CN111718373A - 具有式（i）结构的铂类化合物、制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式(I)的铂类化合物及其制备方法和应用，通过反式‑二氨甲基环丁烷草酸盐制备得到该铂类化合物，该产品对多种癌症具有治疗活性。本发明还提供了结构式(I)的铂类化合物的检测方法，所述方法为HPLC法；其中所述的HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以8‑12mol/L的醋酸铵溶液为流动相A，甲醇：乙腈＝1:(0.8‑1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为234‑236nm，流速为每分钟0.5‑1.5ml，柱温为38‑42℃。该检测方法的灵敏度高，专属性强，重复性好，准确度高，能够用于洛铂质量的控制检测。

Description

具有式(I)结构的铂类化合物、制备及其应用
技术领域
本发明涉及药物领域，特别涉及一种具有式(I)结构的铂类化合物及其制备方法和在药物中的应用，属于药物化学技术领域。
背景技术
洛铂(Lobaplatin，D19466)，又名洛巴铂，是继顺铂、卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药物，其化学名称为：顺式-[反式-1,2-环丁烷双(甲胺)-N,N']-[(2S)-乳酸-O1,O2]-铂(II)，分子式为C9H18N2O3Pt，分子量为397.34，化学结构式如下式(a)所示：
Figure BDA0001999832190000011
洛铂具烷化作用,属烷化剂(广义)。具有良好的抗肿瘤作用，如对离体AH135-瘤、B16-黑色素瘤、结肠癌115，在体小鼠P338白血病等具有很好的抑制作用。洛铂的特点是抗癌活性强，毒性低，无蓄积毒性和肾毒性，并且对骨髓毒性较小，目前已上市的注射用洛铂主要用于乳腺癌、小细胞肺癌及慢性粒细胞性白血病的治疗。
发明内容
为了保证该药物的安全、有效、质量可控，对其有关物质及有关物质的检测方法的研究显得十分重要。针对该药物，由于三个手性碳的存在以及制备过程产生的有关物质，因此确认有关物质结构以及寻找到合适的检测方法用于控制该药物的产品质量成为本领域急需解决的技术问题。
本发明为了解决技术问题，重要的是具有式(I)的铂类化合物的制备，并建立针对该化合物在洛铂中作为有关物质的检测方法以及该化合物的抗肿瘤的应用。
本领域技术人员知道，任何影响药物纯度的物质统称为有关物质。有关物质的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定有关物质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定有关物质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。
具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。
一种铂类化合物，其结构如下式(I)所示：
Figure BDA0001999832190000021
一种上述铂类化合物的制备方法，其中，所述铂类化合物通过下述(式1化合物)制备得到：
Figure BDA0001999832190000022
优选所述化合物1通过下面的反应过程制备得到：
Figure BDA0001999832190000023
其中，优选制备化合物1的反应温度为25-35℃。
其中优选地，所述铂类化合物通过化合物2制备得到：
Figure BDA0001999832190000024
优选的是，通过化合物1制备化合物2的反应中，温度为25-35℃(更优选反应时间为15-20小时)；更优选地，温度为30℃，反应时间为18小时。
对于所述的制备方法，优选地，其中，通过化合物1制备所述化合物2中，化合物1和硝酸银的摩尔比例为：1:1-2；优选为1:1.79。
对于所述的制备方法，优选地，其中，通过化合物2制备所述式(I)所示的铂类化合物的反应中，温度为25-35℃，反应时间为1-5小时；优选地，温度为30℃，反应时间为3小时；
或者该反应中，化合物2和草酸钾一水合物的摩尔比例为1:1-3。
优选地，具体来说，其中，所述制备方法的步骤如下：
Figure BDA0001999832190000031
其中，通过化合物1制备化合物2的反应中，温度为25-35℃，优选反应时间为15-20小时；优选地，温度为30℃，更优选反应时间为18小时；通过化合物2制备所述式(I)所示的铂类化合物的反应中，温度为25-35℃，优选反应时间为1-5小时；优选地，温度为30℃，更优选反应时间为3小时。
本发明还提供一种所述化合物的检测方法，所述方法为HPLC法或HPLC-MS法。
优选地，所述化合物的检测方法，其中，所述的HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以8-12mol/L的醋酸铵溶液为流动相A，体积比例计，甲醇：乙腈＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；更优选按照如下的顺序进行梯度洗脱：
0～3分钟：97％流动相A：3％流动相B；
3～10分钟：流动相A从97％减少到92％，流动相B从3％增加到8％；
10～18分钟：流动相A从92％减少到87％，流动相B从8％增加到13％；
18～25分钟：流动相A从87％减少到10％，流动相B从13％增加到90％；
25～26分钟：流动相A从10％增加到97％，流动相B从90％降低到3％；
26～34分钟：97％流动相A：3％流动相B。
优选的，检测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃，优选为39-41℃；优选地，所述作为流动相A的醋酸铵的浓度为9-11mmol，优选为10mmol/L，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈＝1:1，所述柱温为40℃，所述检测波长为235nm。
本发明还提供一种所述铂类化合物(在本专利中有时简称为化合物I)在洛铂原料药或者制剂的质量标准中作为有关物质指标进行控制的用途。
本发明还提供一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述的有关物质为所述的化合物，其特征在于所述的测定方法采用HPLC法检测或HPLC-MS法；
优选地，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以浓度为8-12mmol/L的醋酸铵溶液为流动相A，体积比例计，甲醇：乙腈＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；更优选按照如下的顺序进行梯度洗脱：
0～3分钟：97％流动相A：3％流动相B；
3～10分钟：流动相A从97％减少到92％，流动相B从3％增加到8％；
10～18分钟：流动相A从92％减少到87％，流动相B从8％增加到13％；
18～25分钟：流动相A从87％减少到10％，流动相B从13％增加到90％；
25～26分钟：流动相A从10％增加到97％，流动相B从90％降低到3％；
26～34分钟：97％流动相A：3％流动相B；
其中，上述梯度洗脱的每段时间范围可以均增加1～2分钟或者可以从3～10分钟起的梯度洗脱时间范围可以均减少1～2分钟；
例如，梯度洗脱对应的时间范围可以为0～4分钟(或0～5分钟)、4～11分钟(或5～12分钟)、11～19分钟(或12～20分钟)、19～26分钟(20～27分钟)、26～27分钟(或27～28分钟)、27～35分钟(或28～36分钟)；也可以设为0～3分钟、3～9分钟(或3～8分钟)、9～17分钟(或8～16分钟)、17～24分钟(16～23分钟)、24～25分钟(或23～24分钟)、25～33分钟(或24～32分钟)。
优选的，检测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃，优选为39-41℃；优选地，所述作为流动相A的醋酸铵的浓度为9-11mmol，优选为10mmol/L，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈＝1:1，所述柱温为40℃，所述检测波长为235nm。
优选地，对于所述的洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其中，所述的有关物质检测中，供试品溶液的色谱图中如果有有关物质峰，有关物质按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，有关物质的峰面积不得超过对照溶液中主成分的峰面积，所述校正因子为0.8-0.9，优选为0.88。
优选地，对于所述的洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其中，供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位：化合物I的相对保留时间为1.10-1.20。
本发明还提供一种含有所述化合物的药物组合物，所述药物组合物为药物制剂，优选所述组合物为注射用药物制剂。
优选地，对于所述药物组合物，其中所述药物制剂包括辅料，优选的是，所述辅料选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂和基质中的一种或两种以上；进一步优选的是，所述辅料选自填充剂和抗氧化剂中的一种或两种以上。
本发明还提供所述化合物或所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，其中，所述肿瘤为肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、血液肿瘤、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和/或肾癌细胞。
为使本发明所述组合物中的制剂能够实现，可以在制备这些制剂时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；抗氧化剂包括：亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、叔丁基对羟基茴香醚、硫脲、维生素C、没食子酸丙酯、α-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。因此在本发明化合物的基础上加入任何其他的有助于形成稳定地发挥药效的其他物质的都是本发明的保护范围。
本发明的有益效果如下：
本发明成功制备出具有结构式(I)的铂类化合物，其具有一定抗癌活性，丰富了铂类化合物治疗癌症的技术方案，并且，建立了具有结构式(I)的铂类化合物作为洛铂质量标准中的有关物质进行检测的方法，该方法灵敏度高，专属性强，重复性好，准确度高。
附图说明
图1A-1：本发明化合物I的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为215nm)；
图1A-2：本发明化合物I的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为210nm)；
图1B：本发明化合物I的HPLC-MS联用结构确认检测中MS图谱；
图2A：本发明化合物I的1H-NMR图谱；
图2B：本发明化合物I的13C-NMR图谱；
图3:化合物I的结构确认中的HPLC色谱图；
图4：本发明化合物I的UV图谱；
图5：本发明化合物I的IR图谱；
图6：本发明化合物I的DSC图谱；
图7：本发明化合物I作为洛铂相关物质的HPLC图谱；
图8A-1：化合物I对NCI-H460的剂量响应曲线图；
图8A-2：STSP对NCI-H460的剂量响应曲线图；
图8B-1：化合物I对95-D的剂量响应曲线图；
图8B-2：STSP对95-D的剂量响应曲线图；
图8C-1：化合物I对AGS的剂量响应曲线图；
图8C-2：STSP对AGS的剂量响应曲线图；
图8D-1：化合物I对OVCAR-3的剂量响应曲线图；
图8D-2：STSP对OVCAR-3的剂量响应曲线图；
图8E-1：化合物I对HL-60的剂量响应曲线图；
图8E-2：STSP对HL-60的剂量响应曲线图；
图8F-1：化合物I对THP-1的剂量响应曲线图；
图8F-2：STSP对THP-1的剂量响应曲线图；
图8G-1：化合物I对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；
图8G-2：STSP对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；
图8H-1：化合物I对DU 145的剂量响应曲线图；
图8H-2：STSP对DU 145的剂量响应曲线图；
图8I-1：化合物I对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；
图8I-2：STSP对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；
图9：有关物质化合物I的线性图；
图10：波长为235nm的洛铂自身对照的线性关系示意图；
具体实施方式
本发明提供一种洛铂中的有关物质及其检测方法，以及其抗肿瘤的应用。
在本发明中，任何影响药物纯度的物质统称为“影响洛铂质量的有关物质”或者“影响质量的有关物质”，简称“有关物质”，例如在检测洛铂质量的XRD衍射峰中出现的影响洛铂质量的有关物质峰，简称为“有关物质峰”；本发明中的所述“有关物质”有些情况下即是本领域技术人员公知的影响药物纯度的“杂质”，然而，在本发明中所述”有关物质”不限于“杂质”的范畴，还包括具有一定抗癌活性甚至其活性高于洛铂的物质，他们相对于活性分子“洛铂”而言属于与洛铂有关的物质范畴，其抗癌活性或者其他的研发新药物方面积极的作用和功能的原理尚未完全研究清楚。本发明中“有关物质”的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定有关物质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定有关物质的合理限度，这一研究贯穿于药品研发的整个过程。
在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述的有关物质为式(I)所示的化合物(本申请中也称为化合物I或者物质I)，其特征在于所述的测定方法采用HPLC法检测；
优选地，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以浓度为8-12mmol/L的醋酸铵溶液为流动相A，体积比例计，甲醇：乙腈＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；更优选按照如下的顺序进行梯度洗脱：
0～3分钟：97％流动相A：3％流动相B；
3～10分钟：流动相A从97％减少到92％，流动相B从3％增加到8％；
10～18分钟：流动相A从92％减少到87％，流动相B从8％增加到13％；
18～25分钟：流动相A从87％减少到10％，流动相B从13％增加到90％；
25～26分钟：流动相A从10％增加到97％，流动相B从90％降低到3％；
26～34分钟：97％流动相A：3％流动相B；
优选的，检测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃，优选为39-41℃；优选地，所述作为流动相A的醋酸铵的浓度为9-11mmol，优选为10mmol/L，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈＝1:1，所述柱温为40℃，所述检测波长为235nm。
优选地，对于所述的洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其中，所述的有关物质检测中，供试品溶液的色谱图中如果有有关物质峰，有关物质按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，有关物质的峰面积不得超过对照溶液中主成分的峰面积，所述校正因子为0.8-0.9，优选为0.88。
优选地，对于所述的洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其中，供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位：化合物I的相对保留时间为1.10-1.20。
其中，所述化合物I的相对保留时间是指相对于洛铂的保留时间，具体是相对于洛铂非对映体II的保留时间。具体来说，作为洛铂化合物已知有2种异构体，即洛铂非对映体I和洛铂非对映体II，它们的结构式如下所述：
洛铂非对映体I(简称RRS)：
Figure BDA0001999832190000091
洛铂非对映体II(简称SSS)：
Figure BDA0001999832190000092
以下实施例制备中的化合物1的商购来源为：
实施例中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别，其中，
化合物1A(反式-二氨甲基环丁烷草酸盐)根据专利号为CN102093226B
实施例1所述的方法制备得到，并经结构鉴定确认得到；
氯亚铂酸钾购自上海久岳化工有限公司；
碘化钾购自广州化学试剂厂，为分析纯。
实施例1化合物I的制备
制备化合物I的方法具体过程为，先按照专利号为CN102093226B实施例1所述的方法制备，并经结构鉴定确认得到下面化合物1A(反式-二氨甲基环丁烷草酸盐)，然后以该草酸盐为原料按照下面的反应式(A)制备得到式1所示的二碘化物；再由该式1所示的二碘化物通过下面的反应式(B)得到式(I)所示的化合物(也称化合物I)。
Figure BDA0001999832190000101
具体来说，制备化合物1的过程(后面的实施例5和6中所述的二碘化合物1也是通过下述过程制备)为：
ⅰ.将化合物1A(30.0g,101.9mmol),氯亚铂酸钾(36.0g,86.7mmol),碘化钾(86.0g,518.1mmol)和氢氧化钾(24.0g,427.7mmol)分别溶于170mL,180mL,87mL和120mL纯化水,得A,B,C,D液。
ⅱ.将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。
ⅲ.将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。
ⅳ.将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。
ⅴ.将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在30℃下搅拌2小时。
ⅵ.过滤,滤饼用纯化水洗涤(100mL×6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物1(35g)为黄色粉末。
下面，以化合物1为起始原料通过反应式(B)制备化合物I的具体过程说明如下：
1)制备化合物2
将化合物1(5.0g,8.88mmol)分散至纯化水(21mL)和丙酮(3mL)中，得A料。将硝酸银(2.7g,15.9mmol)溶于纯化水(8mL),加至A料,30℃避光搅拌18小时。过滤,滤饼用5mL水洗涤6次(5mL*6),合并滤液得2的溶液60mL直接用于下一步。
2)制备得到目标化合物I产品
将草酸钾一水合物(2.12g,11.51mmol)溶于纯化水(6.00mL),加至步骤1)获得的2的溶液(60mL)中。30℃,避光搅拌3小时。过滤,滤饼用丙酮15mL洗涤2次(15mL*2)。干燥得产品(1.3g)类白色固体。取样检测采用如下方法：HPLC,13CNMR,LCMS,1HNMR。
对制备获得产物进行结构确认：
1)HPLC-MS:
所用的HPLC-MS仪器名称和型号为：Agilent 1200LC&Agilent 6110MSD。
所用的HPLC-MS条件为：
其中，HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AgilentZORBAX SB-Aq,2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表1程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm、215nm、220nm和254nm(DAD检测器)，柱温为50℃。
MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1500。
表1
Figure BDA0001999832190000111
Figure BDA0001999832190000121
检测结果见附图1A-1、图1A-2和图1B，可以看出，该有关物质-含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有194Pt,195Pt,196Pt,因此在样品的MS中，在398.0、399.0、400.1处出现[M’+H]+峰是样品准分子离子峰和795.0处出现样品二聚合作用后的准分子离子峰，对应于产品的分子量为397.29，质谱信息与本发明化合物分子结构(分子式：C8H14N2O4Pt；分子量:397.29)相符。
2)1H-NMR:
仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪
氢谱(1H NMR:DMSO_400MHz)的化学位移及归属如下表2：
表2
Figure BDA0001999832190000122
谱图见附图2A，可以看出，样品氢谱数据与产品的分子结构相吻合。
3)13C-NMR:
仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪
碳谱(13C NMR:DMSO_400MHz)的化学位移及归属如下表3：
表3
化学位移(ppm) 碳原子类型 碳原子数 碳的归属
22.72 仲碳 2 1,1’
39.35-40.60 仲碳 2 2,2’
50.85 叔碳 2 3,3’
166.66 季碳 2 5,6
谱图见附图2B，可以看出，13C-NMR共振光谱图中有4个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、2个不饱和季碳峰这与所示化合物I的产品(简称产品)的分子结构相符。
4)HPLC
HPLC的操作条件为：仪器型号为：SHIMADZU LC-20AB；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECT CSH C18，4.6*150mm，3.5μm)，以水(+0.0375质量％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875质量％三氟乙酸)为流动相B，按下表表3A程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(PDA检测器)，柱温为40℃。
表3A
Figure BDA0001999832190000131
谱图如附图3所示。
从图中可以看出，在保留时间为10.427min处出现了式I化合物的峰。
5)紫外吸收光谱(UV):
紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:DMF；检测图谱见附图4；其中，1处最大吸收波长为220.5nm，2处的最大吸收波长为196.5nm，3处的最大吸收波长为205.5nm。
6)红外光谱(IR)
红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围：4000cm-1～400cm-1，测定结果及解析如下表4：
表4
Figure BDA0001999832190000141
图谱见附图5。
7)差示扫描量热法(DSC)
仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃图谱见附图6。
通过上述图谱确认了本发明的化合物结构为
Figure BDA0001999832190000142
实施例2：检测方法
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定
色谱条件与系统适用性试验色谱仪器型号：Agilent 1260,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect HSS T3，4.6*150mm，3.5μm)，以10mmol/L醋酸铵为流动相A，体积比例计，甲醇：乙腈＝1:1(体积比例)为流动相B，按下表5程序进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，柱温为40℃，检测波长为235nm，检测有关物质(本发明化合物I)。
表5
时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0 97 3
3 97 3
10 92 8
18 87 13
25 10 90
26 97 3
34 97 3
系统适用性试验溶液的色谱图中，各已知有关物质峰与相邻有关物质峰分离度应不小于1.5；系统适用性试验溶液连续进样6次，主峰面积的相对标准偏差应不大于3.0％。
供试品溶液的制备
取洛铂待测样品(根据专利CN 102020679 B说明书中实施例2公开的方法制备、并且经过结构鉴定确认得到的的洛铂样品，其中洛铂下面实验中所提到的洛铂含量以无水物计)约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
系统适用性试验溶液/0.1％对照溶液的制备
精密量取供试品溶液100μl，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取对照贮备液1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为0.1％对照溶液。
测定法
取系统适用性试验溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至25分钟。供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位。具体来说，有关物质的典型图谱见附图7。由图7可以看出，在保留时间t＝15.598处出现了洛铂非对映体I的峰，在保留时间t＝15.93处出现了洛铂非对映体II的峰，在t＝18.276出现了有关物质即本发明化合物I的峰；有关物质(本发明化合物I)的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为1.15，有关物质按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物I的峰面积不得超过对照溶液中主成分的峰面积；校正因子为0.88。
实施例3：体外抗肿瘤活性测定
一、试剂及耗材
1.细胞株
所采用的每种细胞株的具体名称如下表6所示。
表6
种属 细胞名称
肺癌细胞 <u>NCI-H460</u>
肺癌细胞 <u>95-D</u>
胃癌细胞 <u>AGS</u>
卵巢癌细胞 <u>OVCAR-3</u>
白血病细胞 <u>Jurkat Clone E6-1</u>
白血病细胞 <u>HL-60</u>
白血病细胞 <u>THP-1</u>
前列腺癌细胞 <u>DU 145</u>
前列腺癌细胞 <u>22RV1</u>
肾癌细胞 <u>SK-NEP-1</u>
2.DMEM培养基，中国Procell，货号：PM150210
3.MEM培养基，中国Procell，货号：PM150411
4.McCoy’s 5A培养基，中国Procell，货号：PM150710
5.Ham's F-12培养基，中国Procell，货号：PM150810
6.CellTiter-
Figure BDA0001999832190000161
Luminescent Cell Viability Assay，美国Promega，货号：G7572
7. 96孔细胞培养板，美国Corning，货号：3610
8.Envision，美国PerkinElmer
9.FBS，Lonsera，货号：S711-001S
10.丙酮酸钠，中国Procell，货号：PB180422
11.Insulin，中国上海源培，货号：S454
12.β-mercaptoethanol，Gibco，货号：21985
13.DMSO，美国Sigma，货号：D8418
14.Penicillin&Streptomycin(P/S)，中国Procell，货号：PB180120
15. 0.25％胰酶-EDTA，中国Procell，货号：PB180228
二、溶液与缓冲液
1.细胞生长培养基
配置完毕后，储存在4℃备用，具体每种细胞株的培养基如下表7所示。
表7
细胞名称 培养基
<u>NCI-H460</u> RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
<u>95-D</u> RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
<u>AGS</u> F-12+10％FBS+1％P/S
<u>OVCAR-3</u> RPMI-1640+20％FBS+0.01mg/ml Insulin+1％P/S
<u>Jurkat Clone E6-1</u> RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
<u>THP-1</u> RPMI-1640+10％FBS+0.05mMβ-mercaptoethanol+1％P/S
<u>DU 145</u> MEM+10％FBS+1％P/S
<u>SK-NEP-1</u> McCoy’s5A+15％FBS+1％P/S
注：以上表格中的％都是体积比。
2.Heat-inactivated FBS热灭活血清
将血清于56摄氏度水浴30分钟即可。
3.化合物处理：
将实施例1制备的化合物I 3.19g溶解于DMSO中配制浓度为1mM的溶液在-20℃下保存待用。阳性对照为星形孢菌素(Staurosporine)简称STSP，是一种天然产物分离最初于1977年由细菌霉菌Staurosporeus.本实验为商购品，购自MedChemExpress(MCE)、产品名称staurosporine、货号HY-15141。
二、实验方法：
复苏细胞
将需要复苏的细胞从液氮罐内迅速取出，在37℃水浴锅中融化，迅速加入预热的培养基中。1000转/分钟，离心5分钟后将离心管取出，弃去上清液，向离心管内加入新鲜预热的培养基，重悬细胞，然后将细胞悬液加入培养皿中，37℃，5体积％CO2培养。
细胞传代
细胞传代：贴壁细胞，当细胞长满培养皿80～90％，用0.25％胰酶(由0.25g胰酶加入100mlpbs溶液配制而成)消化细胞，然后用新的培养基将细胞重悬，将细胞按适当比例传代，约2～3d传代1次。悬浮细胞，收集细胞悬液，800rpm，离心5分钟，去除上清，用新鲜培养基重悬，按照适当比例传代，约2～3d传代1次。
细胞接种及药物处理
化合物工作液浓度的配制
化合物单一浓度测试
根据检测要求，实验当天，将化合物使用DMSO稀释至1mM母液，再用培养基进一步稀释到50uM(5X最终浓度)工作液，最终化合物浓度化合物如下所示，化合物的测试浓度为10微摩尔，化合物的孵育时间为72小时。
化合物IC50测试
根据检测要求，实验当天，将化合物使用DMSO稀释至1mM母液作为最高浓度，并进行2倍，3倍或5倍梯度稀释，再用培养基将每一个浓度点进一步稀释到5X最终浓度的工作液。
细胞接种及药物处理
检测前1天，根据细胞生长速度将细胞按不同密度接种于96孔细胞板中，每孔接种80μL细胞悬液，37℃，5体积％CO2培养箱，孵育过夜。细胞的具体铺板密度如下表8所示：
表8
细胞名称 密度(cell/well)
NCI-H460 4000
95-D 3000
AGS 4000
OVCAR-3 5000
Jurkat Clone E6-1 10000
HL-60 8000
THP-1 15000
DU145 5000
SK-NEP-1 3000
1.根据实验要求，每孔加入20μL化合物工作液，37℃，5体积％CO2培养箱，孵育72小时。
2.结束孵育后，按照CTG试剂盒(购自promega、货号是G7572、名称是celltiter-glo)操作要求进行检测，得到相应化学发光值，计算细胞活性。
3.计算
细胞活率＝加药组RLU值/对照组(溶剂)RLU值×100％
实验结果：
吸光度原始数据及细胞存活率(％Cell Viability)
测定的剂量-效应曲线见附图8A-1到图8I-2，图中所述化合物I(Cmpd9)为本发明化合物，图8A-1到图8I-2是指化合物I或对照品对细胞的效应曲线图，其中横坐标为浓度，单位为微摩尔，纵坐标为细胞存活率。
化合物的IC50值如下表9所示：
表9
细胞名称 化合物IC<sub>50</sub> 对照(STSP)
NCI-H460 1.08μM 40.35nM/40.41nM
95-D 1.8μM 56.48/50.42/69.34nM
AGS 1.63μM 6.02/5.72/5.84nM
OVCAR-3 611.5nM 27.19/47.29/40.25nM
Jurkat Clone E6-1 1.26μM 14.67/11.63/12.12/12.84nM
HL-60 3.56μM 17.1/17.42/17.06nM
THP-1 1.82μM 73.02/74.45/42.58nM
DU145 7.28μM 93.13/93.32nM
SK-NEP-1 1.39μM 12.09/12.38/11.81/10.72nM
通过上述活性数据可以看出，本发明化合物对人卵巢癌细胞株OVCAR-3的活性达到了nm级别，对其他的肿瘤细胞也就有一定的抑制活性。对大细胞肺癌细胞NCI-H460的IC50值最低。
单一浓度10μM的化合物的抑制活性如下表10所示：
表10
细胞名称 化合物的细胞存活率(％) 对照的细胞存活率(％)
NCI-H460 39.99 1.54
95-D 31.61 2.51
AGS 34.66 3.11
OVCAR-3 45.97 5.15
Jurkat Clone E6-1 8.39 0.93
HL-60 9.39 2.03
THP-1 3.37 1.30
DU145 46.31 14.27
SK-NEP-1 10.38 3.07
通过上述数据可以看出，本发明化合物在10μM的浓度下对上述癌细胞具有较好的抑制活性，特别是针对Jurkat Clone E6-1、HL-60和THP-1的抑制率达到90％以上，具有显著的抑瘤活性，可以进一步开发为抗癌药物应用于临床。
实施例4：检测方法的方法学验证
为了确认本发明检测方法的实用性和准确性，下面对前面实施例中本发明洛铂中有关物质的检测方法的专属性、线性及范围、检测限和定量限、校正因子、准确度(回收率)、精密性、溶液稳定性、耐用性等方面进行说明：
1、专属性
精密量取空白溶液(即纯化水)、分离度溶液RS-1(化合物I浓度为0.02mg/mL)各20uL，注入液相色谱仪，结果如下表11所示，分离度大于3.0，专属性良好。
表11
Figure BDA0001999832190000211
精密量取空白溶液、各条件下的强制降解溶液各20uL，注入液相色谱仪，结果如下表12所示，物料平衡在90％～110％之间，满足预期要求，专属性良好。
表12
Figure BDA0001999832190000212
其中，表12中的各溶液制备方法如下所述：
碱破坏溶液的制备方法为：称量洛铂供试品20.45mg于10mL容量瓶，加0.1mol/L氢氧化钠溶液0.5mL，放置3min，破坏后以0.1mol/L盐酸溶液0.5mL中和，稀释剂定容，作碱破坏溶液。
酸破坏溶液的制备方法为：称量洛铂供试品20.47mg于10mL容量瓶，加入0.01mol/L盐酸溶液0.5mL，放置10min，破坏后以0.5mL 0.01mol/L氢氧化钠溶液中和，稀释剂定容，作酸破坏溶液。
光照破坏溶液的制备方法为：称量在45,00lx光照强度下破坏10天的洛铂供试品20.18mg于10mL容量瓶，稀释剂溶解定容，作光照破坏溶液。
高温破坏溶液的制备方法为：称量在80℃高温条件下破坏3天的洛铂供试品20.02mg于10mL容量瓶，稀释剂溶解定容，作高温破坏溶液。氧化破坏溶液的制备方法为：称量洛铂供试品19.96mg于10mL容量瓶，加0.5mL 0.05％过氧化氢溶液，放置2min，稀释剂定容。
2、灵敏度
取有关物质I溶液和洛铂对照品溶液，逐步稀释，以信噪比(S/N)3为检测限，信噪比(S/N)10为定量限。有关物质I的检测限浓度为0.127ug/mL，定量限浓度为1.015ug/mL；洛铂对照品的检测限浓度为0.199ug/mL，定量限浓度为0.995ug/mL。检测限结果如下表13所示，定量限结果下表14所示。
表13检测限结果
Figure BDA0001999832190000221
表14定量限结果
Figure BDA0001999832190000222
3、线性
以有关物质I(即化合物I)的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.994ug/mL～3.977ug/mL范围内有关物质化合物I的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝5.362X+0.104(235nm)，相关系数R2为1.000，表明线性关系良好，详见附图9。
以洛铂对照品的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.986ug/mL～3.942ug/mL范围内洛铂对照品的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝4.699X-0.109(235nm)，相关系数R2为1.000，表明线性关系良好，详见附图10(波长为235nm)。
4、精密度
由实验员A和B分别配制系统适用性溶液，然后分别精密量取系统适用性溶液20uL，注入液相色谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如下表15所示，洛铂主峰面积的RSD＜2％，精密度良好。
表15
Figure BDA0001999832190000231
由实验员A和B分别配制样品溶液，然后分别精密量取各样品溶液20uL，注入液相色谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如下表16所示，各有关物质含量的RSD(n＝6)＜3％、RSD(n＝12)＜6％，精密度良好。
表16
Figure BDA0001999832190000232
Figure BDA0001999832190000241
5、准确度
向供试品溶液中加入有关物质I溶液，平行配制3份50％限度浓度、3份限度浓度和3份150％限度浓度的回收率溶液，考察各有关物质的准确度。结果表明，50％限度浓度下，有关物质I的回收率在100％～110％之间；100％限度浓度下，有关物质I的回收率在95％～100％之间；150％限度浓度下，有关物质I的回收率在95％～100％之间，由此证明该方法的准确度良好。
6、溶液稳定性
分别量取供试品溶液，于0h、2h、3.5h、12h、14h进样，考察各有关物质峰面积变化。结果如下表17所示，待测溶液中I在14h内S％在95％～108％之间为稳定。
表17
Figure BDA0001999832190000242
备注：S＝(每个时间间隔溶液中各有关物质的峰面积/0h时溶液中各有关物质的峰面积)×100％
7、耐用性
取系统适用性溶液，适当调整液相色谱系统中的参数，考察系统条件变化后的各有关物质含量检测情况，结果如下表18所示，系统条件微小变动后，各有关物质U％在90％～108％之间，表明该法的耐用性良好。
表18
Figure BDA0001999832190000251
备注：U＝(改变条件后溶液中各有关物质的含量/改变条件前溶液中各有关物质的含量)×100％
实施例5化合物I的制备实施例
1)制备化合物2
将化合物1(5.0g,8.88mmol)分散至纯化水(21mL)和丙酮(3mL)
中，得A料。将硝酸银(2.7g,15.9mmol)溶于纯化水(8mL),加至A料,25℃避光搅拌20小时。过滤,滤饼用水洗涤6次(5mL*6),合并滤液得2的溶液60mL直接用于下一步。
2)制备得到产品
将草酸钾一水合物(2.12g,11.51mmol)溶于纯化水(6.00mL),加至步骤1)获得的2的溶液(60mL)中。25℃,避光搅拌5小时。过滤,滤饼用丙酮(15mL*2)。干燥得产品(1.19g)类白色固体。取样检测HPLC,13CNMR,LCMS,1HNMR。
对制备获得产物进行结构确认为本发明的化合物。
实施例6化合物I的制备实施例
1)制备化合物2
将化合物1(5.0g,8.88mmol)分散至纯化水(21mL)和丙酮(3mL)中，得A料。将硝酸银(2.7g,15.9mmol)溶于纯化水(8mL),加至A料,35℃避光搅拌15小时。过滤,滤饼用水洗涤6次(5mL*6),合并滤液得2的溶液60mL直接用于下一步。
2)制备得到产品
将草酸钾一水合物(2.12g,11.51mmol)溶于纯化水(6.00mL),加至步骤1)获得的2的溶液(60mL)中。35℃,避光搅拌1小时。过滤,滤饼用丙酮(15mL*2)。干燥得产品(1.23g)类白色固体。取样检测HPLC,13CNMR,LCMS,1HNMR。
对制备获得产物进行结构确认为本发明的化合物。

Claims (16)

1.一种铂类化合物，其结构如下式(I)所示：
Figure FDA0001999832180000011
2.一种制备权利要求1的铂类化合物的制备方法，其中所述铂类化合物通过
Figure FDA0001999832180000012
制备得到；
优选所述化合物1通过下面的反应过程制备得到：
Figure FDA0001999832180000013
其中，优选制备化合物1的反应温度为25-35℃。
3.根据权利要求2所述的制备方法，所述铂类化合物通过化合物2：
Figure FDA0001999832180000014
制备得到；
优选的是，通过化合物1制备所述化合物2，其中，温度为25-35℃，(优选反应时间为15-20小时)；更优选地，温度为30℃，反应时间为18小时。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，通过化合物1制备所述化合物2中，化合物1和硝酸银的摩尔比例为：1:1-2；优选为1:1.79。
5.根据权利要求4所述制备方法，其中，通过化合物2制备所述式(I)所示的铂类化合物的反应中，温度为25-35℃，反应时间为1-5小时；优选地，温度为30℃，反应时间为3小时；
或者该反应中，化合物2和草酸钾一水合物的摩尔比例为1:1-3。
6.根据权利要求2-5任一项所述制备方法，所述制备方法的步骤如下：
Figure FDA0001999832180000021
其中，通过化合物1制备化合物2的反应中，温度为25-35℃，优选反应时间为15-20小时；优选地，温度为30℃，更优选反应时间为18小时；通过化合物2制备所述式(I)所示的铂类化合物的反应中，温度为25-35℃，优选反应时间为1-5小时；优选地，温度为30℃，更优选反应时间为3小时。
7.一种权利要求1所述化合物的检测方法，其特征在于，所述方法为HPLC法或HPLC-MS法。
8.如权利要求7所述的检测方法，所述的HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以8-12mol/L的醋酸铵溶液为流动相A，体积比例计，甲醇：乙腈＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；更优选按照如下的顺序进行梯度洗脱：
0～3分钟：97％流动相A：3％流动相B；
3～10分钟：流动相A从97％减少到92％，流动相B从3％增加到8％；
10～18分钟：流动相A从92％减少到87％，流动相B从8％增加到13％；
18～25分钟：流动相A从87％减少到10％，流动相B从13％增加到90％；
25～26分钟：流动相A从10％增加到97％，流动相B从90％降低到3％；
26～34分钟：97％流动相A：3％流动相B；
其中，上述梯度洗脱的每段时间的范围可以均增加1-2分钟或者可以从3～10分钟起的梯度洗脱时间范围可以均减少1-2分钟；
优选的，检测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃，优选为39-41℃；优选地，所述作为流动相A的醋酸铵的浓度为9-11mmol，优选为10mmol/L，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈＝1:1，所述柱温为40℃，所述检测波长为235nm。
9.权利要求1所述化合物在洛铂原料药或者制剂的质量标准中作为有关物质指标进行控制的用途。
10.一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述的有关物质为权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的测定方法采用HPLC法检测或HPLC-MS法；
优选地，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以浓度为8-12mmol/L的醋酸铵溶液为流动相A，体积比例计甲醇：乙腈＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；更优选按照如下的顺序进行梯度洗脱：
0～3分钟：97％流动相A：3％流动相B；
3～10分钟：流动相A从97％减少到92％，流动相B从3％增加到8％；
10～18分钟：流动相A从92％减少到87％，流动相B从8％增加到13％；
18～25分钟：流动相A从87％减少到10％，流动相B从13％增加到90％；
25～26分钟：流动相A从10％增加到97％，流动相B从90％降低到3％；
26～34分钟：97％流动相A：3％流动相B；
其中，上述梯度洗脱的每段时间的范围可以均增加1-2分钟或者可以从3～10分钟起的梯度洗脱时间范围可以均减少1-2分钟；
优选的，检测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃，优选为39-41℃；优选地，所述作为流动相A的醋酸铵的浓度为9-11mmol，优选为10mmol/L，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈＝1:1，所述柱温为40℃，所述检测波长为235nm。
11.根据权利要求10所述的洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其中，所述的有关物质检测中，供试品溶液的色谱图中如果有有关物质峰，有关物质按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，有关物质的峰面积不得超过对照溶液中主成分的峰面积，所述校正因子为为0.8-0.9，优选为0.88。
12.根据权利要求10或11所述的洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其中，供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位：化合物I的相对保留时间为1.10-1.20。
13.一种含有权利要求1所述化合物的药物组合物，所述药物组合物为药物制剂，优选所述组合物为注射用药物制剂。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述药物制剂包括辅料，优选的是，所述辅料选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂和基质中的一种或两种以上；进一步优选的是，所述辅料选自填充剂和抗氧化剂中的一种或两种以上。
15.如权利要求1所述化合物或权利要求13或14所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
16.如权利要求15所述应用，其中所述肿瘤为肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、血液肿瘤优选白血病、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和/或肾癌细胞；更优选所述肿瘤为卵巢癌细胞，进一步优选为OVCAR-3细胞引起的卵巢癌。
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