CN111718378B - 具有式(k)结构的铂类化合物、制备及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了式(K)的铂类化合物、制备方法及其检测方法。本发明提供了一种铂类化合物，其结构如下式(K)所示：

Description

具有式(K)结构的铂类化合物、制备及其检测方法
技术领域
本发明涉及药物领域，特别涉及一种具有式(K)结构的铂类化合物、制备方法及其检测方法，属于药物化学技术领域。
背景技术
洛铂(Lobaplatin，D19466)，又名洛巴铂，是继顺铂、卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药物，其化学名称为：顺式-[反式-1,2-环丁烷双(甲胺)-N,N']-[(2S)-乳酸-O1,O2]-铂(II)，分子式为C9H18N2O3Pt，分子量为397.34，化学结构式如下式(a)所示：
洛铂具烷化作用，属烷化剂(广义)，具有良好的抗肿瘤作用，如对离体AH135-瘤、B16-黑色素瘤、结肠癌115，对小鼠P338白血病等具有很好的抑制作用。洛铂的特点是抗癌活性强，毒性低，无蓄积毒性和肾毒性，并且对骨髓毒性较小，目前已上市的注射用洛铂主要用于乳腺癌、小细胞肺癌及慢性粒细胞性白血病的治疗。
发明内容
为了保证该药物的安全、有效、质量可控，对其有关物质及有关物质的检测方法的研究显得十分重要。针对该药物，由于三个手性碳的存在以及制备过程产生的有关物质，因此确认有关物质的结构以及寻找到合适的检测方法用于控制该药物的产品质量成为本领域急需解决的技术问题。
本发明要解决的技术问题是提供具有式(K)结构的铂类化合物及其制备方法，并建立针对该化合物在洛铂中作为有关物质的检测方法。
本领域技术人员知道，任何影响药物纯度的物质统称为有关物质。有关物质的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定有关物质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定有关物质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。
具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。
本发明提供一种铂类化合物，其结构如下式(K)所示：
本发明提供了一种上述铂类化合物的制备方法，其中制备式(K)化合物的原料为化合物(1)
优选的，对于上述所述的制备方法，所述制备方法的步骤如下：
其中，通过化合物1与双氧水反应得到化合物2；优选的，所述化合物1与双氧水的摩尔比为1:10-20，优选为1:15.5；优选的，反应温度为25-35℃，反应时间为1-10小时；优选地，温度为30℃，反应时间为5小时。
本发明提供了上述所述铂类化合物的检测方法，所述检测方法为HPLC法或HPLC-MS法；优选地，所述的HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以8-12mmol/L的醋酸铵溶液为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；更优选按照如下的顺序进行梯度洗脱：
0～3分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；
3～10分钟：流动相A从97体积％减少到92体积％，流动相B从3体积％增加到8体积％；
10～18分钟：流动相A从92体积％减少到87体积％，流动相B从8体积％增加到13体积％；
18～25分钟：流动相A从87体积％减少到10体积％，流动相B从13体积％增加到90体积％；
25～26分钟：流动相A从10体积％增加到97体积％，流动相B从90体积％减少到3体积％；
26～34分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；
其中，上述梯度洗脱的每段时间的范围可以均增加1-2分钟或者可以从3～10分钟起的梯度洗脱时间范围可以均减少1-2分钟；
例如，梯度洗脱对应的时间范围可以为0～4分钟(或0～5分钟)、4～11分钟(或5～12分钟)、11～19分钟(或12～20分钟)、19～26分钟(或20～27分钟)、26～27分钟(或27～28分钟)、27～35分钟(或28～36分钟)；也可以设为0～3分钟、3～9分钟(或3～8分钟)、9～17分钟(或8～16分钟)、17～24分钟(或16～23分钟)、24～25分钟(或23～24分钟)、25～33分钟(或24～32分钟)；
优选的，检测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃，优选为39-41℃；优选地，所述作为流动相A的醋酸铵的浓度为9-11mmol，优选为10mmol/L，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈的体积比例＝1:1，所述柱温为40℃。
本发明提供了一种上述所述的铂类化合物在洛铂原料药或者制剂的质量标准中作为有关物质指标进行控制的用途。
本发明提供了一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述的有关物质为上述所述的化合物，其中所述的检测方法采用HPLC法或者HPLC-MS法检测；
优选地，所述HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以浓度为8-12mmol/L的醋酸铵溶液为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；更优选按照如下的顺序进行梯度洗脱：
0～3分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；
3～10分钟：流动相A从97体积％减少到92体积％，流动相B从3体积％增加到8体积％；
10～18分钟：流动相A从92体积％减少到87体积％，流动相B从8体积％增加到13体积％；
18～25分钟：流动相A从87体积％减少到10体积％，流动相B从13体积％增加到90体积％；
25～26分钟：流动相A从10体积％增加到97体积％，流动相B从90体积％减少到3体积％；
26～34分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；
其中，上述梯度洗脱的每段时间的范围可以均增加1-2分钟或者可以从3～10分钟起的梯度洗脱时间范围可以均减少1-2分钟；
例如，梯度洗脱对应的时间范围可以为0～4分钟(或0～5分钟)、4～11分钟(或5～12分钟)、11～19分钟(或12～20分钟)、19～26分钟(或20～27分钟)、26～27分钟(或27～28分钟)、27～35分钟(或28～36分钟)；也可以设为0～3分钟、3～9分钟(或3～8分钟)、9～17分钟(或8～16分钟)、17～24分钟(或16～23分钟)、24～25分钟(或23～24分钟)、25～33分钟(或24～32分钟)；
测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃，优选为39-41℃，优选地，所述作为流动相A的醋酸铵的浓度为9-11mmol，优选为10mmol/L，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈的体积比例＝1:1，所述柱温为40℃，所述检测波长为235nm；
优选的，对于上述所述的检测方法，其中，在所述的有关物质检测中，按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物K的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积；优选的，所述校正因子为0.4-0.5，优选为0.45。
优选的，对于上述所述的检测方法，其中，供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位，供试品溶液中化合物K的相对保留时间为0.20-0.25，优选为0.23。
本发明的有益效果如下：
本发明合成了具有式(K)结构的铂类化合物，对所得到的式(K)化合物进行了结构确认，并建立了具有结构式(K)的铂类化合物作为洛铂质量标准中的有关物质进行检测的方法，该方法灵敏度高，重复性好，准确度高。
附图说明
图1为实施例一中的反应混合物的HPLC谱图；
图2-1A为实施例一式K化合物在HPLC-MS结构确认中的HPC图谱(215nm)；
图2-1B为实施例一式K化合物在HPLC-MS结构确认中的HPLC图谱(210nm)；
图2-2为实施例一的式K化合物在HPLC-MS结构确认中的MS图谱；
图3为实施例一的式K化合物的1H NMR图谱；
图4为实施例一的式K化合物的13C-NMR图谱；
图5为实施例一的式K化合物的Q NMR图谱；
图6为实施例一的式K化合物的HPLC图谱；
图7为实施例一的式K化合物的UV图谱；
图8为实施例一的式K化合物的IR图谱；
图9为实施例一的式K化合物的DSC曲线图；
图10为实施例一的式K化合物作为洛铂中有关物质K的典型图谱；
图11是方法学验证中洛铂自身对照品的线性关系示意图；
图12是方法学验证中洛铂中有关物质K的线性关系示意图。
具体实施方式
本发明提供一种具有式(K)结构的铂类化合物、制备方法以及检测方法。
在本发明中，任何影响药物纯度的物质统称为“影响洛铂质量的有关物质”或者“影响质量的有关物质”，简称“有关物质”，例如在检测洛铂质量的HPLC色谱峰中出现的影响洛铂质量的有关物质峰，简称为“有关物质峰”；本发明中的所述“有关物质”有些情况下即是本领域技术人员公知的影响药物纯度的“杂质”，然而，在本发明中所述”有关物质”不限于“杂质”的范畴，还包括具有一定抗癌活性甚至其活性高于洛铂的物质，他们相对于活性分子“洛铂”而言属于与洛铂相关的物质范畴，其抗癌活性或者其他的研发新药物方面积极的作用和功能的原理尚未完全研究清楚。
本发明提供了一种铂类化合物，其结构如下式(K)所示：
本发明提供了一种制备上述所述的铂类化合物的制备方法，其中，制备式(K)化合物的原料为化合物(1)
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述制备方法的步骤如下：
其中，化合物1与双氧水反应得到化合物2；优选的，所述化合物1与双氧水的摩尔比为1:10-20，优选为1:15.5；优选的，反应温度为25-35℃，反应时间为1-10小时；优选地，温度为30℃，反应时间为5小时。
优选的，在化合物1与双氧水反应之后，加入亚硫酸钠与未反应的双氧水反应以除去未反应的双氧水；然后再加入甲醇，将产物溶解以除去杂质。
在本发明优选的一种具体实施方式中，本发明提供了一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述的有关物质为上述所述的化合物，其中所述的检测方法采用HPLC法或者HPLC-MS法检测；优选地，所述HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以浓度为8-12mmol/L的醋酸铵溶液为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；更优选按照如下的顺序进行梯度洗脱：
0～3分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；
3～10分钟：流动相A从97体积％减少到92体积％，流动相B从体积3％增加到8体积％；
10～18分钟：流动相A从92体积％减少到87体积％，流动相B从8体积％增加到13体积％；
18～25分钟：流动相A从87体积％减少到10体积％，流动相B从13体积％增加到90体积％；
25～26分钟：流动相A从10体积％增加到97体积％，流动相B从90体积％减少到3体积％；
26～34分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；
其中，上述梯度洗脱的每段时间范围可以均增加1～2分钟或者可以从3～10分钟起的梯度洗脱时间范围可以均减少1～2分钟；
检测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃，优选为39-41℃，优选地，所述作为流动相A的醋酸铵的浓度为9-11mmol，优选为10mmol/L，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈的体积比例＝1:1，所述柱温为40℃，所述检测波长为235nm；
优选的，对于上述所述的检测方法，其中，在所述的有关物质检测中，按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物K的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积；优选的，所述校正因子为0.4-0.5，优选为0.45。
优选的，对于上述所述的检测方法，其中，供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位，供试品溶液中化合物K的相对保留时间为0.20-0.25，优选为0.23。
所述化合物K的相对保留时间是指相对于洛铂的保留时间，具体是相对于洛铂非对映体II的保留时间。具体来说，作为洛铂化合物已知有2种异构体，即洛铂非对映体I和洛铂非对映体II，它们的结构式如下所述：
洛铂非对映体I(简称RRS)：
洛铂非对映体II(简称SSS)：
以下实施例中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别，其中，化合物1是根据专利CN 102020679 B说明书中实施例2公开的方法制备，并经结构鉴定确认得到。
实施例1-1化合物的制备
具体制备方法如下：
将化合物1(5.0g,11.1mmol)溶于水(160ml)，加入双氧水(19.57g，172.60mmol)，30℃搅拌5小时；取反应液HPLC检测到所要产物的保留时间位置(Rt＝0.576)，谱图见附图1；其中，所使用的仪器型号为：SHIMADZU LC-20AB，(色谱柱:Waters XBridge C18(2.1*50mm*5um)；流动相A:水(+0.025(V/V)％NH3·H2O)，B：ACN]；柱温：40℃；按下表梯度洗脱
表1梯度洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％) 流速(ml/min)
0.00 100 0 0.8
4.20 70 30 0.8
5.30 70 30 0.8
5.31 100 0 0.8
6.00 100 0 0.8
然后加入30质量％亚硫酸钠水溶液(76ml)，搅拌12小时，将反应液浓缩至干；接着加入300ml甲醇，搅拌一小时，过滤，将滤液浓缩至干得黄色固体；
黄色固体用prep.HPLC(使用的仪器型号：SHIMADZU LC-20AP，色谱柱:PhenomenexSynergi Max-RP(250*50mm*10um)；流动相A:水(10m mol/LNH4HCO3)，B：ACN]；0-16min梯度洗脱，流动相B的体积由0增大到95％)纯化得化合物2(1.9g,收率35.0％)为白色固体。
取样检测LCMS，1H NRM,13C NMR，Q NMR。
对制备获得产物进行结构确认
1)HPLC-MS:
所使用的仪器型号为：Agilent 1200LC&Agilent 6110MSD
所用的HPLC-MS条件为：
HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq,2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm和215nm(DAD检测器)，柱温为50℃。
表2梯度洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％) 流速(ml/min)
0.00 10 90 1.2
1.50 10 90 1.2
MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。
其测定结果如下表所示：
表3测定结果
m/e 碎片离子峰 备注
396 [M’-2H2O+H]+ 样品失去两分子水的准分子离子峰
863.4 [2M’+H]+ 两倍样品加氢后的准分子离子峰
其中，M’为式(K)化合物(C9H20N2O5Pt)的分子量。
检测结果见附图2-1A，2-1B及2-2，可以看出，该化合物为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有194Pt，195Pt，196Pt，因此在样品的MS中，在396处出现[M’-2H2O+H]+是样品失去两分子水的准分子离子峰及在863.4处出现[2M’+H]+峰是两倍样品加氢后的准分子离子峰，质谱信息与式(K)化合物(C9H20N2O5Pt)的分子结构相符。
2)1H-NMR:
仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪
其中，氢谱(1H NMR D2O 400MHz)的化学位移及归属如下：
表4氢谱测定结果
化学位移(ppm) 多重性 质子数 氢的归属
1.30-1.32 m 3 6
1.53-1.58 m 2 1,1’
1.82-1.86 m 2 1,1’
2.20-2.24 m 2 2,2’
2.67-2.88 m 4 3,3’
4.50-4.54 m 1 5
谱图见附图3，可以看出，式K的化合物分子中含有6个活泼氢和14个不活泼氢，样品氢谱数据与式K的化合物的分子结构相吻合。
3)13C-NMR:
仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪
碳谱(13C NMR D2O 400MHz)的化学位移及归属如下：
表5碳谱测定结果
化学位移(ppm) 碳原子类型 碳原子数 碳的归属
21.12-21.60 伯碳 1 6
22.25-22.43 仲碳 2 1,1’
38.92-39.77 仲碳 2 3,3’
48.59-49.74 叔碳 2 2,2’
75.84-76.03 仲碳 1 5
192.05-192.28 季碳 1 7
谱图见附图4，可以看出，13C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰以及1个不饱和季碳峰，这与式K的化合物的分子结构相符。
4)Q NMR
其是采用Bruker AVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为CD3OD，采用内标法进行测定，内标物为苯甲酸苄酯(99.8％)，测定结果如下：
表6测定结果
W％的计算公式如下：
式中，WISTD为内标物的质量(mg)；
WSam为样品的质量(mg)；
ASam/AISTD为样品和内标物的面积比；
MWSAM为样品的分子量；
MWISTD为内标物的分子量；
nISTD和nSam为各官能团的质子数；
WISTD％为内标物的质量百分比，
谱图见附图5，从上表中可以看出，其标定含量为92.7％。
5)HPLC
所使用的仪器型号为：SHIMADZU LC-20AB
HPLC的操作条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECT CSHC18，4.6*150mm，3.5μm)，以水(+0.0375体积％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(PDA检测器)，柱温为40℃。
表7梯度洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％) 流速(mL/min)
0.01 100 0 1.0
5.00 82 18 1.0
10.00 80 20 1.0
20.00 10 90 1.0
20.01 100 0 1.0
28.00 100 0 1.0
谱图如附图6所示。
从图6中可以看出，在保留时间为4.809min处出现了式K化合物的峰。
6)紫外吸收光谱(UV)
紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；图谱见附图7。
从图7可以看出，实施例一所制备得到的式K的化合物在190n处有最大紫外吸收。
7)红外光谱(IR)
红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围：4000cm-1～400cm-1，测定结果及解析如下：
表8测定结果
吸收峰波数(cm-1) 振动类型 基团归属
3499.75 νNH 氨基N-H伸缩振动
2978.91 νCH 烷基C-H伸缩振动
1669.67 νC＝O 羰基C＝O伸缩振动
1329.29 δCH 烷基C-H弯曲振动
1288.59 νC-O C-O键的伸缩振动
1051.58 νC-N C-N键的伸缩振动
图谱见附图8。
8)旋光度(OR)
旋光仪：Anton Paar MCP 500；测定条件：C＝0.5mol/L(水)，25℃，结果如下：
表9旋光度测定结果
9)差示扫描量热法(DSC)
仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃
图谱见附图9。
从图9可以看出，实施例一所得到的化合物K在162.59℃就开始熔融。
通过上述图谱确认了本发明的化合物结构为分子式为C9H20N2O5Pt，分子量为431.35。
实施例1-2化合物的制备
将化合物1(5.0g,11.1mmol)溶于水(160ml)。加入双氧水(12.47g,110mmol)，25℃搅拌10小时；取反应液HPLC(其所用的仪器型号、色谱柱及其操作条件与实施例1-1相同)检测到所要产物的保留时间位置(Rt＝0.576)；然后加入30质量％亚硫酸钠水溶液(76ml)，搅拌12小时，将反应液浓缩至干；接着加入300ml甲醇，搅拌一小时；过滤，将滤液浓缩至干得黄色固体；黄色固体用prep.HPLC(其所用的仪器型号和操作条件与实施例1-1相同)纯化得化合物2(1.8g,收率33.1％)为白色固体。
对制备获得产物进行结构确认为本发明的化合物。
实施例1-3化合物的制备
将化合物1(5.0g,11.1mmol)溶于水(160ml)。加入双氧水(24.94g,220mmol),35℃搅拌1小时；取反应液HPLC(其所用的仪器型号、色谱柱及其操作条件与实施例1-1相同)检测到所要产物的保留时间位置(Rt＝0.576)；然后加入30质量％亚硫酸钠水溶液(76ml),搅拌12小时,将反应液浓缩至干；接着加入300ml甲醇，搅拌一小时，过滤，将滤液浓缩至干得黄色固体；黄色固体用prep.HPLC(其所用的仪器型号和操作条件与实施例1-1相同)纯化得化合物2(1.85g,收率34.1％)为白色固体。
对制备获得产物进行结构确认为本发明的化合物。
实施例2：检测方法(式(K)的化合物作为洛铂中有关物质K在洛铂质量控制的检测方法)
按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定
色谱条件与系统适用性试验所使用的仪器为Agilent 1260，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect HSS T3，4.6*150mm，3.5μm)，以10mmol/L醋酸铵为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:1为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，柱温为40℃，检测波长为235nm，检测洛铂中有关物质K。
表10梯度洗脱条件
时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0 97 3
3 97 3
10 92 8
18 87 13
25 10 90
26 97 3
34 97 3
系统适用性试验溶液的色谱图中，各已知有关物质峰与相邻有关物质峰分离度应不小于1.5；系统适用性试验溶液连续进样6次，主峰面积的相对标准偏差应不大于3.0％。
供试品溶液的制备
取待测洛铂样品(根据专利CN 102020679 B说明书中实施例2公开的方法制备，并且经过结构鉴定确认得到的洛铂样品，即本实施例加入洛铂三水合物作为待测洛铂，在各个实施例中涉及洛铂含量时均以洛铂无水物计)约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
系统适用性试验溶液/0.1％对照溶液的制备
精密量取供试品溶液100μl，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取对照贮备液1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为0.1％对照溶液。
测定法
取系统适用性试验溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至25分钟。
供试品溶液色谱图中如有有关物质K，以有关物质K标识的色谱图中的色谱峰进行定位，该有关物质K的典型图谱见附图10。
由图10可以看出，在保留时间t＝15.598min处出现了洛铂非对映体I的峰，在保留时间t＝15.930min处出现了洛铂非对映体II的峰，在t＝3.687min出现了有关物质即本发明化合物K的峰；有关物质K的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为0.23，有关物质K按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中有关物质K的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积，校正因子为0.45。
实施例3：检测方法的方法学验证
为了确认本发明检测方法的实用性和准确性，下面对检测方法的线性及范围、检测限和定量限、校正因子、准确度(回收率)、精密性、溶液稳定性、耐用性等方面进行说明：
1、灵敏度
取有关物质K溶液，逐步稀释，以信噪比(S/N)3为检测限，信噪比(S/N)10为定量限。检测限结果如表11所示，定量限结果如表12所示。
表11检测限结果
样品 检测限浓度(μg/mL) S/N
有关物质K 0.020 5.3
洛铂对照品 0.199 4.7
表12定量限结果
从表11和表12可以看出，有关物质K的检测限浓度为0.020μg/mL，定量限浓度为0.997μg/mL，洛铂对照品的检测限浓度为0.199μg/mL，定量限浓度为0.995μg/mL。
2、线性
以洛铂对照品的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如图11所示。
从图11可以看出，洛铂对照品在0.986μg/mL～3.942μg/mL范围内洛铂对照品的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝4.699X-0.109(235nm)，相关系数R2为1.000，表明线性关系良好。
以有关物质K的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如12所示。
从图12可以看出，在0.982μg/mL～3.927μg/mL范围内有关物质K的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性方程为Y＝10.430X-0.141，相关系数R2为1.000，表明线性关系良好。
3、精密度
3.1系统适用性精密度
由实验员A和B分别配制系统适用性溶液，然后分别精密量取系统适用性溶液20μL，注入液相色谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如表13所示。
表13系统适用性精密度结果
由表13可以看出，洛铂主峰面积的RSD＜2％，精密度良好。
3.2有关物质K的精密度
由实验员A和B分别配制样品溶液，然后分别精密量取样品溶液20μL，注入液相色谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如表14所示。
表14有关物质K精密度结果
从表14可以看出，有关物质K的质量含量的RSD(n＝6)＜3％、RSD(n＝12)＜6％，精密度良好。
4、准确度
向供试品溶液中加入有关物质K溶液，平行配制3份50％限度浓度、3份限度浓度和3份150％限度浓度的回收率溶液，考察有关物质K的准确度。
结果表明，50％限度浓度下，有关物质K的回收率在100％～105％之间；100％限度浓度下，有关物质K的回收率在100％～105％之间；150％限度浓度下，有关物质K的回收率在100％～105％之间，由此证明该方法的准确度良好。
5、溶液稳定性
分别量取供试品溶液，于0h、2h、3.5h、12h、14h进样，考察有关物质K峰面积变化。结果如表15所示。
表15溶液稳定性结果
备注：S＝(每个时间间隔溶液中有关物质K的峰面积/0h时溶液中有关物质K的峰面积)×100％
从表15可以看出，待测溶液中有关物质K在14h内S％在95％～108％之间为稳定。
6、耐用性
取系统适用性溶液，适当调整液相色谱系统中的参数，考察系统条件变化后的有关物质K含量检测情况，结果如表16所示。
表16耐用性结果
备注：U＝(改变条件后溶液中有关物质K的质量含量/改变条件前溶液中有关物质K的质量含量)×100％
从表16可以看出，改变色谱柱温度(±1℃)，缓冲盐浓度(±1mmol/L)和检测波长(±1nm)，测定结果变化范围为90％～108％，在可接受标准范围内。
实施例4：体外抗肿瘤活性测定
一、试剂及耗材
1.细胞株，来自于中科院细胞库
表17细胞株
/>
2.DMEM培养基，中国Procell，货号：PM150210
3.MEM培养基，中国Procell，货号：PM150411
4.Ham's F-12K培养基，中国Procell，货号：PM150910
5.RPMI-1640培养基，中国Procell，货号：PM150110
6.McCoy’s 5A培养基，中国Procell，货号：PM150710
7.IMDM培养基，中国Procell，货号：PM150510
8.Ham's F-12培养基，中国Procell，货号：PM150810
9.FBS，Lonsera，货号：S711-001S
10.丙酮酸钠，中国Procell，货号：PB180422
11.Insulin，中国上海源培，货号：S454
12.β-mercaptoethanol，Gibco，货号：21985
13.DMSO，美国Sigma，货号：D8418
14.Penicillin&Streptomycin(P/S)，中国Procell，货号：PB180120
15. 0.25％胰酶-EDTA，中国Procell，货号：PB180228
16.CellTiter-Luminescent Cell Viability Assay，美国Promega，货号：G7572
17. 96孔细胞培养板，美国Corning，货号：3610
18.Envision，美国PerkinElmer
二、溶液与缓冲液
1.细胞生长培养基
配置完毕后，储存在4℃备用。
表18细胞名称及其培养基
/>
2.Heat-inactivated FBS热灭活血清
将血清于56摄氏度水浴30分钟即可。
3.化合物处理：
将实施例1-1中的化合物3.25g溶解于DMSO中配制浓度为30mM的溶液在-20℃下保存待用。阳性对照为星形孢菌素(Staurosporine)简称STSP(购自MedChemExpress(MCE)，货号为HY-15141)，是一种天然产物，最初于1977年由细菌霉菌Staurosporeus分离得到。
三、实验方法：
(1)复苏细胞
将需要复苏的细胞从液氮罐内迅速取出，在37℃水浴锅中融化，迅速加入预热的培养基中。1000转/分钟，离心5分钟后将离心管取出，弃去上清液，向离心管内加入新鲜预热的培养基，重悬细胞，然后将细胞悬液加入培养皿中，37℃，5体积％CO2培养。
(2)细胞传代
细胞传代：贴壁细胞，当细胞长满培养皿80～90％，用0.25％胰酶(由0.25g胰酶加入100mlpbs溶液配制而成)消化细胞，然后用新的培养基将细胞重悬，将细胞按适当比例传代，约2～3d传代1次。悬浮细胞，收集细胞悬液，800rpm，离心5分钟，去除上清，用新鲜培养基重悬，按照适当比例传代，约2～3d传代1次。
(3)化合物工作液浓度的配制
化合物单一浓度测试
根据检测要求，实验当天，将化合物使用DMSO稀释至1mM母液，再用培养基进一步稀释到50uM(5X最终浓度)工作液，化合物的测试浓度为10微摩尔，化合物的孵育时间为72小时。
(4)细胞接种及药物处理
1.检测前1天，根据细胞生长速度将细胞按不同密度接种于96孔细胞板中，每孔接种80μL细胞悬液，37℃，5体积％CO2培养箱，孵育过夜。细胞的具体铺板密度如下表：
表19细胞铺板密度
2.根据实验要求，每孔加入20μL化合物工作液，37℃，5体积％CO2培养箱，孵育72小时。
3.结束孵育后，按照CTG试剂盒(购自promega，货号为G7572，名称为celltiter-glo)操作要求进行检测，得到相应化学发光值，计算细胞活性。
4.计算
细胞活率＝加药组RLU值/对照组(溶剂)RLU值×100％
(5)实验结果：
单一浓度10μM的化合物的抑制活性如下
表20化合物K的抑制活性
/>
从上表可以看出，式K的化合物对于一部分细胞株具有一定的抑制活性，为抗肿瘤药物的研究提供了一定的基础。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种铂类化合物的制备方法，其特征在于，所述铂类化合物结构如下式(K)所示：
；所述制备方法的步骤如下：
其中，化合物1与双氧水反应得到化合物2；所述化合物1与双氧水的摩尔比为1:15.5-20；反应温度为30-35℃，反应时间为1-5小时。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，所述化合物1与双氧水的摩尔比为1:15.5；反应温度为30℃，反应时间为5小时。
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