CN109287810B - 一种微球菌及其在制备溆浦瑶茶后发酵茶中的应用和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株微球菌及其应用和应用方法，所述微球菌为微球菌QB08，于2018年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2018489。本发明的微球菌QB08能够用于制备溆浦瑶茶后发酵茶生产，得到的溆浦瑶茶后发酵茶中茶黄素、茶红素和黄酮的含量高，发酵后的茶叶茶多酚含量有一定程度的降低，避免过高浓度的茶多酚对肠胃的刺激，又能保留一定的茶多酚给予机体适当营养成分。

Description

一种微球菌及其在制备溆浦瑶茶后发酵茶中的应用和方法

技术领域

本发明属于食品加工领域，特别涉及一种微球菌及其在制备溆浦瑶茶后发酵茶中的应用和方法。

背景技术

溆浦瑶茶以产自湖南雪峰山脉木姜叶柯[Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun]的叶或嫩枝(芽)为原料生产而成。木姜叶柯又名多穗柯、多穗石柯 (LilhocarpusPolystachys Rehd)，系壳斗科常绿乔木，主要分布于我国长江以南各省区的山林中，其中湖南省中西部雪峰山一带产量较多。溆浦瑶茶中甜味来自天然、低热量、甜度在蔗糖300倍以上的黄酮类化合物。具有“三抗” (抗氧化、抗癌变、抗过敏)和“三降”(降血压、降血糖、降血脂)的独特作用。植物黄酮可高效修复人体DNA损伤、促进细胞自噬、激活细胞代谢、有效促进身体中枢肝脏的解毒、排毒功能。特别对于预防因衰老引起的心血管问题、高血压、癌症等具有至关重要的意义。以木姜叶柯叶制成的茶在湖南、贵州、江西等地民间已有很长的食用历史，其主要功能性成分为黄酮类化合物、三萜类化合物和多酚类化合物，具有很好的降脂、抗肿瘤、抗氧化和抗过敏功效，故此亦被誉为"树上的虫草"。溆浦瑶茶后发酵茶均有很高的保健功效，在降血脂、防止人体血管硬化、抗氧化、抑菌等方面发挥着重要作用。经检测，溆浦瑶茶含高达9-14％的植物黄酮及铁、镁、锌、硒、维生素等多种微量元素及营养成分。每公斤瑶茶中硒含量超过50微克，已超过国家富硒标准；镁含量每公斤高达3570毫克，能有效调节人的心脏活动，降低血压，提高男士的生育能力；锌含量68毫克，是苹果的30倍，在人体生长发育、生殖遗传、免疫、内分泌等生理过程中起到极其重要的作用；铁含量 340毫克，是猪肉含量的12倍，可有效降低缺铁性贫血。后发酵茶是将茶叶进行酶性氧化，形成茶黄素、茶红素等深色物质，进一步使茶中化学物质发生转化，减少茶多酚的含量，如何找到更好的菌株及其发酵方式使得这些有效成分能在冲泡过程中有效释放，进而开发溆浦瑶茶后发酵的袋装茶方便人们使用。

发明内容

目前溆浦瑶茶后发酵茶主要采取自然发酵，发酵周期难于精确控制，独特的有效食用成分木姜叶柯茶素、黄酮类物质、三萜烯类化合物等分解释放情况批间重复性差异明显，从而影响到茶叶的口感、营养等品质。并且难于控制杂菌生长造成茶叶发酵失败，有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微球菌，通过从自然发酵的木姜叶柯茶毛茶中进行菌株分离培养筛选，获得能安全高效的发酵溆浦瑶茶后发酵的微球菌菌株。以解决杂菌生长发酵毛茶失败的问题。

目的之二在于提供一种微球菌在制备溆浦瑶茶后发酵茶中的应用。

目的之三在于提供一种微球菌制备溆浦瑶茶后发酵茶的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一株微球菌(Micrococcus SP.)QB08，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2018489。

2.所述的微球菌QB08在制备后发酵茶中的应用。

进一步，所述后发酵茶为溆浦瑶茶后发酵茶。

3.应用微球菌QB08制备后发酵茶的制备方法，包括将所述微球菌QB08接种于茶叶中进行发酵的步骤。

进一步，所述茶叶为溆浦瑶茶。

进一步，所述微球菌QB08接种比例为每100g溆浦瑶茶接种微球菌 6×10⁷-10⁸cfu/ml。

进一步，所述制备方法的步骤包括将溆浦瑶茶调节水分至40～45％，再接种微球菌QB08，静止发酵16天以上，最后烘干。

4.以上任一项所述制备方法制备的溆浦瑶茶后发酵茶。

5.更提供一种将所制备的溆浦瑶茶后发酵茶制备溆浦瑶茶后发酵茶袋装茶。

进一步，所述袋装茶中茶叶粒度为60-80目，净含量为1.0-1.2克。

本发明的有益效果在于：从自然发酵的溆浦瑶茶中分离筛选出微球菌，得到纯度较高的微球菌菌株并保存使用。菌株发酵扩增后用于溆浦瑶茶毛茶后发酵，发酵后的茶叶茶多酚含量有一定程度的降低，避免过高浓度的茶多酚对肠胃的刺激，又能保留一定的茶多酚给予机体适当营养成分；同时提高茶黄素：茶红素的比例，使发酵茶茶汤的茶色越好，还显著增加了溆浦瑶茶后发酵茶茶汤中的黄酮含量。进一步将发酵后的茶叶粉碎、过筛，配置成袋泡茶，且袋装茶泡茶汤后功能性成分几乎不变。袋泡茶作为一种新型的茶饮品，袋泡茶具有冲泡方便，风味独特，不受原料产地、季节性限制等优点，适应于现在越来越快的生活节奏，深受消费者喜爱，具有广阔的市场前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为菌株生长OD曲线；

图2为袋泡茶成品图；

图3为袋泡茶及茶汤俯视图；

图4为茶汤俯视图。

保藏说明：

菌种名称:微球菌QB08

拉丁名：Micrococcus SP.QB08

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国.武汉.武汉大学(武汉市武昌区珞珈山)

保藏日期：2018年7月16日

保藏中心登记入册编号：CCTCC No：M2018489

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

试验材料和试验试剂

溆浦瑶茶，购自溆浦瑶茶购于溆浦君健中药材专业合作社；一次性滤袋，购自江苏南京好生活包装制品厂；乙酸乙酯、2.5％碳酸氢钠、1％磷酸氢二钾、芦丁标准品、50％乙醇、5％亚硝酸纳、5％硝酸铝、没食子酸标准品、7.5％碳酸钠、 70％甲醇、正丁醇、碳酸氢钠、草酸、氯化钠、氢氧化钠、氯化氢、浓盐酸等，以上试剂均为分析纯。马铃薯琼脂培养基(在121℃的高温灭菌锅中灭菌20 min)。

实施例1微球菌的分离和筛选

(1)原材料(自然发酵茶)的处理：称取溆浦瑶茶自然发酵茶5g于100mL 无菌三角瓶中，加入50mL无菌水，震荡30min，得10^-1稀释液；再用l mL移液器，吸取10^-1稀释液l mL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，让菌液混合均匀，即成10^-2稀释液；以此类推，连续稀释，制成10^-3、10^-4、10^-5等一系列稀释菌液。

(2)分离、培养自然发酵茶中的微球菌：将培养基平板编号，然后将上述稀释菌液按10^-3、10^-4、10^-5进行稀释涂平板。每块平板涂0.2mL稀释菌液，每个浓度涂5个平板，对号接种在不同稀释度编号的马铃薯琼脂培养基，再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂布均匀，室温静置5～10min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，放入28℃培养箱中2天，观察记录各平板上菌落的生长情况，选择平板上出现的微球菌，并进行纯化，得到纯净的微球菌菌落。

(3)筛选菌株：分离后的各菌株按溆浦瑶茶后发酵过程进行制备，最后检测溆浦瑶茶后发酵样品中总黄酮的含量进行筛选。

a.测量OD(optical density)值：从冰箱中取出保存的微球菌，分别在无菌生理盐水中活化，然后接种后到相应液体培养基中，在振荡培养箱中培养，每隔两个小时测量一次OD₆₀₀值，绘制生长曲线，找出每个菌种达到最高OD 值时对应的培养时长。

b.接种：在液体培养基中培养微球菌，在培养时间达到最高OD值的时取出，离心，倒掉上清，取出沉淀，加水按料液比1:1接入溆浦瑶茶毛茶。

c.发酵：装罐封口后放置于30℃环境中发酵。发酵时间为16天，每隔 4天进行一次取样保存，并测量其水分含量，添加无菌水调节水分在45％左右。

d.烘干：取出的样品置于65℃干燥箱中干燥至恒重。

以上步骤各参数用同一株菌株在不同发酵温度(25～50℃)，不同湿度 (30％，35％，40％，45％，50％)，按每100g溆浦瑶茶毛茶接种20ml、 40ml、60ml、80ml或100ml菌液的菌体量作正交实验筛选而得。

(4)通过以上方法成功的筛选出一株微球菌，命名为QB08。

该菌株特性：

a.菌落特征：圆形菌落，淡黄色，表面润滑，有光泽，边缘平滑，整齐，菌落直径较小，中间凸起，无皱褶。

b.革兰氏染色阳性，粒状，圆形。

c.生理生化鉴定结果如表1所示：

表1微球菌生理生化试验结果

d.16S rDNA分子生物学鉴定：将该菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司通过PCR测序和序列比对技术对微球菌QB08的16SrDNA进行分析，该菌株鉴定为微球菌属(Micrococcus)，分组生物学鉴定表如表2所示，测序结果如SEQ ID NO：1所示。

表2分子生物学鉴定表

微球菌QB08在牛肉膏液体培养基生长OD值如表3所示，生长OD曲线如图1所示。

表3微球菌QB08在牛肉膏液体培养基生长OD值

由表2和图1可知，微球菌QB08在一定浓度的液体培养基中生长能达到最高OD值且生长不受抑制是在培养后的13h，第13h后微球菌生长放缓，故选择13h为接种培养的最佳时长。

将以上挑选的菌株命名QB08，并于2018年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉大学，邮政编码：430072)，保藏编号为CCTCC No:M2018489，分类命名为微球菌Micrococcus SP.。

实施例2检测方法

1)茶水分测定

采用GB/T 8304-2013《茶水分测定》中的105℃±2℃恒重法(第一法)。

2)茶黄素、茶红素含量的测定，溶剂萃取法

试剂的制备：乙酸乙酯：为除去其中游离酸和其它水溶物质，使用前用等量蒸馏水洗涤2-3次；2.5％碳酸氢钠：2.5g碳酸氢钠溶于100mL 水中，现配现用；饱和草酸溶液：20℃时100mL水中能溶解10.2g草酸固体。

样品处理：准确称取3.00g茶叶，于250mL锥形瓶中，加沸水125mL，在沸水浴中提取10min，期间用玻璃棒搅拌2～3次，浸提完毕，趁热抽滤，冷却至室温待用。

吸取上述供试液6mL于100mL分液漏斗中，加入乙酸乙酯10mL， 1％磷酸氢二钾6mL，振摇1min，静置待分层后，将乙酸乙酯层(上层) 置于100mL具塞三角瓶，加入5mL乙酸乙酯，将瓶塞塞好做好标记备用。

吸取乙酸乙酯萃取稀释液10mL，于25mL容量瓶中，加入甲醇定容得E1液。

分别吸取供试液1mL和1mL10％的草酸溶液和8mL的水，于25mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度得E2液。

用1cm比色皿，以甲醇作空白参比，在380nm波长处分别测定E1 液、E2液的吸光度A，记为A1、A2。

结果计算：

茶黄素(％)＝2.25×A1

茶红素(％)＝7.06×(4A2-A1)

3)总黄酮含量的测定，硝酸铝比色法

a.(芦丁标准溶液)溶液的配制：精确称取芦丁纯品0.01g用50％的乙醇溶解，摇匀，稀释至0.1g/L的芦丁准液。

b.样品的处理：准确称取1.000g干燥研碎的茶叶于锥形瓶中，加入70 mL50％乙醇，在80℃，水浴5h，抽滤，茶汤转移至100mL的容量瓶中，50％乙醇定容，摇匀，得供试品溶液。

c.标准曲线的制备：取上述芦丁标准液0.00，0.25，0.5，1.0，2.0，3.0， 4.0，5.0mL，分别置于10mL的比色皿中，用50％的乙醇稀释至5.00mL，各加入5％亚硝酸纳0.3mL，摇匀，静置6min，加入5％硝酸铝0.3mL，摇匀，静置6min，加入4％氢氧化钠4mL，用50％的乙醇定容，摇匀，静置12min，于540nm处比色，芦丁标准溶液浓度及其OD₅₄₀数据见表 4，以吸光值作纵坐标，芦丁浓度作横坐标绘制标准曲线，并计算标准曲线方程，采用Excel 2013得芦丁标准曲线方程为y＝0.1111x+0.1238，R²＝0.9993。

表4芦丁540nm处吸光值

d.测定：取将上述处理的供试品溶液5.00mL，测定方法同标准曲线的制备，于540nm处比色，得吸光值。

e.计算：将吸光值代入标准曲线方程，得出各样液中黄酮类化合物含量。

4)茶多酚含量的测定，参照GB/T8313-2008茶多酚含量测定方法

a.标准曲线制备：准确称取没食子酸标准品0.100g溶解于1000mL容量瓶中，制成浓度为100μg/mL的标准储备液。分别精密吸取标准储备液0 mL，0.4mL，0.8mL，1.2mL，1.6mL，2.0mL，2.4mL于25mL刻度试管中，在每个试管内分别加入5mL福林酚试剂，摇匀，反应3min～8 min，加入4mL 7.5％碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀。静置60min 后用10cm比色皿在765nm波长条件下用分光光度计测定吸光度，以吸光度(y)作纵坐标，没食子酸浓度(x)作横坐标绘制标准曲线，得出回归方程。

b.样品处理：称取0.2g均匀磨碎的试样于10ml离心管中，加入在70℃中预热过的70％甲醇溶液5ml，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，立即移入 70℃水浴中，浸提10min(每5min搅拌一次)，浸提后冷却至室温，转入离心机在3500rpm转速条件下离心10min，将上清液转移至10ml 容量瓶。残渣再用5ml 70％的甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并以上提取液并用甲醇定容至10ml，摇匀，得到母液。

c.测定：吸取三份0.1ml的母液至25ml刻度试管中，用蒸馏水做空白对照，处理和测定方法同标准曲线。

d.计算：将吸光值代入标准曲线方程，得出样液中茶多酚含量。

实施例3

微球菌发酵溆浦瑶茶：

1.溆浦瑶茶称重100g，调节水分至40～50％，装入密封罐；

2.把菌种QB08接到液体培养基中，37℃振荡培养24～48h后，将0.4ml菌液再次转接到60ml新的液体培养基中，同样条件下培养13小时，每毫升菌液中含有的菌落总数10⁶-10⁷cfu/ml，3000rpm离心15min后取沉淀，加无菌水按微球菌:无菌水以料液比1：1接入溆浦瑶茶中。

3.接种后的溆浦瑶茶用纱布封口，进行发酵，直至发酵完毕，烘干。

微球菌发酵8天茶(W)：上述步骤中，发酵天数为8天。

微球菌发酵16天茶(Q)：上述步骤中，发酵天数为16天。

袋泡茶成品组(P)：取微球菌发酵16天茶样品，包装为净重1.0g的袋泡茶，并用热封机封口。

自然发酵组(Z)：上述步骤中，不加入菌种QB08，以等量无菌水替换，发酵16天。

原料茶(Y)：未发酵前的原料茶。

黑曲霉发酵16天茶(H)：上述步骤中，加入黑曲霉菌株发酵，发酵16天。

将以上样品进行功能性成分测定，测定结果如表4所示。

表4多种茶中功能性成分测定结果

实施例4溆浦瑶茶后发酵茶安全性评价

黄曲霉毒素B1是目前已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1 对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。大肠埃希氏菌通常被称为大肠杆菌，在水和食品中检出，可以认为是被粪便污染的指标。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。经黄曲霉毒素快速检测卡检测，实施例3中所有的后发酵茶黄曲霉毒素含量均小于0.5ppb，呈阴性；经乳糖发酵试验、分离培养和证实试验三步法试验，所有的后发酵茶没有检测出大肠杆菌。

实施例5

(1)制备溆浦瑶茶后发酵袋泡茶

用粉碎机将实施例3中干燥后微球菌发酵16天的溆浦瑶茶后发酵茶粉碎备用，将粉碎好的茶粉分别过40目，60目，80目，100目筛，分成40目，40～60 目，60～80目，80～100目，100目5个等级。

再配制成净重为0.6、0.8、1.0、1.2g的袋泡茶，并用热封机封口。图2为袋泡茶成品图。

取袋泡茶4包，在以水温80℃，用水量150mL，分别冲1、3、5、7min, 分别对袋泡茶的粒度、净重、冲泡时间进行筛选并进行正交试验，水平表如表5 所示。图3为袋泡茶及茶汤俯视图；图4为茶汤俯视图。

表5袋泡茶正交试验因素水平表

(2)感官评价标准

在学院随机挑选50名学生和10人具有食品感官分析专业知识的为评判员对正交实验的袋泡茶进行感官评价，根据评分标准打分，一组完毕后用温水漱口，再品尝下一杯。其中主要因素为粒度(G)、净重(W)、冲泡时间(T)。筛选出口味适应的袋泡茶。溆浦瑶茶后发酵袋泡茶质量评定如表6所示，评分结果如表7所示，所有分值按平均分四舍五入计算。

表6溆浦瑶茶后发酵袋泡茶质量评定评分表

表7溆浦瑶茶后发酵袋泡茶质量评定评分结果表

充分说明，溆浦瑶茶后发酵袋泡茶以为粒度60目、净重1.0g为宜。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种微球菌及其在制备溆浦瑶茶后发酵茶中的应用和方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1358

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcccagct tgctgggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtga gtaacctgcc 60

cttaactctg ggataagcct gggaaactgg gtctaatacc ggataggagc gcctaccgca 120

tggtgggtgt tggaaagatt tatcggtttt ggatggactc gcggcctatc agcttgttgg 180

tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggtg accggccaca 240

ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 300

gggcgcaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 360

ctttcagtag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcaccg gctaactacg 420

tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag 480

agctcgtagg cggtttgtcg cgtctgtcgt gaaagtccgg ggcttaaccc cggatctgcg 540

gtgggtacgg gcagactaga gtgcagtagg ggagactgga attcctggtg tagcggtgga 600

atgcgcagat atcaggagga acaccgatgg cgaaggcagg tctctgggct gtaactgacg 660

ctgaggagcg aaagcatggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa 720

acgttgggca ctaggtgtgg ggaccattcc acggtttccg cgccgcagct aacgcattaa 780

gtgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 840

cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg 900

acatgttctc gatcgccgta gagatacggt ttcccctttg gggcgggttc acaggtggtg 960

catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1020

ctcgttccat gttgccagca cgtagtggtg gggactcatg ggagactgcc ggggtcaact 1080

cggaggaagg tgaggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgtcttggg cttcacgcat 1140

gctacaatgg ccggtacaat gggttgcgat actgtgaggt ggagctaatc ccaaaaagcc 1200

ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga agtcggagtc gctagtaatc 1260

gcagatcagc aacgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcaagt 1320

cacgaaagtc ggtaacactc cgaagccggt ggcctaac 1358

Claims (10)

1.一株微球菌（Micrococcus SP.）QB08，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2018489。

2.权利要求1所述的微球菌QB08在制备后发酵茶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述后发酵茶为溆浦瑶茶后发酵茶。

4.权利要求2所述后发酵茶的制备方法，其特征在于，包括将所述微球菌QB08接种于茶叶中进行发酵的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述茶叶为溆浦瑶茶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述微球菌QB08接种比例为每100g溆浦瑶茶接种微球菌6×10⁷-6×10⁸cfu/ml。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤包括将溆浦瑶茶调节水分至40~45%，再接种微球菌QB08，静止发酵16天以上，最后烘干。

8.权利要求4 ~7任一项所述制备方法制备的溆浦瑶茶后发酵茶。

9.由权利要求8所述的溆浦瑶茶后发酵茶制备的袋装茶。

10.根据权利要求9所述的袋装茶，其特征在于，所述袋装茶中茶叶粒度为60-80目，净含量为1.0-1.2克。

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