CN111718377A - 具有结构式h1、h2的铂类物质、制备及其应用 - Google Patents

具有结构式h1、h2的铂类物质、制备及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111718377A
CN111718377A CN201910209475.4A CN201910209475A CN111718377A CN 111718377 A CN111718377 A CN 111718377A CN 201910209475 A CN201910209475 A CN 201910209475A CN 111718377 A CN111718377 A CN 111718377A
Authority
CN
China
Prior art keywords
substance
compound
reaction
platinum
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910209475.4A
Other languages
English (en)
Inventor
窦啟玲
汪立冬
常新亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hainan Changan International Pharmaceutical Co ltd
Guizhou Yibai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hainan Changan International Pharmaceutical Co ltd
Guizhou Yibai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hainan Changan International Pharmaceutical Co ltd, Guizhou Yibai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Hainan Changan International Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN201910209475.4A priority Critical patent/CN111718377A/zh
Publication of CN111718377A publication Critical patent/CN111718377A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table compounds of the platinum group
    • C07F15/0086—Platinum compounds
    • C07F15/0093—Platinum compounds without a metal-carbon linkage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明还提供式(H1)和(H2)的铂类物质、制备方法以及作为相关物质的检测方法和抑制肿瘤中的应用。其中结构H1和H2所示的铂类物质为
Figure DDA0002000032840000011
所述物质的制备方法，经过中间体
Figure DDA0002000032840000012
和/或
Figure DDA0002000032840000013
制备得到，或者经过中间体
Figure DDA0002000032840000014
制备得到，X代表卤素元素，更具体的该中间体为

Description

具有结构式H1、H2的铂类物质、制备及其应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种具有结构式H的铂类物质、制备及其应用；尤其涉及一种具有结构式式H1、和/或H2结构的铂类物质及其制备方法和在药物中的应用，属于药物化学技术领域。
背景技术
洛铂(Lobaplatin，D19466)，又名洛巴铂，是继顺铂、卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药物，其化学名称为：顺式-[反式-1,2-环丁烷双(甲胺)-N,N']-[(2S)-乳酸-O1,O2]-铂(II)，分子式为C9H18N2O3Pt，分子量为397.34，化学结构式如下式(a)所示：
Figure BDA0002000032820000011
洛铂具烷化作用,属烷化剂(广义)。具有良好的抗肿瘤作用，如对离体AH135-瘤、B16-黑色素瘤、结肠癌115，在体小鼠P338白血病等具有很好的抑制作用。洛铂的特点是抗癌活性强，毒性低，无蓄积毒性和肾毒性，并且对骨髓毒性较小，目前已上市的注射用洛铂主要用于乳腺癌、小细胞肺癌及慢性粒细胞性白血病的治疗。
发明内容
为了保证该洛铂药物的安全、有效、质量可控，对其有关物质及有关物质的检测方法的研究显得十分重要。针对该药物，由于三个手性碳的存在以及制备过程产生的有关物质，因此确认有关物质结构以及寻找到合适的检测方法用于控制该药物的产品质量成为本领域急需解决的技术问题。
本发明为了解决上述技术问题，提供具结构式H1和H2所示的铂类物质的制备，并建立针对该物质在洛铂中作为有关物质的检测方法以及该物质的抗肿瘤的应用。
本领域技术人员知道，任何影响药物纯度的物质统称为有关物质。有关物质的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定有关物质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定有关物质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。
具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。
一种铂类物质，其为结构如下结构式H1、和/或H2所示的物质：
Figure BDA0002000032820000021
其中优选地，所述铂类物质为结构式如H1所示的物质，其单晶衍射特征为：晶体结构的对称性被分配正交空间群(P2(1)2(1)2(1))，具有以下参数:
Figure BDA0002000032820000022
Figure BDA0002000032820000023
α＝β＝γ＝90°,
Figure BDA0002000032820000024
Z＝4,Dc＝2.120Mg/m3,F(000)＝872,μ(Mo Kα)＝9.944mm–1,and T＝113(2)。
本发明还提供所述铂类物质的制备方法，其中通过下面的化合物A制备所述铂类物质：
Figure BDA0002000032820000025
X代表卤素元素，选自氟、氯或溴元素中的一种以上，
更优选所述化合物A为化合物1：
Figure BDA0002000032820000026
更进一步优选所述化合物1通过下面的过程制备得到：
Figure BDA0002000032820000031
其中，优选温度为温度为25-35℃。
优选地，对于所述物质的制备方法，经过中间体化合物2：
Figure BDA0002000032820000032
和/或中间体化合物3：
Figure BDA0002000032820000033
制备得到所述铂类物质。
其中，优选地，经过化合物2制备得到所述铂类物质时，所述化合物2通过化合物A制备得到；优选通过化合物1和硝酸银反应制备得到；进一步更优选，化合物1和硝酸银的摩尔比例为1:1-2、更优选所述摩尔比例为1:1.81-2，更进一步优选所述摩尔比例为1:1.81；
进一步优选，通过化合物A制备化合物2的反应中，温度为25-35℃，更优选反应时间为15-20小时；还更优选地，反应温度为30℃，还更优选地，避光反应时间为18小时；或者
进一步优选，经过化合物3制备得到所述铂类物质时，所述化合物3通过所述化合物2制备得到，优选化合物3通过将所述物质2和树脂避光反应(优选温度为25-35℃或反应0.5-2小时)得到，进一步优选化合物2和所述树脂避光反应之后过滤得到滤液，洗涤树脂得到洗液，合并滤液和洗液进行下一步反应。其中所述树脂为优选为已经处理的树脂，具体优选为经过氢氧化钠水溶液处理的树脂，更优选氢氧化钠水溶液的浓度为1.5mo l/L，更优选反应1小时。
其中所述制备方法，经过如下结构式H所示物质制备得到所述铂类物质，所述所述结构式H所示物质直接用作为所述铂类物质，其为所述结构式H1和结构式H2所示物质的混合物；或者所述结构式H所示物质进一步被分离为结构式H1所示物质和结构式H2所示物质，所述结构式H1所示物质或者结构式H2所示物质作为所述铂类物质，
Figure BDA0002000032820000041
优选的是，所述物质H通过物质3制备得到，更优选在物质3的溶液中加入羟基丙酸的水溶液，调节pH至偏酸性，在30-40℃避光反应得到所述物质H，优选反应30-40小时；更进一步优选，所述羟基丙酸水溶液的浓度为质量分数20％，或者所述偏酸性的pH为6.4-6.8；更进一步优选在38℃避光反应36小时。
其中作为一种优选的所述铂类物质的制备方法，包括如下步骤：
Figure BDA0002000032820000042
通过物质1和硝酸银制备物质2的反应中，温度为25-35℃，优选避光反应时间为15-20小时；更优选地，反应温度为30℃，避光反应时间为18小时；进一步更优选地，化合物1和硝酸银的摩尔比例为1:1-2、更优选所述摩尔比例为1:1.81，更进一步优选所述摩尔比例为1:1.81；
优选的是，通过物质2制备物质3的反应中，将物质2和树脂避光反应，优选温度为25-35℃或反应0.5-2小时，进一步优选之后过滤得到滤液，洗涤树脂得到洗液，合并滤液和洗液进行下一步反应。其中所述树脂为已经处理的树脂，具体优选是经过氢氧化钠水溶液处理的树脂，优选氢氧化钠水溶液的浓度为1.5mo l/L，优选反应1小时；
或者优选的是，
通过物质3制备物质H的反应中，将上一步获得的物质3的溶液中加入羟基丙酸的水溶液，调节pH至偏酸性进行反应，优选之后在30-40℃避光反应、更优选反应30-40小时；更进一步优选地，所述羟基丙酸水溶液的浓度为质量分数20％，或者，优选所述偏酸性的pH为6.4-6.8，更进一步优选地，38℃避光反应36小时。
优选地，对于前述铂类物质的制备方法，其中，将物质H通过超临界流体色谱分离得到物质H1和物质H2；其中流动相为氨水甲醇溶液，
Figure BDA0002000032820000051
本发明还提供所述铂类物质的检测方法，其特征在于，所述方法为HPLC法，所述的HPLC法的检测条件为：用硅胶表面涂覆有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂，以正己烷-乙醇(体积比例60～70:30～40)为流动相，流速为每分钟0.8-1.5ml，检测波长为208-212nm，柱温为30-40℃，等度洗脱、优选洗脱30-50min；
更优选地，以体积比例63-67:37-33的正己烷-乙醇为流动相，柱温为33-37℃；更进一步优选地，流动相为正己烷-乙醇(体积比例65:35)，流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为35℃，等度洗脱时间为40min。
优选地，对于所述物质的检测方法，其中，供试品溶液中如有有关物质峰，则以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：有关物质H2的相对保留时间为2.40-2.70、优选为2.58，有关物质H1的相对保留时间为2.00-2.30,、优选为2.16。
本发明还提供所述物质在洛铂原料药或者制剂的质量标准中作为有关物质指标进行控制的用途。
本发明还提供一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述的有关物质为前面所述的结构式H1、或H2所示的铂类物质、或者结构式H1所示的铂类物质和结构式H2所示的铂类物质的混合物(这种情况下，也称为结构式H所示的铂类物质)，其特征在于所述的测定方法采用HPLC法检测，检测条件为：用硅胶表面涂覆有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂，以正己烷-乙醇(体积比例60～70:30～40)为流动相，流速为每分钟0.8-1.5ml，检测波长为208-212nm，柱温为30-40℃；更优选流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为30-40℃，等度洗脱30-50min；更优选地，流动相为正己烷-乙醇(体积比例65:35)，流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为35℃，等度洗脱时间为40min。
优选地，对于所述洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其中，供试品溶液中如有有关物质峰，则以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：有关物质H2的相对保留时间为2.40-2.70、优选为2.58，有关物质H1的相对保留时间为2.00-2.30,、优选为2.16。
本发明还提供一种含有所述铂类物质的药物组合物，所述药物组合物为药物制剂，优选所述组合物为注射用药物制剂。
优选地，其中所述药物制剂包括辅料，优选的是，所述辅料选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂和基质中的一种或两种以上；进一步优选的是，所述辅料选自填充剂和抗氧化剂中的一种或两种以上。
所述铂类物质或所述含有所述铂类物质的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
其中所述肿瘤为肺癌、肝癌、小细胞肺癌、乳腺癌、血液肿瘤、白血病、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和/或肾癌细胞，优选为Jurkat Clone E6-1、HL-60或THP-1细胞产生的白血病、或者SK-NEP-1细胞产生的肾癌。
为使本发明所述组合物中的制剂能够实现，可以在制备这些制剂时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；抗氧化剂包括：亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、叔丁基对羟基茴香醚、硫脲、维生素C、没食子酸丙酯、α-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。因此在本发明物质的基础上加入任何其他的有助于形成稳定地发挥药效的其他物质的都是本发明的保护范围。
本发明的有益效果如下：
本发明将物质H的两个非对映体异构体分离，并且首次进行了结构确认，确认为洛铂的有关物质，为建立完整的洛铂质量检测体系奠定了较好的基础。本发明提供了具有结构式H1和H2的铂类物质作为洛铂质量标准中的有关物质进行检测的方法，该方法灵敏度高，专属性强，重复性好，准确度高。
附图说明
图1：本发明物质H的HPLC-MS中的HPLC图谱；
图2：本发明物质H的HPLC-MS中的MS图谱；
图3：本发明物质H的1H-NMR图谱；
图4：本发明物质H的13C-NMR图谱；
图5：本发明物质H的Q NMR图谱；
图6：本发明物质H的UV图谱；
图7：本发明物质H的IR图谱；
图8：本发明物质H的DSC图谱；
图9A-1：本发明物质H1的HPLC-MS结构确认检测的HPLC色谱图(波长220nm)；
图9A-2：本发明物质H1的HPLC-MS结构确认检测的HPLC色谱图(波长254nm)；
图9B：本发明物质H1的HPLC-MS结构确认检测的MS图谱；
图10A：本发明物质H1的SFC图谱；
图10B：本发明物质H1的分子三维结构图；
图11A-1：本发明物质H2的HPLC-MS结构确认检测的HPLC色谱图(波长220nm)；
图11A-2：本发明物质H2的HPLC-MS结构确认检测的HPLC色谱图(波长254nm)；
图11B：本发明物质H2的HPLC-MS结构确认检测的MS图谱；
图12：本发明物质H2的SFC图谱；
图13：本发明物质H1和H2作为洛铂有关物质的HPLC典型图谱；
图14A-1：物质H对HCCC-9810的剂量响应曲线图；
图14A-2：STSP对HCCC-9810的剂量响应曲线图；
图14B-1：物质H对NCI-H460的剂量响应曲线图；
图14B-2：STSP对NCI-H460的剂量响应曲线图；
图14C-1：物质H对MDA-MB-453的剂量响应曲线图；
图14C-2：STSP对MDA-MB-453的剂量响应曲线图；
图14D-1：物质H对DU 145的剂量响应曲线图；
图14D-2：STSP对DU 145的剂量响应曲线图；
图14E-1：物质H对95-D的剂量响应曲线图；
图14E-2：STSP对95-D的剂量响应曲线图；
图14F-1：物质H对THP-1的剂量响应曲线图；
图14F-2：STSP对THP-1的剂量响应曲线图；
图14G-1：物质H对OVCAR-3的剂量响应曲线图；
图14G-2：STSP对OVCAR-3的剂量响应曲线图；
图14H-1：物质H对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；
图14H-2：STSP对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；
图14I-1：物质H对AGS的剂量响应曲线图；
图14I-2：STSP对AGS的剂量响应曲线图；
图14J-1：物质H对HL-60的剂量响应曲线图；
图14J-2：STSP对HL-60的剂量响应曲线图；
图14K-1：物质H对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；
图14K-2：STSP对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；
图15：非对映异构体II的线性图；
图16：非对映异构体I的线性图；
图17：物质H2的线性图；
图18：物质H1的线性图。
具体实施方式
本发明提供一种洛铂中的有关物质及其检测方法，以及其抗肿瘤的应用。本发明优选的实施方式中，制备铂类物质H1或H2的方法如下：
Figure BDA0002000032820000091
通过物质1制备物质2的反应中，温度为25-35℃，避光反应时间为15-20小时；优选地，反应温度为30℃，还优选地，避光反应时间为18小时；
优选的是，通过物质2制备物质3的反应中，将物质2和树脂避光反应0.5-2小时，之后过滤得到滤液，洗涤树脂得到洗液，合并滤液和洗液进行下一步反应，其中所述已经处理的树脂是经过氢氧化钠水溶液处理的树脂，优选氢氧化钠水溶液的浓度为1.5mo l/L，优选反应1小时。
通过物质3制备物质H的反应中，将上一步获得的物质3的溶液中加入羟基丙酸的水溶液，调节pH至偏酸性，之后30-40℃避光反应30-40小时，经过滤纯化得到最终产品，优选地，所述羟基丙酸水溶液的浓度为质量分数20％，优选地，所述偏酸性的pH为6.4-6.8，优选地，38℃避光反应36小时；
之后将物质H通过超临界流体色谱分离得到物质H1和物质H2；其中流动相为氨水甲醇溶液。
在本发明中，任何影响药物纯度的物质统称为“影响洛铂质量的有关物质”或者“影响质量的有关物质”，简称“有关物质”(本文中有些情况下也称为“相关物质”)，例如在检测洛铂质量的XRD衍射峰中出现的影响洛铂质量的有关物质峰，简称为“有关物质峰”；本发明中的所述“有关物质”有些情况下即是本领域技术人员公知的影响药物纯度的“杂质”，然而，在本发明中所述”有关物质”不限于“杂质”的范畴，还包括具有一定抗癌活性甚至其活性高于洛铂的物质，他们相对于活性分子“洛铂”而言属于与洛铂有关的物质范畴，其抗癌活性或者其他的研发新药物方面积极的作用和功能的原理尚未完全研究清楚。本发明中“有关物质”的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定杂质的合理限度，这一研究贯穿于药品研发的整个过程。
在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述的有关物质为式H1所示的化合物(本申请中也称为物质H1或者化合物H1)、式H2所示的化合物(本申请中也称为物质H1或者化合物H2)，或者式H1所示的化合物和式H2所示化合物的混合物(本申请中也称为物质H)，其特征在于所述的测定方法采用HPLC法检测。
优选地检测条件为：用硅胶表面涂覆有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂，以正己烷-乙醇(60～70:30～40)为流动相，流速为每分钟0.8-1.5ml，检测波长为210nm，柱温为30-40℃，等度洗脱、优选洗脱30-50min；
更优选地，流动相为正己烷-乙醇(65:35)，流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为35℃，等度洗脱时间为40min。
更优选地，对于所述物质的检测方法，其特征在于，供试品溶液中如有有关物质峰，则以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：有关物质H2的相对保留时间为2.40-2.70、优选为2.58，有关物质H1的相对保留时间为2.00-2.30,、优选为2.16。
其中，所述物质H1、或物质H2的相对保留时间是指相对于洛铂的保留时间，具体是相对于洛铂非对映体II的保留时间。具体来说，作为洛铂化合物已知有2种异构体，即洛铂非对映体I和洛铂非对映体II，它们的结构式如下所述：
洛铂非对映体I(简称RRS)：
Figure BDA0002000032820000111
洛铂非对映体II(简称SSS)：
Figure BDA0002000032820000112
下面将通过物质制备，物质结构确认和物质的抗肿瘤活性测定等作为具体实施例进行说明。
实施例1物质H的制备
物质H以及H1和H2的制备过程如下面的反应式(A)、(B)和分离过程式(C)所示；先按照专利号为CN102093226B实施例1所述的方法制备，并经结构鉴定确认得到下面化合物1A(反式-二氨甲基环丁烷草酸盐)，然后以该草酸盐为原料按照下面的反应式(A)制备得到式1所示的二碘化物，即化合物1；再由化合物1通过下面的反应式(B)得到式(H)所示的化合物(也称化合物H)；再对该H化合物通过SFC(超临界流体色谱)分离得到化合物H1和化合物H2，如分离过程式(C)所示。其中温度、时间、溶剂等反应条件仅仅示例性标注了部分实施方案的温度，本发明中，物质的H的制备方法不限于下面的反应式(A)、(B)和(C)所示。
Figure BDA0002000032820000121
下面所有实施例中所用到的试剂来源如下：
Figure BDA0002000032820000122
其中，先按照专利号为CN102093226B实施例1所述的方法制备，并经结构鉴定确认得到化合物1A(反式-二氨甲基环丁烷草酸盐)，然后以该草酸盐为原料按照反应式(A)制备得到式1所示的二碘化物即化合物1，作为通过反应式(B)制备化合物H的原料。具体来说，化合物1的制备过程(后面的实施例5和6中所述的二碘化合物1也是通过下述过程制备)如下：
ⅰ.将化合物1A(30.0g,101.9mmol),氯亚铂酸钾(36.0g,86.7mmol),碘化钾(86.0g,518.1mmol)和氢氧化钾(24.0g,427.7mmol)分别溶于170mL,180mL,87mL和120mL纯化水,得A,B,C,D液。
ⅱ.将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。
ⅲ.将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。
ⅳ.将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。
ⅴ.将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在30℃下搅拌2小时。
ⅵ.过滤,滤饼用纯化水洗涤(100mLX6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物1(35g)为黄色粉末。
下面，以化合物1为起始原料通过反应式(B)制备化合物H的具体过程以及通过化合物H制备H1和H2的过程说明如下：
1)制备化合物2
将化合物1(20g,35.5mmol)分散至纯化水(84mL)和丙酮(12mL)中，得A料。将硝酸银(10.91g,64.2mmol)溶于纯化水(32mL),加至A料,30℃避光搅拌18小时。过滤,滤饼用水洗涤6次(20mL*6),合并滤液得化合物2的溶液250mL直接用于下一步。
2)制备化合物3
用1.5mol/L的氢氧化钠水溶液(120mL)处理树脂(80g),处理三遍。取250mL化合物2的溶液和处理过的树脂(80g)置于三口烧瓶,30℃避光搅拌1小时。过滤,树脂用纯化水100mL洗涤6次(100mL*6),合并洗液及滤液得化合物3(850mL)的溶液直接用于下一步。
3)制备物质H
向化合物3的溶液中加入质量为20％的羟基丙酸水溶液，调节pH＝6.4,35℃避光搅拌36小时。过滤，将滤液减压浓缩至干。将剩余物溶于丙酮(9mL)和纯化水(18mL)，然后于10℃重结晶120h，过滤，旋干得相关物质H(3.5g)为类白色固体。
4)制备物质H1和H2
有关物质H通过SFC(超临界流体色谱，所用仪器型号为：Waters 80Q PreparativeSFC system)分离得到有关物质H1和H2。其中分离的条件如下：柱:DAICEL CHIRALCEL OD(250mm*30mm,10μm)，流动相A:[超临界CO2]，流动相B:[甲醇，+体积比为0.1％NH3·H2O]；等度洗脱:0-14min，75体积％流动相A+25体积％流动相B)。
其中物质H1和H2具体是通过SFC超临界流体色谱分离(H1为色谱先出来、即保留时间较短的化合物即标记为H1，H2为色谱晚出来、即保留时间长得到的物质即标记为H2，之后进行了下面所述的结构确认，特别是进行了单晶培养之后确认，物质H1成功得到了单晶衍射峰等相关检测数据；然而物质H2未得到理想的单晶衍射数据，根据结构确认得到物质H1的结构之后，可以推定出物质H2的结构。在下面结构确认实施例和活性测试实施例中，化合物H1和H2均对应于本实施例1中制备得到的化合物H1和化合物H2，也就是说，本发明所称化合物H1为按照上述液相色谱条件制备化合物时先得到(即保留时间较短)的化合物，本发明所称化合物H2为按照上述液相色谱条件制备化合物时后得到(即保留时间较长)的化合物。
具体来说，下面结构确认和活性检测实施例中所述物质H1和H2结构式如下所述：
Figure BDA0002000032820000141
分子式均为：C9H18N2O3Pt
实施例2：结构确认
1.对实施例1得到的物质H进行结构确认：
1)HPLC-MS:
所用的HPLC-MS条件为：
HPLC条件：所用的HPLC-MS仪器名称和型号为：Agilent 1200LC&Agilent6110MSD；
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq,2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表1程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm和215nm(DAD检测器)，柱温为50℃，检测图谱见附图1。
MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000；
表1
Figure BDA0002000032820000151
检测结果如下表2，图谱见附图2，可以看出，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有194Pt,195Pt,196Pt,因此在样品的MS中，在397.1、398.1、399.1、400.0处出现[M’+H]+峰是样品准分子离子峰、在440.1左右处出现[M’+CH3CN+H]+峰是样品准分子离子峰及在795.3处出现[2M’+H]+是样品二聚合作用后的准分子离子峰，对应于物质H(C9H18N2O3Pt)的分子量为397.33，质谱信息与物质H(C9H18N2O3Pt)分子结构相符。质谱信息其与本发明物质分子结构相符。
表2
Figure BDA0002000032820000152
注：M’为C9H18N2O3Pt的分子量
2)1H-NMR:
仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪
氢谱(1H-NMR MeOD_400MHz)的化学位移及归属如下表3所示：
表3
化学位移(ppm) 多重性 质子数 氢的归属
1.21-1.23 d 3 6
1.57-1.65 m 2 1,1’
1.90-1.98 m 2 1,1’
2.36-2.89 m 6 3,3’,2,2’
3.99-4.05 m 1 5
谱图见附图3，可以看出，样品氢谱数据与产品物质H的分子结构C9H18N2O3Pt相吻合。
3)13C-NMR:
仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪
碳谱(13C-NMRMeOD_400MHz)的化学位移及归属如下表4所示：
表4
化学位移(ppm) 碳原子类型 碳原子数 碳的归属
21.72-21.76 仲碳 2 1,1’
22.01-22.17 伯碳 1 6
39.51-40.07 仲碳 2 3,3’
50.59-50.89 叔碳 2 2,2’
74.42 仲碳 1 5
194.21-194.25 季碳 1 7
谱图见附图4，可以看出，13C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰，这与所示产品物质H的分子结构C9H18N2O3Pt相符。
4)Q NMR
其是采用BrukerAVANCE NEO 400进行测定QNMR谱(MeOD_400MHz)，使用的溶剂为CD3OD，采用内标法进行测定，内标物为香豆素(99.74质量％)，测定结果如下表5所示：
表5
Figure BDA0002000032820000171
W％的计算公式如下：
Figure BDA0002000032820000172
式中，WISTD为内标物的质量(mg)；
WSam为样品的质量(mg)；
ASam/AISTD为样品和内标物的面积比；
MWSAM为样品的分子量；
MWISTD为内标物的分子量；
nISTD和nSam为各官能团的质子数；
WISTD％为内标物的质量百分比，
谱图见附图5，从上表中可以看出，其标定重量含量为97.4％。
5)紫外吸收光谱(UV):
紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；测定图谱见附图6，由图可见，波长190nm是最大吸收波长。
6)红外光谱(IR)
红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围：4000cm-1～400cm-1，测定结果及解析如下表6所示：
表6
吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>) 振动类型 基团归属
3450.62,3206.31,3127.28 ν<sub>NH</sub> 氨基N-H伸缩振动
2968.38,2946.15,2866.99 ν<sub>CH</sub> 烷基C-H伸缩振动
1638.50,1578.55 ν<sub>C＝O</sub> 羰基C＝O伸缩振动
1373.23,1346.20,320.56 δ<sub>CH</sub> 烷基C-H弯曲振动
1110.83 ν<sub>C-O</sub> C-O键的伸缩振动
1042.14 ν<sub>C-N</sub> C-N键的伸缩振动
图谱见附图7。
6)差示扫描量热法(DSC)
仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃图谱见附图8。
7)旋光度(OR)
旋光仪:Anton PaarMCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水)；长度(dm)＝1；灯：钠；WL(nm)＝589；25℃；
结果如下表7所示：
表7
Figure BDA0002000032820000181
通过上述图谱确认了本发明的物质结构为
Figure BDA0002000032820000182
4.物质H1的结构确认
对实施例1得到的物质H1进行的结构确认过程如下：
1)HPLC-MS:
所用的HPLC-MS条件为：
HPLC条件：所用HPLC-MS仪器为SHIMADZU LCMS-2020；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kinetex EVO C182.1*30mm，5um)，以体积比为0.025％氨水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表8程序进行梯度洗脱；检测波长为220nm和254nm(PAD检测器)，柱温为40℃。
MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。
表8
Figure BDA0002000032820000191
HPLC-MS的检测结果图谱见附图9A-1、图9A-2和图9B，可以看出，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有194Pt,195Pt,196Pt,因此在样品的MS中，在397.1、398.1、399.1、400.0处出现[M’+H]+峰是样品准分子离子峰，在795.4处出现[2M’+H]+是样品二聚合作用后的准分子离子峰，对应于物质H 1(C9H18N2O3Pt)的分子量为397.33，质谱信息与物质H1(C9H18N2O3Pt)分子结构相符。质谱信息与本发明物质分子H1结构相符。
2)物质H1的SFC检测
其中，SFC检测条件：仪器型号名称为：Agilent 1260series analytical SFC，柱:DAICEL CHIRALCEL OD-3(50mm*4.6mm,3μm)，流动相A:[超临界CO2]，流动相B:[甲醇，+体积比为0.05％二乙胺]，按下表8A程序进行梯度洗脱，流速:3.0mL/min，柱温:35℃，波长:220nm。
表8A
Figure BDA0002000032820000192
谱图如图10A所示。
从图10A中可以看出保留时间为2.678min时，出现了化合物H1的峰。
3.物质H1的单晶衍射
1)单晶培养制备的条件如下：
将样品溶于丙酮-水(1：2)的溶液中放在半密封容器中，溶剂在室温下慢慢挥发，合适大小的晶体在第17天形成，通过显微镜检查其透明度，然后晶体进行X-光检测。
2)单晶衍射的设备及数据收集方式；
设备：配有石墨单色Mo-Kα辐射靶的Rigaku SaturnX-射线衍射仪(Rigaku SaturnDiffractometerusing graphic-monochromated Mo Kαradiation)
Figure BDA0002000032820000201
Figure BDA0002000032820000202
单管直径：φ＝0.50mm
从晶体到CCD检测器的距离：d＝45mm
管电压(Tube Pressure):50kV
管电流(Tube Flow):16mA
在θ的2.444to 27.864°范围内共收集到16961反射数据.极限指标:-12≤h≤12,-13≤k≤13,-18≤l≤18；在3365unique reflections(Rint＝0.0682).
3)单晶衍射的结果综述如下：
该晶体是一种无色的棱柱，具有以下维度:0.10×0.10×0.10mm3；晶体结构的对称性被分配正交空间群(P2(1)2(1)2(1))，具有以下参数:
Figure BDA0002000032820000203
Figure BDA0002000032820000204
α＝β＝γ＝90°,
Figure BDA0002000032820000205
Z＝4,Dc＝2.120Mg/m3,F(000)＝872,μ(Mo Kα)＝9.944mm–1,and T＝113(2)。分子三维结构如图10B所示。
XRD衍射图测试条件：
4)单晶衍射的具体数据如下：其中X-ray晶体学数据总结如下表9：
表9
Figure BDA0002000032820000211
其中，子座标(x10^4)和各向同性位移参数(A^2x10^3)(Atomic coordinates(x10^4)and equivalent isotropic displacement parameters(A^2x10^3).)如下表10：
表10
Figure BDA0002000032820000212
Figure BDA0002000032820000221
其中，键长[A]和键角[deg](Bond lengths[A]and angles[deg])如下表11：
表11
Figure BDA0002000032820000222
Figure BDA0002000032820000231
Figure BDA0002000032820000241
其中，扭转角[deg](Torsion angles[deg].)如下表12所示：
表12
Figure BDA0002000032820000251
其中，氢键的键长及键角[A and deg.](Hydrogen bonds[A and deg.]..)如下表13所示。
表13
Figure BDA0002000032820000252
Figure BDA0002000032820000261
用来产生等效原子的对称变换(Symmetry transformations used to generateequivalent atoms)；
#1-x+1/2,-y+1,z+1/2 #2x,y+1,z+1 #3x,y+1,z #4-x+1,y+1/2,-z+1/2 #5x-1/2,-y+1/2,-z #6x,y,z-1 #7-x+1/2,-y+1,z-1/2 #8-x,y-1/2,-z+1/2 #9x-1,y-1,z #10x,y-1,z
综上所述，确定出H1的绝对构型为：
Figure BDA0002000032820000262
5.物质H2的结构确认
对实施例1得到的物质H2进行的结构确认过程如下：
1)HPLC-MS
所用的HPLC-MS条件为：
HPLC条件：所用HPLC-MS仪器型号为SHIMADZU LCMS-2020；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kinetex EVO C182.1*30mm，5μm)，以体积比为0.025％氨水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表14程序进行梯度洗脱；检测波长为220nm和254nm(PAD检测器)，柱温为40℃。
MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000；
表14
Figure BDA0002000032820000263
检测结果见附图11A-1、图11A-2和图11B，可以看出，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有194Pt,195Pt,196Pt,因此在样品的MS中，在398.2处出现[M’+H]+峰是样品准分子离子峰，在795.4处出现[2M’+H]+是样品二聚合作用后的准分子离子峰，对应于物质H2(C9H18N2O3Pt)的分子量为397.33，质谱信息与物质H2(C9H18N2O3Pt)分子结构相符。质谱信息与本发明物质分子H2结构相符(在如上所述确定了物质H1的绝对构型情况下，可反推出物质H2的构型)。
2)物质H2的SFC检测(超临界流体色谱检测)
SFC检测条件：所用仪器型号名称为：Agilent 1260series analytical SFC，柱:DAICEL CHIRALCEL OD-3(50mm*4.6mm,3um)，流动相A:[超临界CO2]，流动相B:[甲醇，+体积比为0.05％二乙胺]，按下表14A程序进行梯度洗脱，流速:3.0mL/min，柱温:35℃，波长:220nm。
表14A
Figure BDA0002000032820000271
谱图如图12所示。
从图12中可以看出保留时间为2.805min时，出现了化合物H2的峰。
根据H1的单晶衍射结果和物质H的结构，可以反推得到物质H2的结构如下：
Figure BDA0002000032820000272
实施例3：检测方法
照高效液相法(中国药典2015年版四部通则0512)测定
色谱条件与系统适用性试验
液相色谱仪器型号：SHIMADZU LC-20AD
用硅胶表面涂覆有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(DaicelChiralcel OZ-3，4.6*150mm，3.0um)，以正己烷-乙醇(65:35)为流动相，流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为35℃，等度洗脱40min。系统适用性试验溶液连续进样6次，洛铂主峰峰面积的相对标准偏差应不大于4.0％。
供试品溶液的制备
取洛铂待测样品(根据专利CN 102020679 B说明书中实施例2公开的方法制备、并且经过结构鉴定确认得到的的洛铂样品，其中洛铂下面实验中所提到的洛铂含量以无水物计)约100mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
系统适用性试验溶液/1％对照溶液的制备
精密量取供试品溶液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取对照贮备液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为1％对照溶液。
测定法
取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至40分钟。供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位；具体来说，有关物质H1、H2的液相色谱典型图谱见附图13所示。由图13可以看出，在保留时间t＝8.550处出现洛铂非对映体II的峰，t＝10.062处出现洛铂非对映体I的峰，在t＝18.436处出现物质H1的峰，在t＝22.043处出现物质H2的峰；有关物质H1的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为2.16，有关物质H2的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为2.58；按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，有关物质H1峰面积不得超过对照溶液中主成分的峰面积0.5倍，有关物质H2峰面积不得超过对照溶液中主成分的峰面积。
实施例3：体外抗肿瘤活性测定(本发明实施例1制备的物质H(含物质H1和H2的混合物)的活性测定实验)
一、试剂及耗材
1.细胞株
细胞株具体名称如下表15所示。
表15
种属 细胞名称
肝癌细胞 HCCC-9810
肺癌细胞 NCI-H460
乳腺癌细胞 MDA-MB-453
前列腺癌细胞 DU145
白血病细胞 Jurkat Clone E6-1
胃癌细胞 AGS
白血病细胞 HL-60
肾癌细胞 SK-NEP-1
肺癌细胞 95-D
白血病细胞 THP-1
卵巢癌细胞 OVCAR-3
2.DMEM培养基，中国Procell，货号：PM150210
3.MEM培养基，中国Procell，货号：PM150411
4.McCoy’s 5A培养基，中国Procell，货号：PM150710
5.Ham's F-12培养基，中国Procell，货号：PM150810
6.
Figure BDA0002000032820000291
Luminescent Cell Viability Assay，美国Promega，货号：G7572
7.96孔细胞培养板，美国Corning，货号：3610
8.Envision，美国PerkinElmer
9.FBS，Lonsera，货号：S711-001S
10.丙酮酸钠，中国Procell，货号：PB180422
11.Insulin，中国上海源培，货号：S454
12.β-mercaptoethanol，Gibco，货号：21985
13.DMSO，美国Sigma，货号：D8418
14.Penicillin&Streptomycin(P/S)，中国Procell，货号：PB180120
15.0.25％胰酶-EDTA，中国Procell，货号：PB180228
16.RPMI-1640培养基，中国Procell，货号：PM150110
17.IMDM培养基，中国Procell，货号：PM150510
二、溶液与缓冲液
1.细胞生长培养基
配置完毕后，储存在4℃备用，具体细胞的培养基如下表16所示。
表16
细胞名称 培养基
HCCC-9810 RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
NCI-H460 RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
MDA-MB-453 DMEM+10％FBS+1％P/S
DU 145 MEM+10％FBS+1％P/S
Jurkat Clone E6-1 RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
AGS F-12+10％FBS+1％P/S
HL-60 IMDM+20％FBS+1％P/S
SK-NEP-1 McCoy’s5A+15％FBS+1％P/S
95-D RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
THP-1 RPMI-1640+10％FBS+0.05mMβ-mercaptoethanol+1％P/S
OVCAR-3 RPMI-1640+20％FBS+0.01mg/ml Insulin+1％P/S
注：表格中的％都是体积比例。
2.Heat-inactivated FBS热灭活血清
将血清于56摄氏度水浴30分钟即可。
3.物质处理：
将物质(如前所述实施例1制备的物质H，即化合物H1和化合物H2的混合物)3.13g溶解于DMSO中配制浓度为1mM的溶液在-20℃下保存待用。阳性对照药为星形孢菌素(Staurosporine)简称STSP，是一种天然产物分离最初于1977年由细菌霉菌Staurosporeus，下面的实验所有STSP购自MedChemExpress(MCE)、产品名称staurosporine、货号HY-15141。
二、实验方法：
复苏细胞
将需要复苏的细胞从液氮罐内迅速取出，在37℃水浴锅中融化，迅速加入预热的培养基中。1000转/分钟，离心5分钟后将离心管取出，弃去上清液，向离心管内加入新鲜预热的培养基，重悬细胞，然后将细胞悬液加入培养皿中，37℃，5％CO2培养。
细胞传代
细胞传代：贴壁细胞，当细胞长满培养皿80～90％，用0.25％胰酶(由0.25g胰酶加入100ml pbs溶液配制而成)消化细胞，然后用新的培养基将细胞重悬，将细胞按适当比例传代，约2～3d传代1次。悬浮细胞，收集细胞悬液，800rpm，离心5分钟，去除上清，用新鲜培养基重悬，按照适当比例传代，约2～3d传代1次。
细胞接种及药物处理
物质工作液浓度的配制
物质单一浓度测试
根据检测要求，实验当天，将物质使用DMSO稀释至1mM母液，再用培养基进一步稀释到50uM(5X最终浓度)工作液，最终物质浓度如下所示，物质的测试浓度为10微摩尔，37℃，5体积％CO2培养箱，物质的孵育时间为72小时。
物质IC50测试
根据检测要求，实验当天，将物质使用DMSO稀释至1mM母液作为最高浓度，并进行2倍，3倍或5倍梯度稀释，再用培养基将每一个浓度点进一步稀释到5X最终浓度的工作液。
细胞接种及药物处理
1.检测前1天，根据细胞生长速度将细胞按不同密度接种于96孔细胞板中，每孔接种80μL细胞悬液，37℃，5体积％CO2培养箱，孵育过夜。细胞的具体铺板密度如下表17所示：
表17
Figure BDA0002000032820000311
Figure BDA0002000032820000321
2.根据实验要求，每孔加入20μL物质工作液，37℃，5体积％CO2培养箱，孵育72小时。
3.结束孵育后，按照CTG试剂盒(购自promega、货号是G7572、名称是celltiter-glo)操作要求进行检测，得到相应化学发光值，计算细胞活性。
4.计算
细胞活率＝加药组RLU值/对照组(溶剂)RLU值×100％
实验结果：
吸光度原始数据及％Cell Viability细胞存活率
测定的剂量-响应(效应)曲线见附图14A-1至图14K-2。
物质的IC50值如下表18所示：
表18
细胞名称 物质IC<sub>50</sub> 对照(STSP)
HCCC-9810 >10μM 16.93nM
NCI-H460 1.76μM 40.35nM/40.41nM
MDA-MB-453 >10μM 48.08nM
DU 145 6.4μM 93.13nM/93.32nM
Jurkat Clone E6-1 953.4nM 14.67nM/11.63nM/12.12nM/12.84nM
AGS 2.3μM 6.02nM/5.72nM/5.84nM
HL-60 2.63μM 17.1nM/17.42nM/17.06nM
SK-NEP-1 672.5nM 12.09nM/12.38nM/11.81nM/10.72nM
95-D 2.42μM 56.48nM/50.42nM/69.34nM
THP-1 2.04μM 73.02nM/74.45nM/42.58nM
OVCAR-3 1.63μM 27.19nM/47.29nM/40.25nM
通过上述活性数据可以看出，本发明物质对人卵巢癌细胞株Jurkat Clone E6-1和SK-NEP-1的抑制活性达到了nm级别，对其他的肿瘤细胞也就有一定的抑制活性，一般活性在5μM以下。
单一浓度10μM的物质的抑制活性如下表19所示：
表19
细胞名称 物质的细胞存活率(％) 对照的细胞存活率(％)
HCCC-9810 48.32 2.83
NCI-H460 42.83 1.54
MDA-MB-453 48.42 1.99
DU 145 35.32 14.27
Jurkat Clone E6-1 6.74 0.93
AGS 21.72 3.11
HL-60 7.66 2.03
SK-NEP-1 10.70 3.07
95-D 29.78 2.51
THP-1 1.05 1.30
OVCAR-3 22.90 5.15
通过上述数据可以看出，本发明物质在10μM的浓度下对上述癌细胞具有较好的抑制活性，特别是针对Jurkat Clone E6-1、HL-60、THP-1和SK-NEP-1的抑制率达到90％以上，具有显著的抑瘤活性，可以进一步开发为抗癌药物应用于临床。
实施例4：检测方法的方法学验证
为了确认本发明检测方法的实用性和准确性，下面对前面实施例中洛铂中有关物质的检测方法的专属性、线性及范围、检测限和定量限、校正因子、准确度(回收率)等方面进行说明：
1、专属性
精密量取空白溶液(即甲醇溶液)、分离度溶液RS(各化合物浓度为0.1mg/mL)各20uL，注入液相色谱仪，结果如下表20所示，洛铂主峰与杂质峰分离度大于1.5，专属性良好。
表20
Figure BDA0002000032820000341
2、灵敏度
取洛铂对照品溶液和杂质H溶液，逐步稀释，以信噪比(S/N)10为定量限。洛铂定量限浓度为0.0203mg/mL，杂质H1定量限浓度为0.0197mg/mL，杂质H2定量限浓度为0.0197mg/mL，定量限结果如下表21所示。
表21
Figure BDA0002000032820000342
3、线性
以洛铂非对映体Ⅱ的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在3.994mg/mL～6.04mg/mL范围内洛铂非对映体Ⅱ的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝8595033.2484X-2155759.5499，相关系数R2为0.9934，表明线性关系良好，详见附图15；
以洛铂非对映体Ⅰ的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在3.994mg/mL～5.965mg/mL范围内洛铂非对映体Ⅰ的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝8027255.9361X-2805049.4891，相关系数R2为0.9977，表明线性关系良好,详见附图16；
以杂质H2的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.0236mg/mL～0.1180mg/mL范围内杂质H2的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝8003691.9295X+104.8500，相关系数R2为0.9997，表明线性关系良好,详见附图17；
以杂质H1的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.0256mg/mL～0.1278mg/mL范围内杂质H1的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝8282678.6134X+1774.0500，相关系数R2为0.9999，表明线性关系良好,详见附图18。
4、准确度
洛铂非对映体和各杂质分别平行配制3份50％限度浓度、3份限度浓度和3份150％限度浓度的回收率溶液，考察各自的准确度。结果表明：
洛铂非对映体Ⅰ的回收率在99％～102％之间，洛铂非对映体Ⅱ的回收率为98％～100％之间；
50％限度浓度下，杂质H1的回收率在100％～105％之间，杂质H2的回收率在100％～105％之间；100％限度浓度下，杂质H1的回收率在100％～105％之间，杂质H2的回收率在95％～110％之间；150％限度浓度下，杂质H1的回收率在100％～105％之间，杂质H2的回收率在100％～105％之间；由此证明该方法的准确度良好。
实施例5物质H、H1和H2的制备
1)制备化合物2
将化合物1(20g,35.5mmol)分散至纯化水(84mL)和丙酮(12mL)中，得A料。将硝酸银(10.91g,64.2mmol)溶于纯化水(32mL),加至A料,25℃避光搅拌20小时。过滤,滤饼用水洗涤6次(20mL*6),合并滤液得化合物2的溶液250mL直接用于下一步。
2)制备化合物3
用2mol/L的氢氧化钠水溶液(120mL)处理树脂(80g),处理三遍。取250mL化合物2的溶液和处理过的树脂(80g)置于三口烧瓶,35℃避光搅拌0.5小时。过滤,树脂用纯化水洗涤(100mL*6),合并洗液及滤液得化合物3(850mL)的溶液直接用于下一步。
3)制备物质H
向化合物3的溶液中加入20％的羟基丙酸水溶液，调节pH＝6.6,30℃避光搅拌40小时。过滤，将滤液减压浓缩至干。将剩余物溶于丙酮(9mL)和纯化水(18mL)，然后于0℃重结晶120h，过滤，旋干得相关物质H(3.41g)为类白色固体。
4)制备物质H1和H2
相关物质H通过SFC(超临界流体色谱，所用仪器型号为：Waters 80Q PreparativeSFC system)分离得到相关物质H1和H2。其中分离的条件如下：柱:DAICEL CHIRALCEL OD(250mm*30mm,10um)，流动相A:[超临界CO2]，流动相B:[甲醇，+体积比为0.1％NH3·H2O]；等度洗脱:0-14min，75体积％流动相A+25体积％流动相B)。
实施例6物质H、H1和H2的制备
1)制备化合物2
将化合物1(20g,35.5mmol)分散至纯化水(84mL)和丙酮(12mL)中，得A料。将硝酸银(10.91g,64.2mmol)溶于纯化水(32mL),加至A料,35℃避光搅拌15小时。过滤,滤饼用水洗涤6次(20mL*6),合并滤液得化合物2的溶液250mL直接用于下一步。
2)制备化合物3
用1mol/L的氢氧化钠水溶液(120mL)处理树脂(80g),处理三遍。取250mL化合物2的溶液和处理过的树脂(80g)置于三口烧瓶,25℃避光搅拌2小时。过滤,树脂用纯化水洗涤(100mL*6),合并洗液及滤液得化合物3(850mL)的溶液直接用于下一步。
3)制备物质H
向化合物3的溶液中加入20％的羟基丙酸水溶液，调节pH＝6.8,40℃避光搅拌30小时。过滤，将滤液减压浓缩至干。将剩余物溶于丙酮(9mL)和纯化水(18mL)，然后于5℃重结晶120h，过滤，旋干得相关物质H(3.26g)为类白色固体。
4)制备物质H1和H2
相关物质H通过SFC(超临界流体色谱，所用仪器型号为：Waters 80Q PreparativeSFC system)分离得到相关物质H1和H2。其中分离的条件如下：柱:DAICEL CHIRALCEL OD(250mm*30mm,10um)，流动相A:[超临界CO2]，流动相B:[甲醇，+体积比为0.1％NH3·H2O]；等度洗脱:0-14min，75体积％流动相A+25体积％流动相B)。

Claims (18)

1.一种铂类物质，其特征在于，其为结构式如下H1、和/或H2所示的物质：
Figure FDA0002000032810000011
2.根据权利要求1所述的铂类物质，其特征在于，其为结构式如H1所示的物质，其单晶衍射特征为：晶体结构的对称性被分配正交空间群(P2(1)2(1)2(1))，具有以下参数:
Figure FDA0002000032810000012
Figure FDA0002000032810000013
α＝β＝γ＝90°,
Figure FDA0002000032810000014
Z＝4,Dc＝2.120Mg/m3,F(000)＝872,μ(Mo Kα)＝9.944mm–1,and T＝113(2)。
3.一种权利要求1或2所述铂类物质的制备方法，其中通过下面的化合物A制备所述铂类物质：
Figure FDA0002000032810000015
X代表卤素元素，选自氟、氯或溴元素中的一种以上，更优选的所述化合物A为化合物1：
Figure FDA0002000032810000016
更进一步优选所述化合物1通过下面的过程制备得到：
Figure FDA0002000032810000017
其中，优选温度为温度为25-35℃。
4.根据权利要求1-3任一项所述物质的制备方法，经过中间体化合物2：
Figure FDA0002000032810000021
和/或中间体化合物3：
Figure FDA0002000032810000022
制备得到所述铂类物质。
5.根据权利要求3或4所述制备方法，经过化合物2制备得到所述铂类物质时，所述化合物2通过化合物A制备得到；优选通过化合物1和硝酸银反应制备得到；进一步更优选，化合物1和硝酸银的摩尔比例为1:1-2、更优选所述摩尔比例为1:1.81-2，更进一步优选所述摩尔比例为1:1.81；
进一步优选，通过化合物A制备化合物2的反应中，温度为25-35℃，更优选反应时间为15-20小时；进一步优选地，反应温度为30℃，更优选反应时间为18小时。
6.根据权利要求3-5任一项所述制备方法，经过化合物3制备得到所述铂类物质时，所述化合物3通过所述化合物2制备得到，优选化合物3通过将所述化合物2和树脂避光反应(优选温度为25-35℃，反应0.5-2小时)得到，进一步优选化合物2和所述树脂避光反应之后过滤得到滤液，洗涤树脂得到洗液，合并滤液和洗液进行下一步反应。
7.根据权利要求3-6任一项所述制备方法，经过如下结构式H所示物质制备得到所述铂类物质，所述结构式H所示物质直接用作为所述铂类物质，其为所述结构式H1和结构式H2所示物质的混合物；或者所述结构式H所示物质进一步被分离为结构式H1所示物质和结构式H2所示物质，所述结构式H1所示物质或者结构式H2所示物质作为所述铂类物质，
Figure FDA0002000032810000031
优选的是，所述物质H通过化合物3制备得到，更优选在化合物3的溶液中加入羟基丙酸的水溶液，调节pH至偏酸性，在30-40℃进行避光反应得到所述物质H，更优选反应30-40小时；更进一步优选，所述羟基丙酸水溶液的浓度为质量分数20％，或者所述偏酸性的pH为6.4-6.8；更进一步优选在38℃避光反应36小时。
8.根据权利要求3-7任一项所述制备方法，包括如下步骤：
Figure FDA0002000032810000032
通过化合物1和硝酸银制备化合物2的反应中，温度为25-35℃，优选避光反应15-20小时；更优选地，反应温度为30℃，避光反应18小时；进一步更优选，化合物1和硝酸银的摩尔比例为1:1-2、更优选所述摩尔比例为1:1.81-2，更进一步优选所述摩尔比例为1:1.81；
优选的是，通过化合物2制备化合物3的反应中，将物质2和树脂避光反应，优选温度为25-35℃，或者反应0.5-2小时；进一步优选之后过滤得到滤液，洗涤树脂得到洗液，合并滤液和洗液进行下一步反应；或者
优选的是，通过物质3制备物质H的反应中，将上一步获得的物质3的溶液中加入羟基丙酸的水溶液，调节pH至偏酸性进行反应，优选之后在30-40℃避光反应(优选反应30-40小时)；更进一步优选地，所述羟基丙酸水溶液的浓度为质量分数20％，或者优选所述偏酸性的pH为6.4-6.8，更进一步优选地，在38℃避光反应36小时。
9.根据权利要求3-8任一项所述制备方法，其中将物质H通过超临界流体色谱分离得到物质H1和物质H2；其中流动相为氨水甲醇溶液,
Figure FDA0002000032810000041
10.一种权利要求1或2所述物质的检测方法，其特征在于，所述方法为HPLC法；优选地，所述的HPLC法的检测条件为：用硅胶表面涂覆有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂，以体积比例60～70:30～40为正己烷-乙醇为流动相，流速为每分钟0.8-1.5ml，检测波长为208-212nm，柱温为30-40℃，等度洗脱、优选洗脱30-50min；
更优选地，以体积比例63-67:37-33的正己烷-乙醇为流动相，柱温为33-37℃；更进一步优选地，流动相为体积比例65:35的正己烷-乙醇，流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为35℃，等度洗脱时间为40min。
11.根据权利要求10所述物质的检测方法，其特征在于，供试品溶液中如有有关物质峰，则以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：有关物质H2的相对保留时间为2.40-2.70、优选为2.58，有关物质H1的相对保留时间为2.00-2.30，优选为2.16。
12.权利要求1或2所述物质在洛铂原料药或者制剂的质量标准中作为有关物质指标进行控制的用途。
13.一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述的有关物质为权利要求1所述的铂类物质，其特征在于所述的测定方法采用HPLC法检测或HPLC-MS法，优选地检测条件为：用硅胶表面涂覆有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂，以正己烷-乙醇为流动相，体积比例为60～70:30～40，流速为每分钟0.8-1.5ml，检测波长为208-212nm，柱温为30-40℃；更优选流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为30-40℃，等度洗脱、优选洗脱30-50min；
更优选地，以体积比例63-67:37-33的正己烷-乙醇为流动相，柱温为33-37℃；流动相为体积比例65:35的正己烷-乙醇，流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为35℃，等度洗脱时间为40min。
14.根据权利要求13所述质量检测方法，其特征在于，供试品溶液中如有有关物质峰，则以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：有关物质H2的相对保留时间为2.40-2.70、优选为2.58，有关物质H1的相对保留时间为2.00-2.30,、优选为2.16。
15.一种含有权利要求1或2所述物质的药物组合物，所述药物组合物为药物制剂，优选所述组合物为注射用药物制剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述药物制剂包括辅料，优选的是，所述辅料选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂和基质中的一种或两种以上；进一步优选的是，所述辅料选自填充剂和抗氧化剂中的一种或两种以上。
17.如权利要求1或2所述物质或权利要求15或16所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
18.如权利要求16所述应用，其中所述肿瘤为肺癌、肝癌、小细胞肺癌、乳腺癌、血液肿瘤、白血病、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和/或肾癌细胞，优选为Jurkat Clone E6-1、HL-60或THP-1细胞产生的白血病、或者SK-NEP-1细胞产生的肾癌。
CN201910209475.4A 2019-03-19 2019-03-19 具有结构式h1、h2的铂类物质、制备及其应用 Pending CN111718377A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910209475.4A CN111718377A (zh) 2019-03-19 2019-03-19 具有结构式h1、h2的铂类物质、制备及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910209475.4A CN111718377A (zh) 2019-03-19 2019-03-19 具有结构式h1、h2的铂类物质、制备及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111718377A true CN111718377A (zh) 2020-09-29

Family

ID=72562999

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910209475.4A Pending CN111718377A (zh) 2019-03-19 2019-03-19 具有结构式h1、h2的铂类物质、制备及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111718377A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115078559A (zh) * 2022-03-24 2022-09-20 杭州佰辰医学检验所有限公司 一种基于单四极杆质谱的维生素d快速检测方法、试剂盒和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5023335A (en) * 1988-01-09 1991-06-11 Asta Pharma Aktiengesellschaft 1,2-bis (aminomethyl) cyclobutane-platinum complexes
CN102020679A (zh) * 2010-11-24 2011-04-20 贵州益佰制药股份有限公司 一种以草酸盐制备洛铂三水合物的方法
CN103467528A (zh) * 2013-08-21 2013-12-25 江苏奥赛康药业股份有限公司 一种洛铂的制备方法
CN105440082A (zh) * 2014-06-20 2016-03-30 贵州益佰制药股份有限公司 一种洛铂晶体、制备方法及药物应用
CN106974903A (zh) * 2016-01-18 2017-07-25 贵州益佰制药股份有限公司 洛铂在制备治疗恶性滋养细胞肿瘤药物中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5023335A (en) * 1988-01-09 1991-06-11 Asta Pharma Aktiengesellschaft 1,2-bis (aminomethyl) cyclobutane-platinum complexes
CN102020679A (zh) * 2010-11-24 2011-04-20 贵州益佰制药股份有限公司 一种以草酸盐制备洛铂三水合物的方法
CN103467528A (zh) * 2013-08-21 2013-12-25 江苏奥赛康药业股份有限公司 一种洛铂的制备方法
CN105440082A (zh) * 2014-06-20 2016-03-30 贵州益佰制药股份有限公司 一种洛铂晶体、制备方法及药物应用
CN106974903A (zh) * 2016-01-18 2017-07-25 贵州益佰制药股份有限公司 洛铂在制备治疗恶性滋养细胞肿瘤药物中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘萍萍等: "洛铂诱导顺铂耐药卵巢癌SKOV3/DDP细胞的凋亡", 《肿瘤防治研究》 *
孟祥骏: "洛铂非对映异构体体内分析方法的建立、应用及洛铂对细胞色素P450酶的抑制作用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
陈维: "腹腔热灌注化疗对胃癌VX-2细胞腹腔转移的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115078559A (zh) * 2022-03-24 2022-09-20 杭州佰辰医学检验所有限公司 一种基于单四极杆质谱的维生素d快速检测方法、试剂盒和应用
CN115078559B (zh) * 2022-03-24 2024-05-28 杭州佰辰医学检验所有限公司 一种基于单四极杆质谱的维生素d快速检测方法、试剂盒和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3380456B1 (en) Complex of angiotensin receptor antagonist and neutral endopeptidase inhibitor
EP3647312B1 (en) Crystal form of deuterated azd9291, preparation method therefor, and use thereof
CN108779126A (zh) 2-[(2s)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-2-基]-6-(3-甲基-1h-吡唑-4-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(3h)-酮半水合物的结晶形式
EP3549932A1 (en) New crystal forms of {[5-(3-chlorophenyl)-3-hydroxypyridine-2-carbonyl]amino}acetic acid and preparation method therefor
CN116143842A (zh) 氧化异阿朴菲生物碱与n-杂环卡宾的环金属铱配合物及其合成方法和应用
CN110997666A (zh) N-甲酰基帕博西尼及其制备方法和用途以及帕博西尼制剂及其质量控制方法
US9889112B2 (en) Lobaplatin crystal, preparation method and pharmaceutical application
CN111718377A (zh) 具有结构式h1、h2的铂类物质、制备及其应用
CN111721842B (zh) 洛铂中有关物质的检测方法
CN105440082B (zh) 一种洛铂晶体、制备方法及药物应用
CN105198932B (zh) 洛铂二水合物、制备方法及药物应用
EP4342897A1 (en) Pharmaceutically acceptable salt of pyrazoloheteroaryl derivative and crystal form thereof
CN111721841B (zh) 与洛铂有关物质的检测
EP3461823B1 (en) Pexidartinib hydrochloride crystal forms, preparation method therefor and use thereof
CN111718373A (zh) 具有式（i）结构的铂类化合物、制备及其应用
CN111718376B (zh) 具有式（j）结构的铂类化合物、制备及其应用
CN111721840B (zh) 洛铂中有关物质的检测
CN111718375A (zh) 具有g1和g2结构的铂类物质及其制备方法和应用
CN105218587B (zh) 一种洛铂晶体、制备方法及药物应用
CN105440083B (zh) 一种洛铂晶体、制备方法及药物应用
CN118561815A (zh) 一种三氟乙基取代吲哚的苯胺嘧啶化合物及其盐的结晶
CN111718378B (zh) 具有式(k)结构的铂类化合物、制备及其检测方法
CN111718379A (zh) 具有l1和l2结构的铂类物质及其制备方法和应用
CN105330702B (zh) 一种洛铂晶体、制备方法及药物应用
CN105198933B (zh) 一种洛铂晶体、制备方法及药物应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination