CN103772435A - 洛铂的一种水溶性、稳定衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了洛铂的一种水溶性、稳定衍生物－欣珞铂，化学名为：cis-[trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷?3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸根合铂()]。它的制备是在水中以K₂[PtCl₄]为起始原料，加入KI，转化成K₂PtI₄后，与trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷反应，制备出相应的二碘中间体，再与3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸等摩尔定量反应，得到目标化合物。本发明的化合物欣珞铂具有水溶性好、稳定、抗癌作用高的特点，可以制成冻干粉剂或水溶液剂型可用于临床治疗癌症。

Description

洛 铂的一种水溶性、稳定衍生物

技术领域

本发明涉及一种稳定的水溶性洛铂衍生物－cis-[trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷•3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸合铂(

)]（英文名: cis-[trans-1.2-bis (methylamine)cyclobutane3-hydroxy-1,1-cyclobutanedicarboxylatoplatinum (

)]） 及作为抗癌药的用途，属于化学制药领域。

背景技术

铂类药物系一类非常重要的抗癌药物，是治疗常见恶性肿瘤的首选药物 [韩锐, 孙燕主编. 新世纪癌的化学预防与药物治疗. 人民军医出版社，2005，北京]，广泛用于临床治疗癌症，据最新统计，目前50%的临床联合化疗方案是以铂类药物为主或参与配伍 [Dhar S & Lippard S J. Mitaplatin, a potent fusion of cisplatin and the orphan drug dichloroacetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009, 106, 22199-22204]。世界范围内已批准上市的铂类药物有顺铂（Cisplatin）、卡铂（Carboplatin）、奈达铂（Nedaplatin）、奥沙利铂 (Oxaliplatin)、庚铂（Heptaplatin）和洛铂（Lobaplatin）[Galanski M. Recent developments in the field of anticancer platinum complexes. Recent Patents on Anti-cancer Drug Discovery, 2006, 1, 285-295; Nial J W, Shonagh W, Gemma E C, Rabbab O. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans, 2010, 39, 8113-8127]。其中，洛铂由德国ASTA公司开发，属于第三代铂类药物，于2001年是批准上市，也是近15年来最后批准上市的一个铂类药物，主要用于乳腺癌、小细胞肺癌及慢性粒细胞白血病的化疗。洛铂的化学名cis-[trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷•L-乳酸合铂(

)]，结构如下所示：

，

洛铂的化学结构式。

洛铂是以trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷为载体、L-乳酸为离去基团的铂(

)配合物，独特结构的载体基团赋予洛铂对耐受顺铂的一些癌细胞仍有效。美国专利USP5,023,335 5,747,534公开了大量以trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷为载体的铂(

)抗癌配合物，离去基团包括氯离子、草酸、丙二酸及其衍生物、1,1-环丁烷二羧酸，a-羟基酸等，但得到的化合物大都溶解度低或不够稳定，不具有成药性。只有以L-乳酸为离去基团的洛铂具有较高的溶解度。然而，L-乳酸为a-羟基酸，羟基上的氧与铂(

)的配位能力较弱，很容易从铂()解离，因此，洛铂的化学稳定性较差，它的水溶液只有4小时的稳定期限，临床配制成注射液后要求4小时内应用，在生理盐水中稳定时间为1.5-4小时 [注射用洛铂说明书；方成玲 金描真 林晓泉 叶伟文 廖允生. 洛铂在不同温度生理盐水中的稳定性.中国新药杂质，2012,21(19), 2321- 2325]，临床使用的不方便，且使用不当还将影响疗效。因此，研制稳定的水溶性洛铂衍生物具有重要的意义。

发明内容

本研究组经过研究和试验，合成了一系列以3-X-1,1-环丁二羧酸为离去基团的洛铂衍生物, 发现当X=OH 时得到的洛铂衍生物（简称：欣珞铂）具有很好的水溶性和稳定性，且抗癌活性较高。洛铂衍生物的化学结构式如下：

X=F, Cl, OH, OCOCH₃, OCOCH₂CH₃, OCOCH₂CH₂CH_{3 。}

因此，作为本发明的化合物欣珞铂，属于洛铂的衍生物，中文化学名为：cis-[trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷•3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸根合铂(

)]，英文名: cis-[trans-1.2-bis(methylamine)cyclobutane3-hydroxy-1,1-cyclobu -tanedicarboxylatoplatinum(

)]，依合成工艺不同，也可带有1个结晶水， 具有如下化学结构：

n=0或1，

上述为欣珞铂的化学结构式

欣珞铂的制备路线见下所示：

上述表示以K₂[PtCl₄]为起始原料，加入KI，转化成K₂PtI₄后，与trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷反应，制备出相应的二碘中间体（1），再与3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸银（2）等摩尔定量反应，反应完全后过滤分离AgI，母液冷冻干燥得到粗品，粗品经水:甲醇=1:1的体系中重结晶后得到纯品，产率71%。

本发明的化合物欣珞铂具有水溶性好、稳定、抗癌作用高的特点，可以制成冻干粉剂或水溶液剂型可用于临床治疗癌症。

本发明的化合物欣珞铂具有良好的水溶性，采用常规的方法测得室温下的水溶解度约15mg/ml, 与卡铂相当，满足临床用药的要求。欣珞铂的水溶液稳定性采用核磁共振谱的方法 [W Liu, Q Ye, J Jiang, L Lou, Y Xu, C Xie.Cis-[Pt()(1R,2R-DACH)(3-acetoxy-1,1-cyclobutanedicerboxylato)]: a

water-soluble, oxalate-free and stable analogue of oxaliplatin: synthesis, characterization and biological valuations] 测定：取4mg欣珞铂样品，溶于0.5ml D₂O中，室温放置，不同时间点采用Bruker AM-500测定¹H NMR，比较各个时间点测得的¹H NMR与起始的¹H NMR，结果表明：72小时内¹H NMR无明显变化，说明欣珞铂水溶性具有很好的稳定性，稳定时间至少72小时，明显高于洛铂。

本发明欣珞铂体外对人非小细胞肺癌细胞NCI-H460、 人乳腺癌细胞DU4475、人白血病癌细胞Sup-B15的增殖有明显的抑制作用，IC₅₀ 均小于10μM， 活性与洛铂处于同一数量级。同时，本发明化合物对人非小细胞肺癌NCI-H460裸小鼠移植瘤的生长有明显的抑制作用，呈量效关系。当剂量为30mg/kg时, 抑制率31%；当剂量为60mg/kg时, 抑制率54%；整体疗效与洛铂相当，显示出良好的临床应用前景。

具体实施方式

（ 1 ）二碘中间体（1）的制备

欣珞铂的载体胺 反式-1,2-双（氨甲基）环丁烷按文献报道[8]的方法合成。然后，取5 g (12 mmol) K₂PtCl₄, 溶于80 ml的水中，取12 g (6×12 mmol) KI，溶于20 ml的水中，两溶液在35-40℃下避光混合，2小时后，在搅拌下滴加反式-1,2-双（氨甲基）环丁烷溶液20 ml（含1.37 g、12 mmol），析出棕黄色的沉淀，继续搅拌4小时，过滤收集，分别用水和乙醇洗涤，在45℃下真空干燥，得到6.28 g cis-[反式-1,2-双（氨甲基）环丁烷•二碘合铂(

)]（1），产率93%。

（ 2 ） 3- 羟基 -1 ， 1- 环丁烷二羧酸银（ 2 ）的制备

离去基团3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸则按文献[9]的方法制得后，取3 g（19 mmol）样品，溶于50ml的水，在室温下加入等当量的KHCO₃（3.8 g，38 mmol ）中和，然后滴加过量10%的AgNO₃溶液（20 ml，7.1g），得到白色沉淀，过滤收集，分别用水和乙醇洗涤，在45℃下真空干燥，得到对应的3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸银（2）6.8 g， 产率96%。

（ 3 ）本发明的化合物欣珞铂的合成

准确称取6.00 g （10.66 mmol）的cis-[反式-1,2-双（氨甲基）环丁烷•二碘合铂(

)]于100 ml的水中，加入3.95 g（10.58 mmol）3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸银，在40-45℃下搅拌反应48小时后，用KI溶液检查反应物中无游离的银离子存在，示意反应完毕。过滤除去所生成的AgI沉淀，母液冷冻干燥，得到近白色的产物，在1:1的甲醇水溶液中重结晶提纯后，在45℃下真空干燥6小时，获得含1个结晶水的cis-[反式-1,2-双（氨甲基）环丁烷• 3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸合铂(

)] 白色结晶3.7 g, 产率71%。

再在105-120℃真空干燥8小时，失去1个结晶水，得到cis-[反式-1,2-双（氨甲基）环丁烷• 3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸合铂(

)] 白色结晶3.5 g。

（ 4 ）本发明的化合物欣珞铂的结构解析

采用元素分析仪测定目标化合物中的C、N、H的含量，铂的含量则用热重法测定，精确分子量采用高分辨质谱测定。同时，采用质谱、红外光谱、核磁共振谱表征化学结构。

上述为欣珞铂的化学结构式（标有碳的序号）。

1）元素分析

测定值：C 30.5%，H 4.30%，N 5.98%，Pt 41.4%；计算值：C 30.8%，H 4.28%，N 5.99%，Pt 41.5%。符合C₁₂H₂₀N₂O₅Pt的量式

2）分子量

测定值： 467.1017；计算值： 467.1020。符合 C₁₂H₂₀N₂O₅Pt 分子式。

3）谱图解析

ESI⁺-MS (m/e, RI):

985(2M+Na⁺，30%)，490(M+Na⁺, 90%)，468 (M+H⁺ , 25%)。

IR (KBr, cm^-1):

3426(m, v_O-H), 3235, 3139 (m, v_N-H), 2941, 2875 (m, v_C-H), 1623 (vs, v_{as (COO)}), 1376 (vs, v_{a( COO)}), 485 (w, v_Pt-N), 449(s, v_Pt-O)

¹H NMR (dmso, ppm):

δ 1.60, 1.88 (m, ≈4H, 2CH ₂ from C-3 and C-4), 2.24-2.37 (m, ≈6H, 2C H from C-1 and C-2 + 2C H ₂ from C-2’ and C-4’), 2.65, 2.98, 3.08 (m, ≈4H, 2C H ₂NH₂) 3.82 (m, ≈1H, CH from C-3’), 4.26 (m, ≈1H, O H ), 5.01, 5.07, 5.26 (m, ≈4H, 2N H ₂)

¹³C NMR (dmso, ppm):

δ 22.3, 22.4 (C-3+C-4), 41.2(C-1, C-2), 41.9, 42.3(C-2’+C-4’), 48.2 (C-1’), 50.4 (C-3’), 60.2, 61.5 (2CH₂NH₂), 176. 6, 176.8 (2COO^-)

所有测定数据符合欣珞铂的化学结构式。

（ 5 ）欣珞铂的体外抗癌活性

用不含血清的培养液将测试的化合物和对照药品洛铂配成所需浓度，应用SRB法（磺酰罗丹明B蛋白染色法）检测目标化合物对人非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、 人乳腺癌细胞株DU4475、人白血病癌细胞株Sup-B15的增殖生长的抑制作用。

SRB法: 接种对数生长期细胞于96孔培养板， 加入不同浓度的药物，每个浓度设3个复孔，同时设相应浓度的溶媒对照。癌细胞在37℃、5% CO₂条件下培养72小时。细胞用SRB室温中染色, 最后加入Tris 溶液溶解，酶标仪（BioTek）510nm波长下测定OD值，以下列公式计算细胞生长抑制率，根据各浓度抑制率，根据非线性回归方法计算半数抑制浓度IC₅₀。抑制率=（OD值 _对照孔 －OD值 _给药孔 ）/ OD值 _对照孔 ×100%

表 1. 欣珞铂对癌细胞生长的半数抑制浓度 IC₅₀ （ t=72h)

如表1结果所示，欣珞铂体外对人非小细胞肺癌细胞NCI-H460、 人乳腺癌细胞DU4475、人白血病癌细胞Sup-B15的增殖有明显的抑制作用，IC₅₀ 均小于10μM， 活性与洛铂几乎处于同一数量级。

（ 6 ）体内抗癌作用测定

购取BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，♀，在SPF级环境下饲养。裸小鼠皮下接种人肺癌NCI-H460细胞，待肿瘤生长至80-160 mm³后，将动物随机分组(D0)。测试的化合物和对照药品洛铂均用5%葡萄糖溶液配制，腹腔注射给药，给药剂量和给药方案见表2。每周测2－3次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积（V）计算公式为：

V＝1/2×a×b² 其中 a、b分别表示长、宽。

T/C(%)=(T-T₀)/(C-C₀)´100 其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；

T₀、C₀为实验开始时的肿瘤体积。

测定结果见表2. 欣珞铂(30、60 mg/kg, IP, Q4D´3)剂量依赖性地抑制人肺癌NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为31%和54%；参比药物洛铂的剂量选择7.5mg/kg, 为动物试验常用的有效剂量，对NCI-H460的抑瘤率分别为43%；从给药后小鼠体重变化来看，欣珞铂和洛铂对小鼠的生长影响不太，小鼠均能很好耐受，示意毒性较小。综合抑瘤率和体重变化来看，欣珞铂和洛铂的体内对非小细胞肺癌的疗效相当。

表 2. 欣珞铂对人肺癌 NCI-H460 裸 小鼠皮下移植瘤的治疗效果

*P<0.05, **P<0.01。

Claims (2)

1.一种洛铂衍生物，其特征在于：化学式为cis-[trans-1,2-双(氨甲基)环丁烷•3-羟基-1,1-环丁烷二羧酸合铂(

)]，英文名为cis-[trans-1.2-bis(methylamine)cyclobutane•3-hydroxyl-1,1-cyclo-butanedicarboxylatoplatinum(

)]，无结晶水或含有1个结晶水，化学结构式为：

n=0或1。

2.权利要求的洛铂衍生物在制备抗癌症药物中的应用。