一种可获得的和/或通过本发明的方法中的任一种可直接获得的组合物。
在一方面，本发明提供经PEF处理的包含一种或多种生物活性分子的组合物。
在一方面，本发明提供经脉冲电场（PEF）处理的组合物，其在微生物学上安全，且其包含一种或多种天然存在于乳中的生物活性分子，其中至少30%的各种分子处于活性形式。所述生物活性分子优选选自：蛋白质，其选自抗菌因子（antimicrobial factor）、免疫球蛋白、生长因子、细胞因子和/或促炎因子/抗炎因子（pro-/anti-inflammatory factor）、趋化因子、酶（包括消化酶）、激素和转运蛋白、糖巨肽（glycomacropeptide）、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白（milk fat globule membraneprotein）及前述一种或多种的组合；一种或多种天然存在于乳中的生物活性脂质，如丁酸酯、鞘脂、磷脂、乳脂肪球膜、长链多不饱和脂肪酸；一种或多种天然存在于乳中的维生素，如维生素A、B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、D和K；唾液酸、核酸、寡糖、氨基酸；及牛磺酸；其中所述组合物具有充分降低的微生物负荷量，以用于人类的消费安全，其中至少30%、优选至少35%、优选至少40%的所选择的分子以活性和/天然形式存在。
在一方面，本发明提供组合物，尤其是经PEF处理的组合物，其在微生物学上和/或营养上安全，且包含以活性形式存在于原料乳中的生物活性分子，和/或提供存在于原料乳中的生物活性分子的健康益处。
在一方面，本发明提供组合物，尤其是经PEF处理的组合物，其在微生物学上和/或营养上安全，且所述组合物包含一种或多种天然存在于乳中的蛋白质，其中所述蛋白质的至少一部分以天然形式存在，和/或其中所述组合物提供原料乳和/或天然蛋白质的一种或多种健康益处。
在一方面，本发明提供经脉冲电场（PEF）处理的组合物，其包含至少一种蛋白质，其具有的氨基酸序列对应于天然存在于乳中的蛋白质的氨基酸序列，其中至少30%的所述蛋白质以天然形式存在。
在一方面，本发明提供经PEF处理的组合物，其在微生物学上安全，且其包含一种或多种天然存在于乳中的蛋白质，其中至少30%的各种蛋白质处于天然形式。
在一方面，本发明提供经脉冲电场（PEF）处理的包含一种或多种具有生物学活性的蛋白质的组合物，其中所述活性对应于在未处理的对照中可见的活性的至少30%，和/或其中至少30%的所述蛋白质以天然形式存在。
本发明的方法是有利的，因为它们不失活或仅以相对低的程度失活存在于组合物中的生物分子。
本发明的其他方面和优选实施方案在所附权利要求中提供，并在下文的描述中更详细地给出。
附图简述
图1示意性显示用于根据本发明的优选实施方案的共线PEF处理室的结构或一般设计。
图2示意性显示电路图的回路，其可以用来产生用于进行根据本发明的PEF处理的电脉冲。
图3示意性显示用于根据本发明的示例性PEF系统，其用于PEF处理液体组合物或黏性组合物。
图4显示用于图2中所示的PEF系统的一对处理室。
图5是根据本发明的优选实施方案的包含插入物的共线处理室的正视图。
图6是图5中所示的处理室的纵剖面图。
图7A和B显示原料乳的起始温度及应用于PEF处理的比能对分别灭活所加入的大肠杆菌（E.coli）和无害利斯特氏菌（L.innocua）的影响。在30℃的起始温度下，需要较低的比能来实现灭活。
图8显示所接种的原料乳中的大肠杆菌和无害利斯特氏菌的PEF灭活（由微生物计数表示）取决于比能。PEF处理前将原料乳的温度设为30℃，使用图6中所示的具有插入物的一对共线处理室。图8显示，在244kJ/kg达到了最大微生物灭活。
图9A和B显示处理室设计及应用于PEF处理的比能分别对具有30℃的起始温度的原料乳中的大肠杆菌和无害利斯特氏菌的灭活（由cfu计数表示）的影响。使用具有“鱼雷”插入物的共线处理室（图6）的设计需要较小的比能来达到灭活。
图10A和B显示处理室设计和经PEF处理组合物的最终温度对分别加至组合物（原料乳）的大肠杆菌和无害利斯特氏菌的灭活（由cfu计数表示）的影响。使用具有插入物（“鱼雷”）的共线处理室最有利，因为对于给定的微生物灭活，由PEF处理引起的温度上升保持更低。
图11显示按递增的比能PEF处理原料乳后乳铁蛋白在乳中的存在。通过使用对天然乳铁蛋白特异的一对抗体的ELISA来测量生物活性分子（乳铁蛋白）的活性/完整性。在244kJ/kg的比能下，大部分乳铁蛋白仍是天然的。
图12如图11，不同之处在于生物活性分子是IgA。
图13如图11，不同之处在于生物活性分子是IgG。
图14如图11，不同之处在于生物活性分子是TGF-β1。
图15如图11，不同之处在于生物活性分子是TGF-β2。
图16是总结在用244kJ/kg的比能进行PEF处理获得的图10至14中所示的结果的条形图。将所示特定的生物活性分子的量与原料乳（未处理的对照）中所述分子的量相比较。
图17显示经PEF处理（用不同比能（0（原料乳）、65、210、244、314kJ/kg乳））的乳在PEF处理后0、2、4、6、8、11和14天且保存于4℃时的cfu计数。在按照本发明处理时，乳货架稳定14天，而cfu计数仍明显低于105cfu。
发明详述
本发明涉及方法，其包括尤其是在处理室中用一个或多个脉冲电场（PEF）对组合物进行处理的步骤。
为了本说明书的目的，术语“包括”意指“除其他外还包括”。并非旨在意指“仅由…组成”。
组合物优选是预期用于人类消费或用于动物消费的可消费和可食的组合物。组合物预期用于口服施用和/或消费。在这方面，组合物包含可食成分和/或物质，且优选由可食成分和/或物质组成。因此，组合物优选不含并非用于或适合于人或动物口服施用的任何毒性和/或有害的物质。本发明的组合物在营养上和/或微生物学上安全，尤其是在根据本发明的经PEF处理后。
进行PEF处理的组合物优选是液体组合物或黏性组合物。特别地，所述组合物优选具有液体的性质，如黏度。因此，所述组合物可以是悬液、浆液、溶液等。所述在所述组合物中可以包含例如悬浮和/或溶解在组合物中的固体。
优选地，在本发明的所述方法之前，当在室温（25℃）下测定时，所述组合物具有低于(<)10帕斯卡秒(Pa s)、优选<5Pa s、甚至更优选<3
Pa s、<1Pa s、<0.5Pa s、<0.3Pa s、甚至更优选<0.1Pa s、<0.05Pa s、且最优选<0.01Pa s的黏度。应指出，本发明尤其可使用0.0001至0.5Pa s、尤其是0.001至0.1Pa s的黏度，其涵盖了乳（0.0017Pa s）和奶油的黏度。可以用德国Ottendorf-Okrilla的Rheotest
Figure BDA0000473660780000081
Medingen GmbH公司的
Figure BDA0000473660780000082
LK的毛细管黏度计，使用无温度控制套（用于啤酒和麦芽汁、乳、饮用酸奶等）的基本形式测定黏度，尤其是具有1至10'000mPa s范围内的黏度的低黏度液体的黏度。使用涵盖不同黏度范围的毛细管。样品体积约为25ml。
根据一个实施方案，所述组合物的黏度处于0.0005至3.5Pa s、优选0.001至3Pa s的范围内，其涵盖了基于乳的产品，如乳和酸奶（0.5-3Pa s）。根据一个实施方案，所述组合物的黏度在0.001至1Pa s的范围内。
根据一个实施方案，所述组合物包含营养物。因此，所述组合物优选是营养组合物和/或食品组合物。
根据一个实施方案，所述组合物包含一种或多种乳成分、基本上由一种或多种乳成分组成、或由一种或多种乳成分组成。例如，除包含在乳中的维生素和其他营养物外，所述组合物还可以包含选自乳蛋白、乳脂、乳脂肪球膜、乳糖的一种或多种。例如，所述组合物可以包含酪蛋白和/或乳清蛋白。乳清蛋白可以是甜乳清或酸乳清。乳成分可以以粉末复原成分（powdered reconstituted ingredient）的形式存在，例如在水中重构的奶粉。
根据优选实施方案，本发明的组合物包含天然存在于原料乳中的生物活性分子。
根据一个实施方案，所述组合物包含乳或乳的成分、基本上由乳或乳的成分组成、或由乳或乳的成分组成。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含乳制品和/或基于乳的产品、基本上由乳制品和/或基于乳的产品组成、或由乳制品和/或基于乳的产品组成。
本发明的方法之前和/或之后的组合物可以包含选自以下的一种或多种、基本上由选自以下的一种或多种组成、或由选自以下的一种或多种组成：全脂乳、半脱脂乳、脱脂乳、初乳、降脂乳（reduced fat milk）、低脂乳、无脂乳（fat-free milk）、乳清（乳浆）、如甜乳清或酸乳清、基于乳的饮料、酸奶、冷冻酸奶、酸奶饮料、冰淇淋、奶油、黄油、鲜干酪、凝乳和干酪；前述任一种的粉末或其他干燥形式；及包含前述两种或多种组合的组合物。
根据一个实施方案，本发明的方法之前的组合物可以包含选自以下的一种或多种，基本上由选自以下的一种或多种组成，或由选自以下的一种或多种组成：原料乳、全脂乳、半脱脂乳、脱脂乳、初乳、降脂乳、低脂乳、无脂乳、乳清（乳浆），如甜乳清或酸乳清；及前述的组合。
所述组合物可以包含选自以下的一种或多种、基本上由选自以下的一种或多种组成、或由选自以下的一种或多种组成：全脂乳、降脂乳、低脂乳和脱脂乳（non-fat milk）；和/或前述任一种的粉末。全脂乳一般具有约3至3.8wt.%的乳脂含量，降脂乳一般具有2至3wt.%的乳脂含量，低脂乳一般具有0.5至2wt.%的乳脂含量，无脂乳一般具有0.5wt.%或更低的乳脂含量。
半脱脂乳涵盖去除全部乳脂，然后恢复所需或所希望的乳脂量的乳。通常，无脂乳是脱脂乳，而降脂乳和低脂乳通常是半脱脂乳。然而，为了本发明的目的，不排除通过脱脂全脂乳之外的方法获得降脂乳、低脂乳和无脂乳。
根据一个实施方案，所述组合物包含原料乳或原料乳的成分、基本上由原料乳或原料乳的成分组成、或由原料乳或原料乳的成分组成。例如，所述组合物包含全脂原料乳。对于本说明书的目的，“原料乳”是通过人类或动物，尤其是本说明书中其他地方公开的非人类哺乳动物的乳腺分泌产生的乳，所述乳未被加热至40℃以上或进行具有等同作用的任何处理。优选地，原料乳是未进行过任何均一化处理的乳。优选地，原料乳是未进行过任何热巴斯德消毒法和/或超高温处理（UHT）的乳。
原料乳和/或全脂乳具有约11至13.5wt.%，例如约12.8wt.%的干物质含量。可以根据本说明书中其他地方给出的量来从干物质含量确定每份干物质中的活性分子的量。
对于本说明书的目的，假定原料乳具有1.030kg/L的密度。假定在根据本发明的PEF处理之前和之后的组合物具有1.030kg/L的相同比重。通过此值，可以从表示为重量/体积（例如mg/L、μg/L和ng/L等）的值确定每千克组合物中的生物活性分子的量。此外，可以确定干组合物，例如经喷雾干燥的粉末组合物中生物活性分子的量（参见上文存在于乳中的干物质的量）。对于本说明书的目的，认为基于或包含乳成分的喷雾干燥组合物（例如经喷雾干燥的全脂乳）具有约3wt.%的残留水分含量。认为这种组合物的水活度（Aw）为0.2-0.3。
优选地，“原料乳”未预先进行旨在降低所述组合物的细菌负荷量或延长货架期的任何处理，其包括例如选自高压处理或微量过滤的一种或多种。
对于本说明书的目的，表述“原料乳”，有时也称为“鲜乳”，二者视为并用作等同物。
对于本说明书的目的，“乳”可以是获自家畜的乳，例如奶牛、水牛、绵羊和山羊的乳，但也可以是获自例如马和骆驼的乳。本发明还设想组合物包含天然存在于人乳中的生物活性分子。还可能按照本发明处理人乳。
本发明涉及处理包含生物活性分子的组合物的方法，所述生物活性分子是如本说明书中其他地方指出的天然存在于乳中的那些生物活性分子。
本发明的方法适于产生本发明的组合物，其也可以称为经PEF处理的组合物或第二组合物。如本说明书中其他地方所详述，本发明的组合物还可以是液体或黏性的，或者，备选地，可以是在进一步加工，例如干燥，尤其是喷雾干燥后获得的。
根据本发明在PEF处理前的组合物可以称为第一组合物或“未处理的对照”（组合物）。例如，未处理的对照是原料乳。根据一个实施方案，“第一组合物”未进行过旨在降低细菌负荷量的任何热处理或其他处理。认为“未处理的对照”或第一组合物中任一特定的生物活性分子的量是所述特定分子在组合物中的总量（100wt%或mol%）。在生物活性蛋白质的情况下，优选认为第一组合物中天然蛋白质的量是所述特定蛋白质的总量（100%）。
根据一个实施方案，所述PEF处理前的组合物是第一组合物和/或未处理的对照，且其中所述PEF处理后的所述组合物是第二组合物和/或经PEF处理的组合物，且其中如果与所述未处理的对照相比，所述经PEF处理的组合物包含至少30%、优选至少40%处于活性和/或天然形式的所述生物活性分子。优选的生物活性分子及处于活性和/或天然形式的所述分子的优选量在本说明书中其他地方详述。
根据一个实施方案，所述PEF处理前的组合物是第一组合物和/或未处理的对照，且其中所述PEF处理后的所述组合物是第二组合物和/或经PEF处理的组合物，且其中所述经PEF处理的组合物包含至少30%、优选至少40%处于天然形式的特定蛋白质。根据逻辑推理，相对于所述特定蛋白质的总含量，所述组合物优选分别包含少于70%、优选少于60%处于变性和/或降解形式的所述蛋白质。
根据一个实施方案，本发明的方法旨在减少可能存在于原料乳中的诸如细菌、分支杆菌和真菌（如酵母）的微生物的数目。在可以培养在适宜培养基上（例如培养皿中）的微生物的情况下，表述“减少微生物的数目”通常指减少菌落形成单位（cfu）。特别地，所述方法适于减少繁殖性和/或营养性（vegetative）微生物，优选可以存在于乳中的那些微生物。本发明因此适于减少处于营养生长期的微生物的数目，例如通过所述微生物的生活周期中的有丝分裂和/或增殖来进行。
存在于组合物中的微生物数目的减少通常提高所述组合物的稳定性和/或延长所述组合物的货架期。因此，本发明还涉及用于提高组合物的稳定性和/或延长组合物的货架期的方法。
微生物数目的减少包括病原微生物的减少，因此，本发明还涉及用于提高组合物的安全性和/或健康的方法。
本发明的方法具有降低细菌负荷量和其他微生物的负荷量的目标，以用于确保组合物的微生物学安全性的目的。此外，本发明的方法旨在维持天然包含在乳中的健康生物活性分子的活性，以用于确保或增加与生物活性分子相关的营养益处的目的。因此，本发明还涉及PEF巴斯德消毒法，其至少以某种程度，优选以大于其他已知的巴斯德消毒法的程度使这类生物活性分子保持完整和/或活性。
通常，术语“巴斯德消毒法”指灭活液体或黏性食品中的营养性微生物，尤其是病原体的不同方法。因此，本发明可以理解为巴斯德消毒法。另一方面，本发明不涉及“热巴斯德消毒法”，热巴斯德消毒法是用于仅通过热处理来明确减少微生物数目的现有技术的工业方法。
本发明的方法涉及用于灭活营养性微生物，尤其是病原体的脉冲电场（PEF）处理，因此也可以称为PEF巴斯德消毒法。因此，本发明的方法包括对液体组合物或黏性组合物进行PEF处理的步骤。
在PEF处理中，使组合物在处理室中暴露于一个或多个保持一定持续时间（脉冲宽度）的电场。如本文中其他地方详述，电场通常按特定的频率重复。据报道，PEF处理导致微生物灭活。不希望受限于理论，认为暴露于电场导致微生物膜结构的变化，其进一步导致孔的形成和/或提高膜的通透性。电场的高强度脉冲可以导致微生物的不可逆破坏。
组合物通常在处理室中暴露于PEF。PEF通过电极产生，所述电极通常是处理室的一部分，或邻近处理室。
PEF处理可以在不同类型的处理室中进行，例如静止或连续的处理室。根据一个实施方案，本发明的方法涉及连续的处理方法。特别地，本发明涉及减少食品组合物中的微生物的连续方法。对于本说明书的目的，“连续方法”不同于分批方法。在“连续方法”中，组合物连续地暴露于PEF处理。换言之，连续地对组合物进行所述PEF处理。特别地，将组合物连续地引导至PEF处理室，并从处理室移出。在本发明的连续方法中，待处理的组合物在特定的方向连续地移动，例如连续地泵过一个或多个处理室。
本发明的整个方法可以是连续的，包括可能通过加热和/或冷却来将组合物的温度调节至特定温度，和/或喷雾干燥或冷冻干燥的可选步骤。备选地，PEF处理是连续的，而其他步骤，如加热、冷却和喷雾干燥（如果存在）可以以连续或分批的方式独立进行。
存在适合进行连续PEF处理的处理室设计的几种类型，所述室的差别通常在于电极的排列和位置，因此差别在于处理室中的场强分布。存在线性、共轴和共线连续处理室。
根据一个实施方案，在一个或多个共线处理室中应用本发明的所述PEF处理。
示例性共线处理室的一般结构示意性显示在图1中。在这种类型的室中，电极具有基本上中空的圆柱形内腔，并由同样具有中空圆柱形腔的绝缘体分开，使得形成管，组合物流过或经过所述管的同时暴露于PEF处理。在图1中，处理室1包含内腔2，如箭头3所示，产品从所述内腔2经过，所述箭头3表示产品流过处理室1。处理室包含中央电极4（在所示情况下为正极）及接地电极5和6（分别位于正极4的上游和下游）。所有电极都由绝缘材料8分开。与产品接触的电极4、5、6及绝缘体8优选具有中空圆柱形内壁，并形成处理室1的中空圆柱形内腔。线7表示电场。
通常，处理室包含下列成分，基本上由下列成分组成或由下列成分组成：两个或多个电极和分开所述两个或多个电极的绝缘体。共线处理室通常为中空圆柱形、中空圆锥形和/或管形，一对环状、中空圆锥形和/或管形电极位于中空圆柱形、中空圆锥形和/或管形中央腔的上游和下游，后者通常由绝缘体制成。
电极优选金属电极，优选由不锈钢或钛或其他材料制成，所述其他材料为惰性和/或允许与食品接触，且适于减少或避免电极表面的任何电化学反应，如金属的电化学沉积或溶解。通常这样选择电极材料，使得电极处通常基本上不发生电解或氧化还原反应。
应指出，经PEF处理的组合物与电极接触。
两个电极通常由绝缘材料分开。通常，电极之间的处理室的腔可以由所述绝缘材料制成，所述绝缘材料也优选在PEF处理期间与组合物接触。换言之，电极之间通常存在包含绝缘体的缺口，组合物通过所述缺口来移动，同时暴露于PEF处理的电场。绝缘体的存在是在处理室的腔中维持正确方向、有效的电场所必需的，所述处理室从一个电极开始并延伸至带相反电荷（或不带电荷或带较少电荷）的电极。
因此，电场在两个电极之间延伸。绝缘体可以由绝缘材料，优选惰性材料制成，如陶瓷，或聚合物，如聚乙烯、PTFE，或其他绝缘材料。
包含电极和绝缘体的处理室可以包含套管结构，所述套管结构的至少一部分也优选由绝缘材料制成，所述绝缘材料至少部分组装或稳定处理室的其他部分，以使不同部分（处理室的电极、绝缘体）在结构上连接并保持在一起。
结果，包括电极的共线处理室包含或形成管形腔，其尤其适合于PEF的连续处理。处理室因此包含产品入口（优选环状）和产品出口（优选环状）。
优选地，根据本发明的PEF处理涉及至少一个、更优选至少两个处理室，优选甚至更多，例如三个、四个、五个、六个或更多个处理室。如果存在一个以上处理室，则后者优选串联连接，使得组合物一个接一个地流过或经过所述处理室。更优选地，使用四个处理室。
通常，一个处理室由至少两个电极表征，所述电极为带电荷电极和对电极（对电极可以带相反电荷，可以接地，或者可以携带与带电荷电极相同的电荷，只是携带电荷的程度较低，例如带电荷电极的一半（1/2））。
尤其是对于共线处理室，多个电极是可能的，例如电极对、三电极系统或四电极系统。在三电极系统的情况下，电极可以排列为：例如，地线-正极-地线（见图1）；地线-负极-地线；正极-地线-正极；负极-地线-负极；正极-1/2（一半）正极-正极；负极-1/2（一半）负极-负极；1/2负极-负极-1/2负极；1/2正极-正极-1/2正极。在四电极系统的情况下，两个相同的电极（例如两个正电极）可以处于或不处于机械连接。在前一种情况下，通常还存在电偶联，但它们仍将是分开的机械部分，并视为两个电极。根据上文所述类推，可以使用地线-正极-正极-地线；地线-负极-负极-地线；正极-地线-地线-正极和如上文所述的三电极系统。
在如上文所述的三电极系统和四电极系统中，例如，电极和各自的对电极之间可以存在两个处理室。
表述“上游”和“下游”指组合物流过所述处理室和/或在PEF处理期间，其中上游指更靠近组合物流源头的区域（或组合物流的相反方向），而下游指在组合物流的方向上距离更远的区域。对于本说明书的目的，表述“上游”和“下游”按惯例使用。
如果存在两个共线处理室，则组合两个带电荷电极作为中央电极（例如，优选在大致相同的电压下带正电荷或负电荷）通常是有利的，其中两个对电极中的一个位于中央电极的上游，另一个位于中央电极的下游，由绝缘体分开。也可能相反（（中央接地或带半电荷（semi-charged）的对电极））。
根据一个实施方案，在两个组合处理室的上游端和下游端提供两个带正电荷的电极（在大致相同的电压水平下），在两个处理室之间，在中央提供一个或两个对电极。
在两个处理室的情况下，因此优选存在三个或四个电极，其中一个或两个中央电极作为两个分开的上游和下游的电极的对电极发挥作用。
根据希望的PEF处理和/或希望的处理室内的保留时间（residencetime）来选择处理室和/或电极的数目。
根据一个实施方案，通过两个处理室中的三个或四个电极，或备选地，通过四个处理室中的六个或八个电极来应用PEF处理。
根据本发明的方法的实施方案，在一个或多个共线处理室中应用或进行PEF处理，和/或其中所述处理室优选包含内侧或内部元件。内侧元件优选为惰性且不导电。优选地，内侧或内部元件不影响或干扰（或基本上不影响或干扰）由PEF处理产生的电场。优选地，内侧元件由诸如PE、PTFE或陶瓷材料的绝缘材料制成。内侧元件由于放置在内侧（即处理室的腔内）而称为内侧元件。内侧元件因此与通过所述处理室的组合物接触，并影响组合物的流动，尤其是组合物的流动方向和流动类型。
可以以固定地和不可拆卸元件的形式提供内侧或内部元件，其与处理室的一个或多个其他结构元件，例如与绝缘体形成一体，所述绝缘体分隔电极和/或提供电极之间的处理室内壁。
备选地，且优选地，内侧元件是以插入物的形式提供的分隔件（separate piece），其可以放置在处理室中，并例如在为了清洁的目的而拆卸处理室时可从其移除。如果内侧元件是分隔件，则它可以以插入物的形式提供，所述插入物是可以插入到处理室中，并在使用期间（PEF处理）占据处理室内的特定位置的结构元件。
令人惊奇地，已发现内侧元件在处理室中的使用适于影响流型和/或减少或防止组合物在处理室中所暴露的电场的不均匀性。应指出，不均匀的电场可以引起温度峰，其可以损伤组合物的温度敏感组分。例如，局部温度峰可以引起某些蛋白质的变性，从而导致组合物的物理性质和化学性质的变化。因此，内侧元件优选减少组合物中，优选处理室内的温度峰。
还认为内侧元件适于减少层流，并增加处理室中的液体或组合物的浊度。这样，提高了PEF处理期间同质、规律地处理和/或暴露于电场的可能性。应指出，由于与层流相伴的流速差异等，认为处理室内的层流特征是不利的。
根据特定的实施方案，在一个或多个具有基本上中空的圆柱形腔或中空圆锥形腔的处理室中应用所述PEF处理，其中所述处理室包含内侧元件，其中所述内侧元件包含纵向圆柱形或圆锥形节段，且其中所述插入物占据所述处理室的所述空腔的空间。
根据一个实施方案，在一个或多个具有腔的处理室中应用所述PEF处理，其中连续引导所述组合物通过所述处理室的所述腔，和/或其中在所述腔中提供内侧元件，使得在所述处理室中将所述组合物引导至所述内侧元件周围。
根据一个实施方案，在具有入口和出口的一个或多个处理室中应用所述PEF处理，其中将所述组合物连续地插入所述室的入口，并通过所述出口从所述处理室连续地取出所述组合物，且其中所述一个或多个处理室包含内侧元件，其中所述内侧元件放置入所述室中，以便引导产品接近所述室的部分内壁和/或其中所述内侧元件防止所述组合物占据所述室的区域或部分的轴向位置。
内部元件因此优选迫使组合物沿着环形或管形的开放或空白空间流动，其受中空圆柱形电极和绝缘体的内壁及圆柱形内部元件的外壁限制。虽然这种情况可让人想到共轴处理室（其中在处理室内侧提供一个电极）的情况，但本发明的内侧元件与后者的不同在于，它不是电极，而仅影响处理室内的产品流动。
根据一个实施方案，在包含内侧元件的一个或多个处理室中应用所述PEF处理，所述内侧元件适于增加存在于所述组合物中的湍流数和/或减少所述组合物在所述处理室内的层流。
内侧元件优选具有纵向结构，和/或优选包含圆锥形或圆柱形部分。
如果内侧元件是分隔件（插入物），则它优选进一步包含锚定结构，其允许所述元件在处理室中的稳定。实际上，锚定结构可以在处理室外侧进行锚定，同时导致插入物在处理室内的固定、紧固的定位。
插入物优选占据处理室的中空圆柱形或中空圆锥形腔中的至少一部分轴向位置。优选地，插入物为纵向，且具有轴，其中插入物占据处理室内的轴或轴空间的一部分。优选地，放置纵向插入物，以便与处理室的中空圆柱形或中空圆锥形腔共轴。
优选地，插入物包含第一和第二末端，及所述第一和第二末端之间的中间部分。优选地，所述第一和第二末端中的至少一个包含锚定结构，其辅助插入物在处理室中的附着。如果仅有一个末端包含所述锚定结构，则另一末端可以是简单的平整表面或优选半圆端或尖端。例如，一个末端可以具有基本上为半球的形式或形状。
所述内侧元件的末端之间的基本上纵向的部分优选是圆柱形和/或圆锥形，和/或可以包含不同圆锥形节段或圆锥形和圆柱形节段的组合。总体上，中央、中间部分具有小于处理室内腔直径的直径，以便可将内侧元件放入所述处理室的腔中。
锚定部分优选包含这样的部分，所述部分尤其是从中间部分的一个末端（上游端或后端）径向延伸，并在某个位置与处理室或导管（conduct）的内壁表面接触，组合物被引导至所述导管中或通过所述导管从处理室移除组合物。例如，内侧元件可以包含紧靠所提供的桥基表面的突出物或突起，所述桥基表面朝向处理室的上游或下游端。
内侧元件可以具有鱼雷的一般方面。2011年1月27日提交的编号为PCT/EP2011/051149的国际专利申请中公开了优选的处理室设计，其包括插入物形式的内侧元件。就降低微生物负荷量和保持组合物的生物活性成分而言，在共线处理室中使用这种插入物产生最好的结果。
优选地，处理室的内部中空圆柱形腔的内径在5至35mm之间，优选6至30mm，更优选7至25mm，最优选9至20mm，9至17mm，9至15mm，或9至13mm，例如9.5至11mm。
在处理室的内腔不是中空圆柱形的情况下，例如，如果处理室具有非圆形横截面，例如椭圆形横截面，则上文所示的直径值适用于在处理室中的任一具体位置观测到的最大直径。如果设置处理室中的直径在纵向或轴向上改变（例如在中空圆锥形处理室腔中的情况下），则上文所示的值和范围指在处理室的任一位置可以观测到的值。对于本说明书的目的，虽然并非强制要求，但优选这些尺寸适用于处理室的整个腔。优选地，处理室的内腔基本上或完全是中空圆柱形，使得处理室的横截面基本上在处理室的整个长度上均显示处理室的圆形内径。
对于本说明书的目的，处理室涵盖可见于电极对之间的电场的整个空间。
上文针对处理室的内腔的直径所示的值和范围不以任何方式受内侧元件/结构或刚性结构元件的存在的影响，所述内侧元件/结构或刚性结构元件在本说明书中其他地方定义的处理室中提供，尽管内侧元件和/或刚性元件具有这样的影响：并非处理室的整个腔均可以被处理室内的产品流或组合物流占据。以上直径值不考虑内侧元件在处理室内占据了一些体积的事实。
在本说明书的背景下，可以以范围的方式显示值，例如本发明的方法的处理参数。本说明书中范围的指示意指具体参数（例如内室直径、比能、场强、脉冲宽度等）可以采用各范围中所示终点值的任一个，或者可以采用所述范围内的任意值。通常，但并非必需在所有情况下，参数采用所述范围中基本上恒定的值。技术人员将理解所述值在什么情况下恒定，而在什么情况下可以存在波动。例如，在处理室内腔直径的情况下，由于这是结构上通常不可变的实体，这种直径在处理室中的具体位置保持恒定。如果参数的值波动，则优选这类波动在很大程度上基本处于所示范围之内。
在本发明的方法中，电场的脉冲在电极处产生，电场在所述处理室内延伸。
技术人员知道如何在处理室中产生脉冲电场。通常，优选用于产生高能电脉冲的系统，所述系统包含电源、一个或多个电容器、一个或多个晶体管（例如IGBT绝缘栅双极晶体管）和至少一个变压器（例如DIL高压变压器
Figure BDA0000473660780000201
）。根据一个实施方案，用于本发明的PEF处理的系统包含一个或多个冷却器和/或一个或多个加热器，所述冷却器和加热器适于在PEF处理之前或之后调节组合物的温度。基本上，通过电源在电容器中储存电能来产生脉冲，以便能够发射高功率比的脉冲。晶体管或其他半导体开关用于周期性放出能量，并将所述能量转移至处理室。通常通过脉冲调制器设置来限定最大输出电流和电压以及极性。
通常，PEF系统需要冷却，可以例如通过油来进行所述冷却，油通过油泵泵过系统的循环。
在本发明的方法中，将液体和/或黏性组合物泵过所述一个或多个处理室。优选地，通过反压(counter pressure)来泵所述组合物。优选反压，以降低产生气泡的风险和/或维持组合物的均匀流动。反压优选处于1.1至4bar之间，更优选1.3至3bar，甚至更优选1.5至2.5，例如1.7至2.3bar，最优选1.8至2.2bar。根据一个实施方案，反压为1.5至3bar。优选地，反压具有基本恒定的值。
图2显示可以用于本发明的方法的具有脉冲变压器的PEF系统。
对于本发明的方法的目的，可以发挥作用的处理因素或参数是选自以下的一个或多个：所应用的电场强度、脉冲持续时间、比能、脉冲数、脉冲类型或形状、脉冲极性、PEF处理之前、期间和/或之后的组合物温度及脉冲频率。
本发明基于令人惊奇的发现：通过将这些处理参数中的一个或多个调整为特定的值，可以实现本发明的目的。特别地，可以大大地降低微生物负荷量，同时保持生物活性分子（尤其是蛋白质）的完整，所述生物活性分子以显著量或显著百分比存在于组合物中。
本发明的方法的相关处理参数是以下方程1中所示的比能（WS或WSPECIFIC）。
W specific = W pulse . f m .     等式1
在方程1中，WPULSE是通过一个脉冲的电场施加的以kJ（千焦）表示的比能，f是以s-1表示的脉冲频率，（上方有点的m）是以kg/s表示的质量传递（mass transfer）。WSPECIFIC的单位是kJ/kg，其中所述能量是通过电场施加的能量，所述质量是被施加了所述能量的组合物的质量。
通常，可以以两种方式确定传递的能量：（a）通过计算U(t)x(It)dt，其中U是电压，I是电流，t是时间。在多个脉冲的情况下，n乘以脉冲宽度得到时间；和/或（b）通过计算E(t)2*k dt，其中E是场强，k是电导率，t是时间。如从方程1可明显看出，为了计算以kJ/l或kJ/kg表示的比能输入，必须将传递的能量除以体积或质量流率（mass flow rate）。
根据本发明，在本发明的方法中应用的比能（WSPECIFIC）优选为每千克本发明的组合物800kJ或更低、优选700kJ/kg或更低、600kJ/kg或更低、550kJ/kg或更低、500kJ/kg或更低、450kJ/kg或更低、400kJ/kg或更低、350kJ/kg或更低、300kJ/kg或更低、350kJ/kg或更低、340kJ/kg或更低、330kJ/kg或更低、320kJ/kg或更低、310kJ/kg或更低、300kJ/kg或更低、290kJ/kg或更低、280kJ/kg或更低、270kJ/kg或更低、260kJ/kg或更低、或250kJ/kg或更低。
优选地，所述比能是100kJ/kg或更高、120kJ/kg或更高、160kJ/kg或更高、180kJ/kg或更高、200kJ/kg或更高、210kJ/kg或更高、或220kJ/kg或更高。
因此，所述比能可以在由以上量确定的任一范围之内，但优选比能在150至350kJ/kg之间、180kJ/kg至320kJ/kg之间、优选200至300kJ/kg之间、更优选220至280kJ/kg之间、甚至更优选240至260kJ/kg之间、例如约250kJ/kg。
通过以下等式2得出每个脉冲的比能。
W pulse = &Integral; 0 t U ( t ) I ( t&tau; ) dt     等式2
在等式2中，t是处理时间（秒，s），U是电极处的电压（V），I是电流（A），τ是脉冲持续时间。
PEF处理中的另一参数是电场强度，其可以测量为kV/cm且是作用于处理室中的组合物的电场的强度。电场强度定义为两个给定的电极的电势差，所述两个电极在空间中通过它们之间的距离（d）分开、通过绝缘材料分开（Zhang等人,J.Food Ing.25(1995)261-81）。
E = U d     等式3
根据本发明的实施方案，使所述组合物暴露于电场，所述电场的场强为5至40kV/cm，例如6至30kV/cm，优选7至25kV/cm，例如8至20kV/cm，更优选9至15kV/cm，例如9.5至14.5kV/cm，最优选10至14kV/cm，尤其是11至13kV/cm，例如约12kV/cm。根据一个实施方案，在所述PEF处理中，使所述组合物暴露于场强为10至15kV/cm的电场。根据其他实施方案，所述场强<17、<16、<15、优选<14、最优选<13kV/cm。优选地，所述场强>10、>11、更优选>12kV/cm、最优选12-13kV/cm。
应指出，表述“临界电场强度”是获得微生物灭活所必需的场强。为此，通常必须诱导大于1V的跨膜电位。临界场强因此一般取决于细胞类型、微生物的形式、微生物细胞的尺寸及微生物的细胞壁类型。
应指出，脉冲持续时间是影响临界场强的参数，因为脉冲持续时间越长，获得微生物灭活的场强可以相对越低。
根据本发明的一个实施方案，在所述PEF处理中应用的脉冲持续时间是10μs或更长，优选15μs或更长。
根据本发明的一个实施方案，应用这样的脉冲宽度或脉冲持续时间，其不超过40μs、不超过35μs、不超过30μs、不超过27μs、不超过25μs、不超过24μs、不超过40μs、优选15μs或更长。
根据本发明的一个实施方案，脉冲宽度或脉冲持续时间为5至35μs、例如10μs至30μs、优选12μs至28μs、例如14至26μs、更优选16至24μs、例如17至23μs、最优选18至22μs、例如19至21μs、例如约20μs。
不希望受限于理论，本发明人认为，用于本发明的目的的比能、场强和脉冲持续时间的特定组合可以至少部分解释本发明的有益作用，所述组合的特别之处在于，它们导致可以存在于组合物中的微生物的灭活，同时保持存在于组合物中的生物活性成分的活性。
根据一个实施方案，在本发明的PEF处理中，所述比能（WSPECIFIC）、场强和脉冲持续时间分别为100至400kJ/kg、6至30kV/cm和10μs至30μs；优选分别为150至350kJ/kg、7至25kV/cm和12μs至28μs；更优选分别为180至320kJ/kg、8至20kV kV/cm和14至26μs；甚至更优选分别为200至300kJ/kg、9.5至14.5kV/cm和17至23μs；最优选分别为220和280kJ/kg、11至13kV/cm和18至22μs。
应指出，根据组合物的流动或质量传递，如可从上文等式1推断的那样，可以通过改变脉冲频率来调节WSPECIFIC的值。
根据一个实施方案，所述频率（f）为50至1000Hz，例如约100hz。
关于脉冲特性，应指出，电脉冲可以具有不同的类型和极性。脉冲可以是指数衰减型脉冲、方波型脉冲和振荡衰减脉冲之一。根据优选实施方案，本发明的PEF处理的脉冲是方波脉冲，其特征在于，在整个脉冲持续时间中（或在脉冲宽度期间）通过脉冲施加的电压保持基本恒定。
此外，脉冲可以是双极性脉冲或单极性脉冲。在单极性脉冲的情况下，仅施加一个特定极性的电荷（例如仅正电荷）。根据优选实施方案，在本发明的PEF处理中，施加双极性电脉冲，以便施加正极和负极的交替脉冲。最优选地，施加双极性方波脉冲。
不希望受限于理论，由于认为在可能存在于组合物中的微生物的细胞膜上或细胞膜中诱导的附加应力，推测双极性脉冲的应用更有效。此外，双极性脉冲的应用最小化以下的风险或发生率：固体在电极表面沉积及由此导致的对室内电场均匀性的不利作用。
根据本发明的方法的优选实施方案，在所述PEF处理中，应用方波电脉冲和/或双极性电脉冲。
在进行本发明的方法且尤其是进行PEF处理之前，优选将组合物的温度调整至特定值。应指出，由于通过PEF处理施加的能量，组合物的温度通常升高。组合物或（更一般地）介质通常由于PEF处理而被加热，使得PEF处理结束时组合物的温度通常高于PEF处理前所述组合物的温度。如下文及本说明书中其他地方进一步详细讨论的，优选在PEF处理前即刻调整组合物的温度。
就微生物的灭活和生物活性分子的活性而言，组合物的温度通常发挥作用。例如，在热巴斯德消毒法中，乳所经受的高温造成乳的生物活性成分的生物活性的丧失。在另一方面，就本说明书的背景下的PEF处理而言，有可能这样选择组合物的起始温度，使得优化通过PEF处理的微生物灭活，而天然存在于乳中的生物活性分子的生物活性例如以更高的程度（相对于热巴斯德消毒法的情况下）保留。应指出，虽然PEF处理过程中组合物的温度由于所施加的能量而轻微升高，但不认为根据本发明的PEF处理是“热巴斯德消毒”法。根据具体的实验及基于文献的数学推导（此处未显示），本发明人可以显示，在本发明的方法中，微生物灭活主要由PEF处理的高强度电脉冲引起。取决于处理参数，>80%、尤其是>90%、>95%、>97%和甚至>99%的cfu减少是由高强度电脉冲引起，只有小部分（例如约<20%、甚至<10%等）的cfu减少是由热灭活引起。在本发明的背景下，优选最大化电脉冲的灭活且最小化热灭活的处理参数。
在本发明的方法中，组合物可以具有起始温度和最终温度。组合物的起始温度通常定义为刚好在PEF处理之前，尤其是进入第一处理室之前的组合物温度。最终温度是PEF处理结束时的温度，尤其是组合物离开最后一个处理室时的温度。最终温度通常还对应于组合物在PEF处理期间达到的最高温度，这是因为PEF处理本身仅导致组合物温度的升高而不会导致温度的下降。如果存在一系列PEF处理室或甚至处理室对，则还可以区分中间温度，例如两个后续处理室或处理室对之间的温度。
有趣地，组合物的起始温度影响微生物的灭活。不希望受限于理论，推测微生物的膜在高温下变得更具流动性。在低温下，膜通常是结晶的，这可以解释PEF处理导致的较低的灭活率。不希望受限于理论，较高起始温度的积极作用因此通常可以归因于磷脂双层构象的改变化。
本发明至少部分基于这样的发现，存在允许获得实质性微生物灭活的起始温度，由此组合物的起始温度是不灭活存在于组合物中的所希望的生物活性分子的温度。
优选地，组合物的起始温度为20至45℃，优选24至36℃，例如25-35℃，更优选26-34℃、27-33℃、28-32℃、29-31℃，优选约30℃。起始温度是组合物在进入PEF处理的第一处理室之前的温度。可以用适宜的加热系统来调整温度，例如在加热箱中，或在连续方法中，如使用换热器，例如板式换热器来调整温度。组合物的温度调整可以分批进行或连续进行。
如本说明书中其他地方所述，PEF处理导致经PEF处理的组合物的温度轻微升高。应指出，虽然温度由于PEF处理而轻微升高，但组合物的温度优选保持显著低于热巴斯德消毒法中所用的温度。由于此原因，可以以显著的程度保留生物活性分子的活性。
优选这样的PEF处理，使得组合物在PEF处理后，例如离开最后一个处理室后的最终温度为64℃或更低、优选63℃或更低、更优选62℃或更低、最优选61℃或更低，优选甚至更低的温度，例如60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃、50℃或更低。优选地，这些温度还对应于组合物在整个PEF处理期间的最大温度，其可以如本说明书中所公开的来控制。
例如，可以通过选择诸如处理室设计、比能、脉冲能量、电场强度等PEF处理参数来调整最终温度。例如，如果与缺乏内侧元件的方法相比，使用本说明书中其他地方讨论的包含这种内侧元件的共线处理室令人惊奇地导致更低的最终温度。不希望受限于理论，推测所述内侧元件改善了组合物所暴露的电场的均匀性，因此最小化了由PEF处理引起的温度升高。
根据一个实施方案，本发明的方法可以包括用于组合物的最终稳定化（stabilization）的最终冷却，尤其是冷藏的步骤。冷藏防止可能未被灭活的微生物的生长或防止可能于组合物中的微生物孢子的生长。最终的冷藏可以冷藏至0至10℃、1至8℃、2至7℃、3至6℃、例如约3.5至5℃的温度。应指出，经巴斯德消毒的产品，包括经热巴斯德消毒的产品通常需要在巴斯德消毒结束时冷却。因此，PEF处理结束时的冷却是本发明的方法的具体实施方案。
根据一个实施方案，本发明的方法包括干燥，优选冷冻干燥或喷雾干燥组合物的步骤。组合物可以先如上文所述冷却，或者可以在PEF处理后直接干燥。例如，可以按常规，但优选在低温下对组合物进行喷雾干燥。如果希望，可以在（喷雾）干燥前向组合物加入额外的干物质（麦芽糖糊精或其他糖类、蛋白质等）。可以将组合物引入至喷雾干燥塔进行喷雾干燥。有趣地，尤其是在使用低温时，（喷雾）干燥法并非必然导致存在于组合物中的生物活性分子的失活或变性。例如，可以使用EP0818529中或此专利文件中所引用的文件中公开的喷雾干燥法。EP0818529中引用的文件公开了喷雾干燥法中100-180℃或甚至低至60-165℃的注入空气温度（in-going air temperature）。在US5,116,953中，公开了乳铁蛋白水溶液的喷雾干燥（例如140℃的入口空气温度），以便获得经喷雾干燥的乳铁蛋白粉，由此经喷雾干燥的乳铁蛋白保持乳铁蛋白的铁结合活性。
因此，PEF处理后，可以冷却和/或干燥，例如喷雾干燥组合物。
本发明的方法优选导致组合物中的微生物计数（cfu）减少至少4个对数单位、优选至少4.5个对数单位、更优选至少5个对数单位、甚至更优选至少5.5个对数单位和最优选6个对数单位或更多。这些值适用于存在于组合物中的微生物物种的任一种，更优选适用于它们中的全部。更优选地，这些值适用于可见于乳中的病原微生物。
根据一个实施方案，可通过本发明的方法获得的经PEF处理的组合物不包含任何可检测到的营养性微生物。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的组合物。
因此，本发明的组合物，尤其是在根据本发明的方法处理之后的组合物可以是液体组合物或干燥组合物。
组合物优选包含天然存在于原料乳中的生物活性分子。组合物可以包含原料乳本身或其级分，或者可以从原料乳分离生物活性分子，并将其加至组合物来获得组合物，其将进行本发明的方法和/或进行根据本发明的PEF处理。可以通过将含有生物活性分子的乳级分或分离的乳成分加入到另一组合物中来加入生物活性分子，以获得将进行本发明的处理的组合物。本发明还涵盖乳级分或乳成分进行本发明的方法的可能性。本发明还涵盖包含原料乳或其级分（例如脱脂乳、半脱脂乳或乳清）的组合物，向所述组合物加入了其他成分，例如香料、增甜剂、纤维、一般营养制品等。在这种情况下，组合物包含乳成分或其他成分，所述其他成分不存在于乳中或不以相同的量存在于乳中。
根据备选实施方案，组合物基本上基于乳或基于乳级分，如本说明书中公开的那些乳或乳级分，优选的那些乳或乳级分选自全脂乳、具有降低的脂肪含量的乳（降脂乳、低脂乳、无脂乳）、乳清和乳蛋白质且基本上不含任何加入的微量营养物和/或大量营养物。
根据备选实施方案，组合物基本上基于乳或基于乳级分，如本说明书中公开的那些，优选上一段落中提到的那些乳或乳级分，其中组合物可以包含所添加的香料和/或增甜剂，但优选不含所添加的天然存在于乳中的任一种生物活性分子，和/或基本上不含所添加的天然存在于乳中的任一种生物活性蛋白质。
对于本说明书的目的，“基本上不含”意指≤5%、优选≤3%、更优选≤1%、甚至更优选≤0.5%、且最优选完全不含，其中百分比表示为以组合物的干物质重量计的百分比。
对于本说明书的目的，如果生物活性分子能够发挥其天然功能，则它仍具有活性。就生物活性蛋白质而言，如果生物活性蛋白质已变性，则它通常不再具有活性。对于本说明书的目的，如果蛋白质以其天然、非变性的形式存在，则认为它具有“生物活性”。
根据一个实施方案，组合物包含一种或多种处于天然形式的蛋白质或肽。对于本发明的目的，“蛋白质”是包含约9个或更多个、优选约25个或更多个、最优选约40个或更多个氨基酸的序列的多肽。通常，为了能够执行蛋白质的生物学功能，蛋白质折叠为一种或多种特定的空间构象。
通常，例如，如果抗体仍能够结合所述抗体对其特异的抗原，则它具有活性。如果酶能够催化其酶促反应，则它具有活性。如果能够结合受体的蛋白质保持其结合并优选激活所述受体的能力，则它通常具有活性。通常可以通过使用对天然蛋白质特异的抗体来评估蛋白质是否变性（无活性）。
通常，抗体不结合变性、非天然的蛋白质，或以大大降低的亲和力结合变性的蛋白质。
对于本说明书的目的，表述“活性分子”指生物活性分子。可以用术语“生物活性剂”来代替“生物活性分子”，且在本说明书中将二者视为等同物。
对于本发明的目的，可以通过以下方式来测试本发明的方法对保持生物活性分子的活性的适合性：向组合物中加入特定的蛋白质，例如抗体，在根据本发明的方法的处理后检验组合物中的抗体结合其抗原的能力。可以将所述结合能力与组合物的未处理对照中的抗体的结合能力相比较，其中将相同量的所述抗体加入到组合物的未处理对照中。
为了评估蛋白质是否以其天然形式存在，优选使用如下文实施例中所述的ELISA。因此，使用特异地结合天然蛋白质（所述蛋白质也可以是抗体）的抗体对。在PEF处理之前（未处理的对照）和之后的组合物中的经ELISA检测到的生物活性分子的量的比较允许确定有多少蛋白质在PEF处理后保持了完整性，通过用于ELISA的蛋白质特异性抗体的保守结合来检测此保持的完整性。
更一般地，使用用于测量生物活性的方法来测定本发明的组合物或对照组合物中的生物活性分子的量，所述方法包括但不限于HPLC、基于细胞的测定法、基于酶的测定法、ELISA测定法、流式细胞术测定法（正成为ELISA的可用的备选方法）、放射免疫测定法和使用动物模型进行的体内测定法。
例如，用于评估天然乳铁蛋白的量的方法包括但不限于层析法（Palmano等Journal of Chromatography,947,307-311,2002）、包括ELISA的免疫学技术（Desmazeaud,Bulletin of International DairyFederation284卷,Lactoferrin(29-42页),1993）和生物传感器免疫测定法（Indyk等,International Dairy Journal,15(5),:429-438,2005）。可以按下文实施例中所述方法测量乳铁蛋白、免疫球蛋白、生长因子和其他蛋白质的完整性。
通过粗制凝乳酶介导的酪蛋白凝结步骤（通过凝乳酶的作用）从κ-酪蛋白释放酪蛋白糖巨肽（CGMP或糖巨肽GMP，无论它如何命名）。酪蛋白糖巨肽可见于称为甜乳清或干酪乳清的乳清级分中。因此，CGMP可以通过阴离子交换来回收，并定量。CGMP是骨健康促进剂。
下文进一步公开用于测定本发明的特定蛋白质的总量、绝对量，包括处于变性和/或天然形式的具体蛋白质的量的优选方法。
本文中提到的生物活性分子可以独立地选自天然蛋白质、生物活性脂质、唾液酸、核苷酸、寡糖、氨基酸、牛磺酸和维生素。
优选地，例如，所述生物活性分子独立地选自以下的一种或多种：一种或多种天然存在于乳中的蛋白质；一种或多种天然存在于乳中的脂质；一种或多种天然存在于乳中的维生素；唾液酸；核苷酸；寡糖；氨基酸；及牛磺酸。
根据本发明，本发明的组合物包含基于蛋白质的乳生物活性剂。同时，本发明的方法优选不影响，尤其是部分或完全降低其他生物活性分子，如温度敏感的那些生物活性分子的活性。特别地，本发明的组合物包含天然存在于乳中的活性维生素。
根据本发明的优选实施方案，所述一种或多种生物活性分子选自生物活性蛋白质。所述生物活性蛋白质优选选自抗菌因子、免疫球蛋白、生长因子、细胞因子和/或促炎因子/抗炎因子、趋化因子、酶（包括消化酶）、蛋白质激素、转运蛋白、糖巨肽、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳脂肪球膜蛋白及前述两种或多种的组合，其中至少30%的各种蛋白质处于活性形式。
优选地，这些天然蛋白质以本说明书中其他地方指出的相对量或绝对量存在于经PEF处理的组合物中。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含天然抗菌因子，其可以选自免疫球蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、抗菌肽（如β-防卫素）、补体C3及前述两种或多种的组合。
免疫球蛋白可以包含选自以下的一种或多种：处于天然形式的IgA、IgE、IgG和IgM及这些中的一种或多种的组合。据报道，这些免疫球蛋白存在于牛奶中。免疫球蛋白还可以包含IgD。优选地，免疫球蛋白是IgA和IgG。
一些免疫球蛋白具有不同亚型。本发明的组合物可以包含天然存在于乳中的给定免疫球蛋白的一种亚型、几种或所有亚型的组合。IgA的亚型是IgA1和/或IgA2。IgG的亚型是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4亚型。组合物可以包含尤其是处于天然形式的IgA、IgG及有可能的其他IgG的一种亚型、两种或多种或全部亚型的组合。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含处于天然形式的生长因子，其可以选自，例如，表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、转化生长因子（TGF）、牛初乳生长因子（BCGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、生长激素（GH）、乳腺衍生生长因子（MDFG）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）及前述两种或多种的组合。
TGF尤其包括TGF-β。例如，本发明的组合物包含天然TGF-β1和/或天然TGF-β2。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含处于天然形式的细胞因子、趋化因子和/或处于天然形式的促炎因子/抗炎因子，如可以选自以下的那些：肿瘤坏死因子（TNF）、白介素（IL）（如IL-1、-2、-4、-5、-6、-8、-10）、干扰素（IFN）-γ,TGF、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、前列腺素、血小板活化因子、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、RANTE（活化后可调节、由正常T细胞表达和分泌）及前述两种或多种的组合。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含天然酶，例如活性消化酶或活性非消化酶，所述活性消化酶如选自以下酶：淀粉酶、胆汁酸刺激酯酶（native bile acid-stimulating esterase）、胆汁酸刺激脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、蛋白酶（如纤溶酶）；所述活性非消化酶如选自以下的一种及两种或多种酶的组合：如碱性磷酸酶、乳过氧化物酶、溶菌酶。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含活性/天然激素，例如选自以下的那些活性/天然激素：胰岛素、催乳素、催产素、哺乳反馈抑制剂（feedback inhibitor of lactation）（FIL）、甲状腺激素、类固醇激素、皮质类固醇、促肾上腺皮质激素（ACTH）、铃蟾肽、胆囊收缩素、雌激素、胃泌素、生长激素释放激素（GHRH）、神经降压肽、甲状旁腺激素（PTH）、睾酮、促甲状腺激素（TSH）、促甲状腺激素释放激素（TRH）、血管活性肠肽（VIP）、降钙素、甲状旁腺激素、促红细胞生成素及前述两种或多种的组合。优选地，组合物包含一种或多种处于天然形式的基于蛋白质的激素。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含活性转运蛋白，例如选自以下活性转运蛋白：乳铁蛋白、叶酸结合剂、IGF结合剂、钴胺素结合剂、甲状腺素结合剂、皮质类固醇结合剂、维生素结合剂及前述两种或多种的组合。
根据优选实施方案，组合物包含一种或多种选自天然免疫球蛋白、天然乳铁蛋白、天然β-乳球蛋白、天然α-乳清蛋白和天然TGF-β的天然蛋白质。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含活性维生素。特别地，对组合物进行的PEF处理对天然存在于乳中的几种、大多数或全部维生素具有很小的影响。因此，本发明的组合物包含水溶性和/或脂溶性维生素。组合物优选包含一种或多种选自以下的维生素（不完全列表）：维生素A、D、E、K、B1（硫胺素）、B2（核黄素）、B3（烟酸）、B5（泛酸）、B6（吡哆醇）、B7（生物素）、B9（叶酸）、B12（钴胺素）和C（L-抗坏血酸）。优选地，组合物包含天然存在于乳中的水溶性维生素，其是除维生素A和E外的上述维生素。
上文提到的维生素包括可以通过人类的代谢吸收和利用的所有维生素形式。提到的维生素E包括α-生育酚和γ-生育酚，且优选由α-生育酚和γ-生育酚组成；提到的维生素C包括抗坏血酸和脱氢抗坏血酸；维生素A指视黄醇当量（RE）。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含至少一种蛋白质，其具有的氨基酸序列对应于天然存在于乳中的生物活性蛋白质的氨基酸序列，其中至少30%的所述蛋白质以天然形式存在。本说明书中其他地方就特定的生物活性蛋白质给出的优选量和百分比也适用于此实施方案。
应指出，变性蛋白质通常不再具有最初存在于原料乳中的折叠蛋白质的生物学活性。虽然变性蛋白质仍具有与未变性的活性蛋白质相同的氨基酸序列，但对活性蛋白质特异的抗体通常不结合或以大大降低的亲和力结合变性的非活性蛋白质。因此，蛋白质仍可以存在于例如经热巴斯德消毒的组合物中，但所述蛋白质不再是天然的/有活性的。
根据一个实施方案，与所述组合物中所述蛋白质的总量相比，本发明的组合物包含30%或更多、优选40%、更优选50%或更多、尤其是60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的特定蛋白质。
对于本说明书的目的，百分比适用于摩尔百分比或重量百分比，因为百分比指给定分子量的特定蛋白质。可以通过本说明书中其他地方指出的方法来测定百分比。
可以通过分析来测定组合物中任一特定蛋白质（包括变性和/或降解的蛋白质和天然蛋白质）的总量或绝对量。根据本发明待使用的优选方法基于液相层析高分辨选择性反应监测质谱（liquidchromatography-high-resolution selected reaction monitoring massspectrometry）（LC-HSRM-MS）。所述方法是由B.Y.Fong和C.S.Norris"Quantification of Milk Fat Globule Membrane Proteins Using SelectedReaction Monitoring Mass Spectrometry"J.Agric.Food Chem.2009,57,6021-6028公开的用于乳脂肪球膜蛋白的方法。通过鉴定可用蛋白酶产生的特异性切割肽序列，然后通过质谱分析定量这些肽以确定/计算总特定蛋白质的总量，此方法可以适用于任意蛋白质。
因此，通过用ELISA定量天然蛋白质并用LC-HSRM-MS定量总蛋白质，可以确定以天然形式存在于给定的组合物中的任一种特定蛋白质（例如乳铁蛋白）的百分比。
因此，ELISA和LC-HSRM-MS都可以用来测定样品中特定蛋白质的量，而ELISA只适于定量以天然形式存在的蛋白质。因此，当组合物的样品不包含任何变性蛋白质时（例如未处理的原料乳），两种方法都产生具有良好对应性的相同结果。
还可以基于仅包含天然形式的各种蛋白质的样品将一种方法（例如ELISA）相对于另一种方法（例如LC-HSRM-MS）标准化。在确定还包含变性蛋白质的样品中天然蛋白质的量时，这可以帮助减小误差。
对于本说明书的目的，本说明书中所示的百分比可以包括≤15%、优选≤10%、更优选≤5%、甚至更优选≤3%和最优选≤2%的误差。如果提到任意具体值，除非另有定义，术语“约”和/或“基本上”意指各值±15%、优选±10%、更优选±5%、甚至更优选±3%和最优选±2%。
对于本说明书的目的，表述“特定蛋白质”指这样的蛋白质，其具有给定的氨基酸序列或隶属于一组具有高度相同的序列和相似的功能的蛋白质。例如，包含在样品或组合物中的所有IgA通常视为特定蛋白质，而任一种IgA的特定亚型的的总和也可以视为特定蛋白质。优选地，表述“特定蛋白质”指使用本文中所附的方法可定量为单位或实体的蛋白质。为了说明这一点，优选用ELISA来定量存在于样品中的所有天然IgA。另一方面，存在能够鉴定给定的蛋白质家族的亚型，例如IgA的亚型的更特异的ELISA测试。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含活性IgA，包括本说明书中其他地方所示的一种或多种亚型。优选地，如果与组合物中IgA的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选35%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的IgA。
IgA或任一种其他特定蛋白质（如IgG、乳铁蛋白等）的“总量”意指存在于组合物或样品中的天然IgA和变性IgA的总和。
发现未处理的原料乳的特定样品中IgA的浓度为135μg/mL。本发明的组合物优选以约135μg/mL的百分比的量包含天然IgA。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然IgG，包括本说明书中其他地方所示的一种或多种亚型。优选地，如果与所述组合物中IgG的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的IgG。
发现原料乳的特定样品中IgG的浓度为约860μg/mL。本发明的组合物优选以约860μg/mL的百分比的量包含天然IgG。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然IgE。优选地，如果与所述组合物中IgE的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的IgE。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然IgM。优选地，如果与所述组合物中IgM的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的IgM。
根据一个实施方案，所述组合物优选包含天然乳铁蛋白。乳铁蛋白具有抗菌、抗氧化剂、抗致癌和抗炎症性质。优选地，如果与所述组合物中乳铁蛋白的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的乳铁蛋白。根据一个实施方案，所述组合物包含乳铁蛋白，其中所述组合物中至少75%的总乳铁蛋白以天然形式存在。
发现未处理的原料乳的特定样品中乳铁蛋白的浓度为约150-200mg/L。本发明的组合物优选以约150mg/L的百分比的量包含天然乳铁蛋白。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然溶菌酶。优选地，如果与所述组合物中溶菌酶的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的溶菌酶。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然EGF。优选地，如果与所述组合物中EGF的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的EGF。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然NGF。优选地，如果与所述组合物中NGF的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的NGF。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然IGF。优选地，如果与所述组合物中IGF的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的IGF。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然TGF。优选地，如果与所述组合物中TGF，尤其是TGF-β1和/或TGF-β的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的TGF，尤其是TGF-β1和/或TGF-β2。
发现未处理的原料乳的特定样品中TGF-β1的浓度为约0.35ng/mL。本发明的组合物优选以约0.35ng/mL的百分比的量包含天然TGF-β1。
发现未处理的原料乳的特定样品中TGF-β2的浓度为约40ng/mL。本发明的组合物优选以约40ng/mL的百分比的量包含天然TGF-β2。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然白介素。优选地，如果与所述组合物中白介素的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的白介素。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然INF-γ。优选地，如果与所述组合物中INF-γ的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的INF-γ。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然α1-抗胰蛋白酶。优选地，如果与所述组合物中α1-抗胰蛋白酶的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的α1-抗胰蛋白酶。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然淀粉酶。优选地，如果与所述组合物中淀粉酶的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的淀粉酶。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然胆汁酸刺激酯酶。优选地，如果与所述组合物中胆汁酸刺激酯酶的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的胆汁酸刺激酯酶。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然胆汁酸刺激脂肪酶。优选地，如果与所述组合物中胆汁酸刺激脂肪酶的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的胆汁酸刺激脂肪酶。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然脂蛋白脂肪酶。优选地，如果与所述组合物中脂蛋白脂肪酶的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的脂蛋白脂肪酶。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然催乳素。优选地，如果与所述组合物中催乳素的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的催乳素。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然催产素。优选地，如果与所述组合物中催产素的总量相比，则所述组合物包含30%或更多、优选50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的催产素。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然叶酸结合剂。优选地，如果与所述组合物中叶酸结合剂的总量相比，则所述组合物包含50%或更多、优选60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的叶酸结合剂。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然IGF结合剂。优选地，如果与所述组合物中IGF结合剂的总量相比，则所述组合物包含50%或更多、优选60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的IGF结合剂。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然α-乳清蛋白。优选地，如果与所述组合物中α-乳清蛋白的总量相比，则所述组合物包含50%或更多、优选60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的α-乳清蛋白。
根据一个实施方案，所述组合物包含天然β-乳球蛋白。优选地，如果与所述组合物中β-乳球蛋白的总量相比，则所述组合物包含50%或更多、优选60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多处于天然形式的β-乳球蛋白。
根据一个实施方案，所述组合物包含选自天然乳铁蛋白、天然IgA、天然IgG、天然TGF-β1、天然TGF-β2及其组合的一种或多种。
根据一个实施方案，就各种蛋白质在所述组合物中的总量而言，本发明的经PEF处理的组合物包含的处于天然形式的乳铁蛋白、IgA、IgG、TGF-β1和TGF-β2的量对应于至少50%处于天然形式的乳铁蛋白、至少30%处于天然形式的IgA、至少50%处于天然形式的IgG、至少50%处于天然形式的TGF-β1和至少50%处于天然形式的TGF-β2。
优选地，所述组合物包含至少60%、优选65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多天然乳铁蛋白；40%或更多、45%或更多、50%或更多、55%或更多、56%或更多天然IgA；60%或更多、65%或更多、70%或更多、77%或更多、80%或更多天然IgG；55%或更多、60%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多天然TGF-β1；和/或60%或更多、70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多天然TGF-β2；其中所述百分比指组合物中各蛋白质的总量。
根据一个实施方案，所述经PEF处理的组合物包含选自以下的一种或多种：至少38mg/L天然乳铁蛋白、至少40.5μg/mL IgA、至少434μg/mLIgG、至少0.19ng/mL天然TGF-β1和至少20.7ng/mL天然TGF-β2。
根据一个实施方案，所述经PEF处理的组合物包含选自以下的一种或多种：至少50mg/L天然乳铁蛋白、至少60μg/mL IgA、至少600μg/mLIgG、至少0.25ng/mL天然TGF-β1和至少30ng/mL天然TGF-β2。
根据一个实施方案，所述经PEF处理的组合物包含选自以下的一种或多种：至少60mg/L天然乳铁蛋白、至少70μg/mL IgA、至少700μg/mLIgG、至少0.30ng/mL天然TGF-β1和至少35ng/mL天然TGF-β2。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含选自以下的一种或多种生物活性维生素：维生素A、D、E、K、B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12和C。
根据一个实施方案，本发明的组合物包含维生素A。热巴斯德消毒法通常完全破坏维生素A。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素A。
在未处理的原料乳样品中，发现每千克（每千克原料乳）含300μg维生素A。本发明的组合物优选包含维生素A，尤其当本发明的组合物是全脂乳时，则全脂乳中的维生素A的绝对量至少对应于以上的百分比。换言之，所述组合物含有每千克组合物150μg（50%）或更多、180μg（60%）或更多、210μg（70%）或更多、240μg（80%）或更多、255μg（85%）或更多、270μg（90%）或、285μg（95%）或更多维生素A。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素K。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多处于活性形式的维生素K。在全脂乳中，发现每千克全脂乳含约45μg维生素K。本发明的组合物优选包含维生素K，尤其当本发明的组合物是全脂乳时，则全脂乳中的维生素A的绝对量至少对应于以上的百分比（如就维生素A所说明的）。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素D。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多处于活性形式的维生素D。发现每千克全脂乳含约10μg维生素K。本发明的组合物优选包含维生素D，尤其当本发明的组合物是全脂乳时，则全脂乳中的维生素D的绝对量至少对应于以上的百分比。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素E。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多处于活性形式的维生素E。
由于就温度而言维生素K、D和E更稳定，所以与热巴斯德消毒法相比，本发明的组合物中这些维生素的水平的差异更小。
存在于全脂乳中的水溶性维生素的量基本上对应于存在于半脱脂乳、脱脂乳、降脂乳、低脂乳或无脂乳中的量，这是因为这些维生素基本上存在于全脂乳的无脂级分中。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素B1（硫胺素）。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素B1。
在未处理的全脂原料乳的样品中，测定每千克样品含约400μg维生素B1。本发明的组合物包含的维生素B1的量优选至少是见于全脂乳中的维生素B1的绝对量（对应于以上百分比）。换言之，本发明的组合物包含250μg（50%）或更多、300μg（60%）或更多的维生素B1。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素B2（核黄素）。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素B2。发现每千克未处理的全脂乳具有约1600μg维生素B2。本发明的组合物包含的维生素B2的量优选至少是见于全脂乳中的维生素B2的绝对量（对应于以上百分比）。根据一个实施方案，所述组合物包含维生素B3（烟酸）。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素B3。发现每千克未处理的全脂乳具有约800μg维生素B3。本发明的组合物包含的维生素B3的量优选至少是见于全脂乳中的维生素B3的绝对量（对应于以上百分比）。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素B5（泛酸）。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素B5。未处理的全脂乳每千克含约3000μg维生素B5。本发明的组合物包含的维生素B5的量优选至少是见于全脂乳中的维生素B5的绝对量（对应于以上百分比）。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素B6（吡哆醇）。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素B6。发现每千克未处理的全脂乳含有约400μg维生素B6。本发明的组合物包含的维生素B6的量优选至少是见于全脂乳中的维生素B6的绝对量（对应于以上百分比）。。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素B7（生物素）。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素B7。发现每千克未处理的全脂乳含有约20μg维生素B7。本发明的组合物包含的维生素B7的量优选至少是见于全脂乳中的维生素B7的绝对量（对应于以上百分比）。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素B9（叶酸）。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素B9。发现每千克未处理的全脂乳含有约50μg维生素B9。本发明的组合物包含的维生素B9的量优选至少是见于全脂乳中的维生素B9的绝对量（对应于以上百分比）。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素B12（钴胺素）。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素B9。每千克未处理的全脂乳含有约4μg维生素B12。本发明的组合物包含的维生素B12的量优选至少是见于全脂乳中的维生素B12的绝对量（对应于以上百分比）。
根据一个实施方案，所述组合物包含维生素C。优选地，与未处理的对照相比，所述组合物包含50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多处于活性形式的维生素C。发现每千克未处理的全脂乳含有约10mg维生素C。本发明的组合物包含的维生素C的量优选至少是见于全脂乳中的维生素C的绝对量（对应于以上百分比）。
几种维生素，尤其是维生素A、B1、B6、B9、B12、C和硫胺素中的一种或多种对热敏感。通常，在标准UHT处理例如乳或原料乳的过程中，至少10%的这些维生素例如由于破坏而丧失其活性。维生素A对UHT或热巴斯德消毒法尤其敏感，且至多100%的此维生素在这些处理中丧失。
因此，如果与未处理的对照相比，则本发明的组合物包含至少30%，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、更优选至少96%、97%和98%的这些维生素（A、B1、B6、B9、B12、C）中的一种或多种。以上值可能不适用于维生素A，尤其是在所述组合物无脂或具有降低的脂含量的情况下。
在标准热巴斯德消毒法的过程中，维生素A、B12、C和硫胺素中的一种或多种例如由于破坏而至少部分丧失其活性。通常，热巴斯德消毒法导致丧失至少10%的这些维生素。如果与未处理的对照相比，则本发明的组合物包含至少30%，优选至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、更优选至少96%、97%和98%的这些维生素中的一种或多种。
尤其当未处理的对照是乳，例如原料乳时，则可以根据本说明书中给出的各分子在未处理的原料乳中的绝对量，用维生素和其他生物活性分子的百分比来确定所述分子在组合物中的绝对量。
根据一个实施方案，即便所述组合物不是乳或原料乳，但包含一种或多种本文中指出的生物活性分子，所述组合物也优选以本说明书所示的或来源于本说明书的绝对量包含所述分子。所述绝对量尤其可以来源于原料乳中的所述分子的量和/或来源于本说明书中所示的活性分子/天然分子的百分比。
本发明的组合物优选具有低于每克组合物105cfu的活微生物计数。在认为是可接受或可以是无侵害的微生物负荷量方面，还参考"Verordnungüber Hygiene-und
Figure BDA0000473660780000421
an Milch und Erzeugnisse aufMilchbasis(Milchverordnung)",vom20.Juli2000,BundesgesetzblattJahrgang2000Teil I Nr.26,S.1178vom Juli2000,zuletztdurchBundesgesetzblatt Jahrgang2004Teil I Nr.58,S.2794vom12.November2004。关于对巴斯德消毒乳的要求，尤其参见"Anlage6"，尤其是3.1.1章。
优选地，根据本发明所述组合物在PEF处理后2、4、6、8、10、12、14、16或更多天具有低于每克组合物105cfu的cfu计数。在这些时间间隔中，所述组合物保持在4℃。通过在平皿上30℃培养，并计数菌落形成单位来确定活细胞计数。
优选地，根据本发明所述组合物在PEF处理后2、4、6、8、10、12、14、16或更多天具有低于每克组合物5x104cfu的cfu计数。在这些时间间隔中，所述组合物保存在4℃。
优选地，根据本发明所述组合物在PEF处理后2、4、6、8、10、12、14、16或更多天具有低于每克组合物104cfu的cfu计数。在这些时间间隔中，所述组合物保存在4℃。
优选地，根据本发明所述组合物在PEF处理后2、4、6、8、10、12、14、16或更多天具有低于每克组合物5x103cfu的cfu计数。在这些时间间隔中，所述组合物保存在4℃。
根据一个实施方案，本发明的组合物具有的货架期和/或稳定性与通过热巴斯德消毒法处理的其他相当组合物的稳定性和货架期基本相同。特别地，当保存在4℃时，所述组合物按天计的货架期与相当的热巴斯德消毒组合物的货架期基本相同。
对于本说明书的目的，如果组合物具有小于105、优选小于5x104、甚至更优选小于5x104、例如小于104、最优选小于5x103cfu/g的微生物计数（cfu），则认为它“在营养上安全”和/或“在微生物学上安全”。为了在营养上和/或在微生物学上安全，在将组合物保存于4℃时，且在本发明的PEF处理之后，这些微生物计数优选在至少4天、优选至少6、8、10天、最优选10天的时间内不超过所示的值。优选地，如果在4℃保存10天后，微生物计数不超过104cfu/g，则所述组合物在营养上安全。
最优选地，尤其是如果在25ml的组合物样品中不包含任何可检测到的营养性病原微生物，则所述组合物在微生物学上安全（见上文引用的"Milchverordnung"）。根据一个实施方案，所述组合物不包含任何可检测到的营养性病原微生物（pathogenic vegetative microorganism）。
-本发明的组合物的电导率为2至10mS/cm、优选2.5至7.0mS/cm、更优选3至5mS/cm、例如3.5至4.5mS/cm、最优选3.7至4.3mS/cm、例如约4mS/cm。
文献中在很大程度上报道了本说明书所涵盖的生物活性分子的有益性质。例如，乳铁蛋白具有抗氧化剂、抗癌和抗炎症性质。例如，诸如IgA和IgG的抗体赋予对诸如病毒或细菌的病原体的被动保护。例如，TGF-β是在婴儿中发展和维持适当的免疫应答所必需的，且提供针对不良免疫学结果，如变态反应的发展或慢性炎症病症的保护。例如，维生素作为催化剂发挥作用，因此是多种身体过程所必需的。例如，生长因子通过刺激细胞生长、增殖和细胞分化来调节多种细胞过程。例如，细胞因子、趋化因子和促炎因子/抗炎因子是有效的免疫所必需的免疫调节剂。例如，消化酶是新生儿对乳的最佳消化所必需的。例如，激素是在整个生物体内将信号从一个细胞传输至另一个细胞的信使，因此对免疫、代谢、身体发育及对所述生物环境的应答具有影响。例如，转运蛋白帮助上皮细胞同化大量营养物或微量营养物。
本发明的组合物可以用于治疗和/或预防与上述任一个或多个性质相关或对应于上述任一个或多个性质的任一种疾病或病症，或者可以用于促进根据上述生物活性中任意一种或多种的健康。本发明还涉及处理方法，所述方法包括对有需要的个体施用有效量和/或足够量的本发明的组合物的步骤。
实施例
以下实施例说明落在本发明的范围之内的一些产品及制备这些产品的方法。不认为它们以任何方式限制本发明。就本发明而言，可以进行改变和改良。技术人员将识别出这些实施例中的许多变化，其涉及大范围的配方、成分、处理和混合物，以为多种应用合理地调整本发明的营养物和其他成分。
实施例1：PEF系统
如图2中所示，构建了包含电源11（DIL电源HVP5）、电容器12、晶体管13（IGBT绝缘栅双极晶体管）和变压器14（DIL高压变压器
Figure BDA0000473660780000442
HVP5）的PEF系统。电源11可以将交流电转换为中间电压电平的直流电来使电容器充电。晶体管13可以使电容器周期放电，并产生脉冲电流，定义最大输出电流。利用多个晶体管，所述装置允许发出正脉冲或负脉冲。为了发出正脉冲，开启对角线排列的两个晶体管13。通过脉冲变压器提高放电脉冲的电压电平，同时降低峰电流。所述装置允许处理室1处最大24kV的电压和最大200A的电流。为了获得双极性脉冲，产生每个脉冲后改变极性。因此，在产生每一第二脉冲时，将开启对角线晶体管。
系统包含四个处理室，尤其是两对处理室。图4中可见一对共线处理室，其中4是使电极充电的电源，6和5显示接地母线，按照图1的图示，所述接地母线在此处分别定位于中央电极的上游和下游。图5更详细地显示处理室1的构造。可以看到由钛制成的电极4和6，以及由绝缘材料制成的外壳结构、封套或外罩16，其可以通过夹子9夹紧，以将处理室作为功能单位保持在一起。在这种方式中，通过卸下夹子9可以将处理室拆开，以例如用于清洁的目的。在处理室1的底部，可以看到内层元件30的上游端，可以在图6中更详细地看到所述内层元件30。
图6更详细地显示共线处理室1，用于图5的参考号指示相同的结构元件。两个O形环17形成两个电极4、6和绝缘连接体8之间的密封。还可以看到具有类似鱼雷的形式的内侧元件30，其占据在处理室内的轴向中央位置，且如标题为“Vorrichtung und Verfahren zurHochspannungsimpulsbehandlung im Ringspalt”的PCT/EP2011/051149和DE10 2010 001 279.3中所公开，所述内侧元件30通过迫使液体靠近处理室内壁移动来减少层流。图6的共线处理室具有10mm的直径。如图6中可见，外壳16由两个分开的绝缘件组成，所述绝缘件通过夹子9保持在一起。通过松开夹子9，可以将处理室的所有单个组件相互分开。在处理室的腔2中，通过绝缘连接体8来实现两个电极4、6的连接和分开。
测试的其他处理室设计包括这样的共线处理室，其如图6的共线处理室，但没有“鱼雷”插入物，且具有7mm的更小直径。还使用了具有所谓的场浓度（field-concentration）设计的处理室（未显示）。
实施例2：原料乳的PEF处理
对于所有实验，从德国Quakenbrück附近的一个农场获得原料乳。将原料乳装入双壁罐22（图3），并使用由加热器23控制的加热池（heatingbath）加热至希望的20℃、25℃或30℃。对于这些实验，使用如实施例1中所述的PEF系统。针对2bar的反压，将原料乳的流速调整至30L/小时，脉冲持续时间保持恒定在20μs。用脉冲频率的设定改变必能（见上文等式1）。试验以50Hz的频率开始，并使频率逐步增加至PEF系统的最大容量。
图3显示适于进行本发明的方法并用于本实施例的整个设备20。PEF系统10是上文实施例1中所述的ELCRACK HVP5系统。产品按箭头所示的方向通过产品路径。在两个处理室1下游提供出口25。在PEF处理系统10下游提供冷却器26，其允许降温以用于例如在4℃保存。
用温度传感器（test735,Testo AG Sales,Lenzkirch,德国）测量由PEF处理引起的温度升高。
实施例3：通过PEF处理进行的微生物灭活
选择具有不同电荷性质的两种革兰氏微生物菌株大肠杆菌（ATCC35218）和无害利斯特氏菌（DSM20649）用于试验。
将大肠杆菌在200mL Tryptone Soja Broth（CM,Oxoid limited,Hampshire,UK）中37℃振荡培养24小时。富集后，将微生物悬液加至预加热的乳，并如实施例2中所述进行PEF处理。
将经处理的样品稀释在选择性琼脂（Flurocult MacCONKEY琼脂,Merck,Darmstadt,德国）上。37℃培养24小时后，计数每克原料乳的菌落形成单位（cfu/g）。
革兰氏阳性无害利斯特氏菌在200mL One Bouillon Basis（CM1066B;Oxoid Limited;Hampshire;UK.）中37℃培养24小时。在接种和处理后，将样品稀释在Maximum Recovery Diluent溶液（CM0733;Oxoid Limited;Hampshire;UK.）中，并涂布在Palcam Agar Basis（CM0877B;OxoidLimited;Hampshire;UK.）上。接种的平皿在37℃培养48小时，然后计数每克的菌落形成单位。
对于货架期测试，分析了总的活细胞计数。因此，不用任何微生物接种原料乳。将冷却的样品（4℃）稀释在Maximum Recovery Diluent（CM0733,Oxoid Limited,Hampshire;UK.）中，并涂布在Plate CountAgar（CM0463B,Oxoid Limited,Hampshire,UK.）上。在30℃保存3天后，可以测定以每克的菌落形成单位（cfu/g）表示的总的活细胞计数。
结果可以在图7-10中看到。图7A和7B比较了原料乳的起始温度分别对大肠杆菌和无害利斯特氏菌的依赖于所施加的比能的微生物灭活的影响。对于图7A和B，使用了具有10mm直径而无插入物的共线处理室。灭活显示为log(N/N0)，N和N0分别是处理之后和处理之前的微生物计数（cfu/g）。可以看到，原料乳的起始温度对灭活的程度或效率有影响，30℃的起始温度导致最显著的微生物灭活。因此，对于所有进一步的实验，将原料乳的起始温度设为30℃。
图8显示在原料乳的起始温度为30℃，使用具有鱼雷插入物且具有10mm直径的两个共线处理室（图4和6）时，大肠杆菌和无害利斯特氏菌的灭活取决于比能。244kg/kJ比能处的垂直线表示在此能量下，微生物灭活至检出限以下。如从其他实施例中看到的，大量的生物活性蛋白质在此量的比能下保持天然。
图9A和9B比较处理室设计分别对大肠杆菌和无害利斯特氏菌取决于比能的微生物灭活的影响。可以看到，包含内侧元件的共线处理室导致最有效的灭活。换言之，后一种处理室需要最低的能量输入来实现给定的灭活。最大灭活为5.5个对数单位的减少。图中-5.5对数处的水平线表示检出限，其意指低于此线，不再能检测出活细胞计数。
图10A和10B显示PEF处理后微生物（分别为大肠杆菌和无害利斯特氏菌）的灭活作用取决于乳的最终温度。温度升高由所施加的比能的增加引起。处理室设计对最终温度的影响变得显而易见。结果显示，最终温度不仅取决于所施加的比能，还取决于处理室的设计，且较低的最终温度足以获得重要的灭活。场浓度处理室导致最高的最终温度，这就是为什么本发明优选不使用这类处理室。另一方面，在使用具有内侧元件的共线处理室时，测量到了最低的最终温度。
下表1显示在使用插入物形式的内部元件的共线处理室中使用比能进行的PEF处理的最终温度。
表1：在具有10mm直径和图6的插入物的处理室中进行PEF处理后，原料乳的最终温度和微生物灭活。
Figure BDA0000473660780000471
Figure BDA0000473660780000481
应指出，N是PEF处理后的细胞计数（cfu），N0是处理前的细胞计数。可以看到，根据本发明的PEF处理实现了5个对数单位或以上的微生物灭活。
基于实施例2-3中进行的试验，确定了PEF处理的最有利条件。发现处理室设计、所施加的比能和起始温度影响PEF处理的结果。
基于这些结果，使用具有“鱼雷”插入物的10mm共线处理室，起始温度通常设为30℃，脉冲持续时间为20μs，场强12kV/cm，针对2bar的反压，原料乳的流速为30kg/小时。这些是优选的PEF处理参数。
实施例3：PEF处理对原料乳的pH值、电导率和颜色的影响
在70至373kJ/kg的比能范围内，原料乳的pH值（6.9）不受PEF处理影响。多达约309-310kJ/kg的比能未改变原料乳的电导率（3.9）。在更高的比能下，观察到了电导率的降低（在344kJ/kg下约为3.75，在373kJ/kg下为3.25）。
测定L*因子（亮度/暗度）的实验显示，在约250至350kJ/kg范围内的比能下，PEF处理未引起原料乳可感知的颜色变化。
实施例4：PEF处理对原料乳中生物活性物质的影响
4.1材料和方法
通过使用ELISA测试试剂盒来分析原料乳中的五种生物活性物质。用ELISA酶标仪（EL800,Bio-Tek Instruments;Winooski;USA）和软件KCjunior（KCjunior;Bio-Tek Instruments;Winooski;USA）获得结果。
在PEF处理后，冷冻样品（未显示冷冻会影响活性蛋白质的含量）。分析前，在4℃以10000U/分钟（10621*g）离心样品10分钟。弃去含有大部分脂肪的上清液，用流体相进行进一步的研究。按照厂家的说明进行ELISA分析。
用来自Bethyl Laboratories（乳铁蛋白ELISA定量组;目录号E10-126;Bethyl Laboratories Inc.;Montgomery;USA）的ELISA测试和所需的溶液（（ELISA终止液，目录号E115；TMB过氧化物酶底物（溶液A+B），目录号E102；微量滴定板，目录号C3041；Bethyl Laboratories,Inc.;Montgomery;USA））定量活性乳铁蛋白。按试剂盒说明书中所述进行分析。
对于其他生物活性物质的分析，使用了以下ELISA试剂盒：
IgA：牛IgA ELISA试剂盒E11-121;Bethyl laboratories Inc.;Montgomery;USA
IgG：牛IgG ELISA试剂盒E11-118;Bethyl laboratories Inc.;Montgomery;USA
TGF-β1：多物种TGF-β1ELISA;ibt-immunological&biochemicaltest systems GmbH;Reutlingen;G.
TGF-β2：多物种TGF-β2ELISA;ibt-immunological&biochemicaltest systems GmbH;Reutlingen;G.所有分析均按照试剂盒说明书进行。
4.2PEF处理对乳铁蛋白含量的影响
使用实施例3中确定的优选PEF处理参数，进行试验来评估PEF处理对乳铁蛋白的存在的影响。对于这些试验，除比能外，所有处理参数均恒定。
如图11中可见，乳铁蛋白对PEF处理敏感，且所述乳铁蛋白的量随比能的逐渐增加而减少。但是，对于本发明的目的，在对应于灭活大肠杆菌和无害利斯特氏菌所需的244kJ/kg的比能（图中的垂直线）下，超过约85%（64mg/L）的最初的乳铁蛋白（76mg/L）仍可通过ELISA检测到，因此所述乳铁蛋白以天然形式，并以活性形式存在。乳铁蛋白的量在高于约280-300kJ/kg的比能下开始更明显地降低。
4.3PEF处理对IgA含量的影响
如图12中可见，在用具有对应于灭活大肠杆菌和无害利斯特氏菌所需的244kJ/kg比能（图中的垂直线）的PEF处理后，超过约56%（77.4μg/mL）的最初的IgA（136.3μg/mL）仍可通过ELISA检测到，因此所述IgA以天然形式、并以活性形式存在。
4.4PEF处理对IgG含量的影响
如图13中可见，在用具有对应于灭活大肠杆菌和无害利斯特氏菌所需的244kJ/kg比能（图中的垂直线）的PEF处理后，超过约80%（703μg/mL）的最初存在于原料乳中的IgG（868μg/mL）仍可通过ELISA检测到，因此所述IgG以天然形式、并以活性形式存在。
4.5PEF处理对TGF-β1含量的影响
如图14中可见，在用具有对应于灭活大肠杆菌和无害利斯特氏菌所需的244kJ/kg比能（图中的垂直线）的PEF处理后，超过约89%（0.34ng/mL）的最初存在于原料乳中的TGF-β1（0.38ng/mL）仍可通过ELISA检测到，因此所述TGF-β1以天然形式、并以活性形式存在。通常，在比能的整个范围内，TGF-β1含量在0.35ng/mL的平均值附近波动。TGF-β1含量基本上不受PEF处理影响。
4.6PEF处理对TGF-β2的影响
如图15中可见，TGF-β2含量基本上不受PEF处理影响。在用具有对应于灭活大肠杆菌和无害利斯特氏菌所需的244kJ/kg比能（图中的垂直线）的PEF处理后，通过ELISA未检测到最初存在于原料乳中的TGF-β1（41.4ng/mL）的显著降低。
综上所述，根据本发明的PEF处理适于有效降低液体组合物或黏性组合物中的微生物负荷量。同时，所述处理基本上不破坏或不完全破坏天然存在于原料乳中的生物活性蛋白质或其他分子。尽管经过根据本发明的PEF处理，但重要量的这些生物活性分子仍保持天然/活性。
图16通过显示适于显著降低微生物负荷量的PEF处理对不同生物活性分子含量的影响来总结此实施例的结果。
实施例5：经PEF处理的组合物的货架期
分析并比较了原料乳和经PEF处理的原料乳的货架期（见实施例3中的方法）。
分别施加不同的比能：0（原料乳）、65、210、244和314kJ/kg。结果显示在图17中。如可以看到，除未处理的原料乳和在65kJ/kg下进行PEF处理的乳外，所有样品都在4℃的14天货架期内显示低于105cfu/g的活细胞计数。后两个样品在4天后显示高细胞计数，由于高细菌生长，终止了对这些样品进行的实验，未报道进一步的数据。因此，未处理的乳和在65kJ/kg下处理的乳的货架期在4℃下低于4天。对于经处理的其他样品，获得了4℃下为14天或更长的货架期。

Claims (16)

1.用于降低包含一种或多种天然存在于乳中的生物活性分子的液体组合物或黏性组合物的微生物负荷量的方法，所述方法包括对所述组合物进行脉冲电场（PEF）处理的步骤，其中在所述PEF处理中，所述组合物暴露于每千克组合物600kJ或更低的比能，其中所述组合物暴露于场强为10至20kV/cm的PEF。
2.权利要求1的方法，其中在所述PEF处理中，应用10μs或更长的脉冲持续时间，优选15μs或更长的脉冲持续时间。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中在所述PEF处理中，应用方波电脉冲和/或双极性脉冲。
4.前述权利要求中任一项的方法，其是连续方法和/或其中连续地对所述组合物进行所述PEF处理。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中在进行所述PEF处理之前将所述组合物的温度设为20℃-45℃的温度。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中在一个或多个具有腔的共线处理室中应用所述PEF处理，其中将所述组合物连续地引导通过所述共线处理室的所述腔，且其中在所述腔中提供内侧元件，使得在所述处理室内将所述组合物引导至所述内侧元件周围。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述组合物包含选自以下的一种或多种，或基本上由选自以下的一种或多种组成：全脂乳、半脱脂乳、脱脂乳、初乳、降脂乳、低脂乳、无脂乳、乳清（乳浆），如甜乳清或酸乳清、基于乳的饮料、酸奶、冷冻酸奶、酸奶饮料、冰淇淋、奶油、黄油、鲜干酪、凝乳和干酪；前述任一种的粉末或其他干燥形式；以及包含前述两种或多种的组合的组合物。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述一种或多种生物活性分子独立地选自天然存在于乳中的天然蛋白质、生物活性脂质、唾液酸、核苷酸、寡糖、氨基酸、牛磺酸和维生素。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述一种或多种生物活性分子选自生物活性蛋白质，所述蛋白质选自抗菌因子、免疫球蛋白、生长因子、细胞因子和/或促炎因子/抗炎因子、趋化因子、酶，包括消化酶、蛋白质激素、转运蛋白、糖巨肽、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白及前述两种或多种的组合，其中在对所述组合物进行PEF处理的步骤之后，至少30%的所述蛋白质以天然形式存在。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所实现的微生物负荷量的减少为至少4个对数单位。
11.包含生物活性分子的组合物，所述组合物通过前述权利要求中任一项的方法获得。
12.经脉冲电场（PEF）处理的组合物，其在微生物学上安全，且其包含一种或多种天然存在于乳中的蛋白质，其中至少30%的各种蛋白质处于天然形式。
13.权利要求12的组合物，其中所述蛋白质选自抗菌因子、免疫球蛋白、生长因子、细胞因子和/或促炎因子/抗炎因子、趋化因子、酶，包括消化酶、蛋白质激素、转运蛋白、糖巨肽、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白及前述两种或多种的组合，其中至少30%的所述蛋白质以天然形式存在。
14.权利要求12-13中任一项的组合物，其中所述一种或多种蛋白质选自免疫球蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和TGF-β。
15.权利要求12-14中任一项的组合物，其包含乳铁蛋白，其中在所述组合物中至少75%的总乳铁蛋白以天然形式存在。
16.权利要求12-15中任一项的组合物，其包含选自以下的一种或多种：初乳、全脂乳、半脱脂乳、脱脂乳、降脂乳、低脂乳、无脂乳、乳清（乳浆），如甜乳清或酸乳清、基于乳的饮料、酸奶、冷冻酸奶、酸奶饮料、冰淇淋、奶油、黄油、鲜干酪、凝乳和干酪；前述任一种的粉末或其他干燥形式；以及包含前述两种或多种的组合的组合物。
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