CN103789244B - 一株无芽孢短小杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株无芽孢短小杆菌及其应用。所述无芽孢短小杆菌为无芽孢短小杆菌（Curtobacterium？sp.）13-13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？No.M2014009。本发明的无芽孢短小杆菌13-13能够用于多穗柯发酵茶生产，得到的多穗柯发酵茶中儿茶素、茶黄素、茶多酚和黄酮的含量高，而且其茶色形成较好。
Description
技术领域
本发明涉及发酵茶技术领域，尤其涉及一株无芽孢短小杆菌及其在发酵茶生产中的应用。
背景技术
发酵茶具有清脂肪，减肥胖；清肠胃，助消化；清血管，降三高；清毒素，护胃、肝、肾等功效。目前，用于制备发酵茶的微生物主要是真菌。
多穗柯，也叫甜茶，是一种具有很高利用价值的野生植物资源，湖南雪峰山一带分布广泛，营养丰富，成分齐全，含有丰富的黄酮类和茶多酚类化合物，具有防治高血压、治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮等症，并具有滋养肝肾、和胃降逆、润肺止咳、解困醒酒等作用。目前对于其应用主要集中于绿茶的加工。
中国发明专利申请CN 101869339A公开了一种多穗柯发酵保健饮料的制备方法，步骤如下：（1）将多穗柯甜茶叶加入水中，加热煮沸，保持沸腾10～20min，静置使多穗柯甜茶叶沉淀，取上部清液作为甜茶液；（2）选取酵母菌发酵液、醋酸菌发酵液和乳酸菌发酵液作为发酵菌液；（3）在甜茶液中接入发酵液，加糖，30℃静置培养48～72h，取滤液作为多穗柯发酵保健饮料。该发明专利申请用多穗柯甜茶作为培养基，与乳酸菌、醋酸菌、酵母菌发酵，制备的多穗柯发酵保健饮料具有多种保健功能及天然风味。但是其对多穗柯甜茶中儿茶素、茶黄素、茶多酚和黄酮等具有保健功能的成分的保持较差，而且其茶色形成不佳。
本领域亟需寻找能够较好地保持茶叶中具有保健功能的成分并且其茶色形成优异的微生物，以用于高品质的发酵茶的生产中。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株无芽孢短小杆菌及其在发酵茶生产中的应用，使用本发明的无芽孢短小杆菌生产的发酵茶中保健功能的成分的含量高。
本发明所提供的无芽孢短小杆菌具体为无芽孢短小杆菌（Curtobacteriumsp.）13-13，该菌株已于2014年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉大学，邮政编码：430072），保藏编号为CCTCC No.M2014009。
本发明所提供的无芽孢短小杆菌13-13的特征如下：
1）菌落特征：圆形菌落，乳黄色，表面湿润，外围没有锯齿边缘整齐，菌落直径较小。
2）革兰氏染色：杆状，粗短，呈红色，革兰氏阴性菌。
3）生理生化鉴定结果如表1所示：
表1无芽孢短小杆菌13-13生理生化试验结果
4）分子生物学鉴定：
通过PCR、测序和序列比对技术对无芽孢短小杆菌13-13的16SrDNA进行分析，发现其与已经公开的无芽孢短小杆菌（Curtobacterium）的16SrDNA的同源性达到98.2%以上。
本发明的目的之一还在于提供一种使用上述无芽孢短小杆菌13-13生产发酵茶的方法，包括将所述无芽孢短小杆菌13-13接种于茶叶中进行发酵的步骤。
作为上述方法的优选，所述茶叶为多穗柯，所述发酵茶为多穗柯发酵茶。
作为上述方法的优选，将所述无芽孢短小杆菌13-13与其它茶叶发酵菌一起接种于茶叶中进行发酵。其中，所述其它茶叶发酵菌是米曲霉（Aspergillusoryzae）和/或短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。
本发明的目的之一还在于提供一种上述无芽孢短小杆菌13-13在发酵茶生产中的应用。
作为上述应用的优选，所述发酵茶为多穗柯发酵茶。
作为上述应用的优选，在所述应用中将所述无芽孢短小杆菌13-13接种于茶叶中进行发酵。
作为上述应用的优选，将所述无芽孢短小杆菌13-13与其它茶叶发酵菌一起接种于茶叶中进行发酵。其中，所述其它茶叶发酵菌是米曲霉（Aspergillusoryzae）和/或短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。
本发明的有益效果为：本发明通过筛选得到了一株无芽孢短小杆菌13-13，其用于多穗柯发酵茶生产，得到的多穗柯发酵茶中儿茶素、茶黄素、茶多酚和黄酮的含量高，而且其茶色形成较好。
附图说明
图1为本发明中无芽孢短小杆菌13-13培养物的照片，优势菌2所指示的菌落即为本发明的无芽孢短小杆菌13-13的菌落，图中显示其菌落特征为圆形菌落，乳黄色，表面湿润，外围没有锯齿边缘整齐，菌落直径较小。
图2为使用本发明的无芽孢短小杆菌13-13发酵生产的多穗柯发酵茶冲泡后的茶色与原茶（发酵前）冲泡后的茶色比较结果，可见冲泡之后，多穗柯发酵茶的茶色呈棕褐色（B），与原茶的淡绿色（A）明显不同。
保藏说明：
菌种名称：无芽孢短小杆菌
拉丁名：Curtobacterium sp.
菌株编号：13-13
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国，武汉大学（武汉市武昌区珞珈山）
保藏日期：2014年1月7日
保藏中心登记入册编号：CCTCC No.M2014009
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1：菌株的分离和筛选
1）原材料（自然发酵茶）的处理
称取采用本实验室常规方法发酵获得的多穗柯自然发酵茶5g于无菌三角瓶中，加入50mL无菌水，震荡30min，得10-1稀释液；再用lmL移液器，吸取10-1稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-3、10-4、10-5等一系列稀释菌液。
2）分离、培养自然发酵茶中优势微生物
将培养基平板编号，然后用移液枪吸取10-3、10-4、10-5稀释菌液各0.2mL对号接种在不同稀释度编号的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，自然pH），再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂布均匀，室温静置5～10min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，28℃培养2天，观察记录各平板上菌落的生长情况。选择10株菌落形态各异，且在平板上出现频率较高的单菌落作为自然发酵茶中可培养优势微生物。
3）用优势微生物发酵多穗柯
将上述10株优势微生物与常用于制备发酵茶的真菌（酿酒酵母1905、米曲霉40013、假丝酵母31268和黑曲霉40006）分别进行纯种发酵。
具体如下：
（1）菌种的活化：将上述10株优势微生物与常用于制备发酵茶的真菌（酿酒酵母1905、米曲霉40013、假丝酵母31268和黑曲霉40006）分别接种于PDA液体培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%，自然pH），28℃，活化培养至各菌液浓度为106cfu/mL。
（2）初渥堆：将400mL每种上述活化培养的菌液分别接种于装有多穗柯绿茶500g的无菌三角瓶中，混合均匀，进行初渥堆，适时监测发酵温度，当发酵堆温达到50～55℃时，及时进行翻堆散热，待堆温降到室温再将茶叶收堆，继续发酵直到出现粘汁，发出醇香为止，期间需要5～7天。
（3）复揉：初渥堆过的茶坯，倒出无菌三角瓶，无菌操作，再次进行揉捻，使茶坯水分分布均匀。
（4）再渥堆：将上述复揉后的茶坯收集起来，再次渥堆，堆高60～80cm，堆宽1.0～1.5cm，渥堆2～3天，期间要适时观察含水情况，根据茶坯的水分高低及时调整补充水分，用喷壶均匀加水，控制茶坯含水量在25%以内。当堆温达到50～55℃时，及时进行翻堆散热，适当加5～7次水，持续至叶色变为红褐或黑褐，发出醇香为止，期间需要12～15天。
（5）蒸压：105℃蒸压5min，将茶坯以蒸汽蒸软，再采用压片机加以压紧。
（6）陈化：将茶叶晾置环境清洁、阴凉干燥可通风、无异杂味的环境中，至茶叶温度降至常温，茶叶含水量降至16%以下后，放进阴凉的地方进行陈化，经陈化后，汤色变得更红浓，且产生陈味，形成黑茶红、浓、醇、陈的特点，得到成品茶。
4）经陈化3个月后的发酵茶中各成分测定
对各纯种发酵茶进行感官鉴定和理化鉴定。理化鉴定主要涉及发酵茶中儿茶素、茶黄素、茶红素、黄酮类化合物和茶多酚类化合物等的测定，结果如表2所示。
其中，儿茶素采用香草醛-浓盐酸比色法（刘坤,伏圣青,高华,等.茶叶中儿茶素含量的快速测定方法研究[J].青岛大学学报(工程技术版),2010,25(4):87-90）进行测定。
茶黄素和茶红素的测定方法如下：
（1）称取3.00g茶样，置于250mL三角烧瓶中加沸水125mL，在沸水浴上提取10min，浸提中搅拌2～3次，浸提完毕，趁热抽滤于干燥三角瓶中，冷却至室温。
（2）吸取上述供试液25mL于100mL分液漏斗中，加乙酸乙酯25mL，振摇5min，静置待分层后，将乙酸乙酯层（上层）和水层（下层）分别置于100mL具塞三角瓶，将瓶塞塞好备用。
（3）吸取乙酸乙酯萃取液2mL，放在25mL容量瓶中，加入95％乙醇定容得a液（TFs+TR SⅠ）。
（4）吸取乙酸乙酯萃取液15mL，加入2.5%NaHCO3溶液15mL，在50mL分液漏斗中迅速强烈振荡30s，静置分层后，弃去NaHCO3水层。吸取乙酸乙酯上层液4mL，放入25mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度得c液（TFs）。
（5）吸取第一次水层待用液2mL，放入25mL容量瓶中，加入2mL饱和草酸溶液和6mL水，并用95%乙醇定容至刻度得d液（TR SⅡ+TBs）。
（6）分别吸取25mL供试液和25mL正丁醇放入100mL分液漏斗中，摇振3min，待分层后将水层（下层）放于50mL三角瓶中，取水层液2mL于25mL容量瓶中，分别加2mL饱和草酸溶液和6mL蒸馏水，再用95%乙醇定容至刻度，得b溶液（TBs）。
（7）用1cm比色皿，以95%乙醇作空白参比，在380nm波长处分别测定各溶液的吸光度A。
（8）结果计算：
茶黄素（％）=Ac×2.25/（m×w）×100%
茶红素（％）=（2Aa+2Ad-Ac-2Ab）×7.06/（m×w）×100%
式中，m—试样质量（g）；
W—试样干物质含量（%）；
Aa—溶液a的吸光度；
Ab—溶液b的吸光度；
Ac—溶液c的吸光度；
Ad—溶液d的吸光度；
2.25和7.06—均为在同等操作条件下的换算系数。
黄酮类化合物含量采用芦丁比色法进行测定，具体如下：
（1）芦丁标准曲线的制备：精确称取芦丁纯品0.01g用50%的乙醇溶解，摇匀，稀释至0.1g/L的芦丁标准液。分别吸取上述芦丁标准液0.00mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL和5.0mL于10mL的比色管中，用50%的乙醇稀释至5.00mL，加入5%亚硝酸纳0.3mL，静置6min，加入5%硝酸铝0.3mL静置6min，加入4%氢氧化钠4mL，用50%的乙醇定容，静置12min，于540nm处比色。以芦丁溶液的浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，计算方程。
（2）样品中黄酮类化合物含量测定：准确称取1.000g干燥研碎的茶叶于锥形瓶中，按1:70的固液比，加入50%乙醇，80℃水浴5h，抽滤，茶汤转至100mL的容量瓶中，50%乙醇定容，比色，计算。
茶多酚采用酒石酸铁比色法（高玉萍,涂云飞,杨秀芳,等.茶茶多酚制品中茶多酚含量测定方法比较研究[J].中国茶叶加工2013，（3）:28～32）进行测定。
表2纯种微生物多穂柯发酵茶中关键成分测定结果
由表2可以看出，优势菌2制备的发酵茶在关键成分茶黄素、茶多酚和黄酮等含量上具有较明显优势，由此可以认定，优势菌2用于制备发酵茶，有利于发酵茶茶色的形成；且对发酵茶中具有保健功能的成分儿茶素、黄酮类化合物和茶多酚类化合物有保护作用。因此，选择优势菌2作为用于制备发酵茶的优势微生物。
实施例2：菌株的鉴定
1）菌落特征：
将优势菌2划线到糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，自然pH），然后将平板倒转，28℃培养2天，观察记录平板上菌落的生长情况。图1显示优势菌2的菌落特征大体上如下：圆形菌落，乳黄色，表面湿润，外围没有锯齿边缘整齐，菌落直径较小。
2）革兰氏染色：杆状，粗短，呈红色，革兰氏阴性菌。
3）生理生化鉴定
（1）氨苄青霉素钠培养基：在PDA平板培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，自然pH）中添加终浓度为100mg/mL的氨苄青霉素钠，接种优势菌2，28℃培养2天，观察优势菌2在添加有氨苄青霉素钠的PDA平板培养基上的生长情况，鉴定该菌株是否具有氨苄青霉素抗性。优势菌2在添加有氨苄青霉素钠的PDA平板培养基上不能生长，证明其不具有氨苄青霉素抗性。
（2）氯霉素培养基：在PDA平板培养基中添加终浓度为25mg/mL的氯霉素，接种优势菌2，28℃培养2天，观察优势菌2在添加有氯霉素的PDA平板培养基上的生长情况，鉴定该菌株是否具有氯霉素抗性。优势菌2在添加有氯霉素的PDA平板培养基上不能生长，证明其不具有氯霉素抗性。
（3）煮沸：将活化态优势菌2放入沸水浴中加热20min，然后按常规方法进行培养，观察优势菌2是否具有耐热性。优势菌2煮沸后不能生长，证明其不具有耐热性，无芽孢。
（4）革兰氏染色：先将优势菌2涂片固定，草酸铵结晶紫染1min，自来水冲洗，加碘液覆盖涂面染约1min，水洗，用吸水纸吸去水分，加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s后水洗，吸去水分。蕃红染色液（稀）染1min后，自来水冲洗。干燥，镜检呈紫色的为革兰氏阳性菌，呈粉红色的为革兰氏阴性菌。优势菌2呈粉红色，为革兰氏阴性菌。
（5）过氧化氢酶试验：以无菌操作，用接种环挑取活化态优势菌2一环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，28℃恒温培养，观察结果，试管内产生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。革兰氏阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。优势菌2过氧化氢酶试验结果为阴性。
（6）葡萄糖酵解试验：以无菌操作，用接种环移取活化态优势菌2一环，接种于发酵液体培养基管中，28℃培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸，酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色；不产酸，则最后溶液为指示剂的紫色），有无气泡，微小气泡亦为产气阳性。优势菌2葡萄糖酵解试验结果为不产酸不产气。
（7）V--P试验：以无菌操作，用接种环移取活化态优势菌2一环，接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，28℃培养2天，加入50g/Lα-萘酚（95％乙醇溶液）0.6mL，轻轻振摇试管，然后加0.2mL400g/L KOH溶液，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。试管液中颜色变为红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。优势菌2的V--P试验结果为阳性。
（9）淀粉水解试验：以无菌操作，用接种环移取活化态优势菌2一环，接种于淀粉固体培养基上，28℃培养2天，往培养基中加碘液染色，优势菌2能分泌胞外淀粉酶，利用了菌落周围的淀粉，使得碘液染色后，菌落周围不呈蓝色，而是呈现无色透明圈。
4）分子生物学鉴定：
通过PCR、测序和序列比对技术对无芽孢短小杆菌13-13的16SrDNA进行分析，发现其与已经公开的无芽孢短小杆菌（Curtobacterium）的16SrDNA的同源性达到98.2%以上。
综合菌落形态、菌体形态、生理生化试验和分子生物学结果，将其命名为无芽孢短小杆菌（Curtobacterium sp.）13-13。
5）保存自然发酵茶中优势微生物
用PDA斜面管保存于4℃冰箱或用PDA液体培养基制成孢子悬液加30%灭菌甘油于-70℃冰箱保存。无芽孢短小杆菌13-13已向中国典型培养物保藏中心提交保藏，保藏号为CCTCC No.M2014009。
实施例3：无芽孢短小杆菌13-13纯种发酵的多穗柯发酵茶的冲泡效果
取5g按照实施例1中3）的方法采用无芽孢短小杆菌13-13进行纯种发酵得到的多穗柯发酵茶和5g原茶（发酵前）分别用开水冲泡15分钟，比较其茶色和口感。
图2显示了使用本发明的无芽孢短小杆菌13-13发酵生产的多穗柯发酵茶冲泡后的茶色与原茶（发酵前）冲泡后的茶色比较结果，可见冲泡之后，多穗柯发酵茶的茶色呈棕褐色（B），与原茶的淡绿色（A）明显不同。制得的多穗柯发酵茶口感柔和、醇香，并带有多穂柯本身所具有的甜味。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (6)
1.一株无芽孢短小杆菌(Curtobacterium sp.)13-13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2014009。
2.使用权利要求1所述的无芽孢短小杆菌13-13生产发酵茶的方法，包括将所述无芽孢短小杆菌13-13接种于茶叶中进行发酵的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述茶叶为多穗柯，所述发酵茶为多穗柯发酵茶。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，将所述无芽孢短小杆菌13-13与其它茶叶发酵菌一起接种于茶叶中进行发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述其它茶叶发酵菌是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
6.权利要求1所述的无芽孢短小杆菌13-13在发酵茶生产中的应用。
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Address after: 419300 Red Garden Industrial Park, Xupu Industrial Zone, Huaihua, Hunan Patentee after: Hunan Aokang Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 419300 Red Garden Industrial Park, Xupu Industrial Zone, Huaihua, Hunan Patentee before: HUNAN AOKANG BIO-TECH CO.,LTD. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Bacillus subtilis without spores and its application Granted publication date: 20151104 Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Xupu Branch Pledgor: Hunan Aokang Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2024980027535 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |