CN103734008A

CN103734008A - 一种蝴蝶兰组织培育快速繁殖用液体培养基及相应培养方法

Info

Publication number: CN103734008A
Application number: CN201310730161.1A
Authority: CN
Inventors: 李道强; 李培泰
Original assignee: LIUZHOU SAITE BIOLOGICAL TECHNOLOGY RESEARCH DEVELOPMENT CENTER
Current assignee: GUANGXI SENXIANYUAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2033-12-26
Also published as: CN103734008B

Abstract

本发明提供一种蝴蝶兰组织培养快速繁殖用液体培养基，是将不含有琼脂粉的培养基放入耐高温的过滤海绵中得到的。其制备方法：1）将不含有琼脂粉的培养基放入耐高温的过滤海绵中，得到液体培养基；2）将液体培养基灭菌冷却；3）将蝴蝶兰分切成单芽插种到耐高温的过滤海绵中进行初代培养；4）初代材料增殖培养；5）当蝴蝶兰增殖材料培养一段时间后，转接入新的液体培养基中继续培养，培养方法与步骤（4）中相同，直到生产出所需数量；6）将蝴蝶兰分切成单株转接到添加有琼脂粉的固体培养基中进行生根培养。本发明能有效降低褐化的产生，利于培养物对营养成份的吸收；一个周期可使蝴蝶兰继代材料的增殖率达到5-6倍，并能降低生产成本。

Description

一种蝴蝶兰组织培育快速繁殖用液体培养基及相应培养方法

技术领域

本发明属于植物细胞或组织技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰组织培育快速繁殖用液体培养基及相应培养方法。

背景技术

目前蝴蝶兰工厂化组织培育快速繁殖方式中均采用添加有琼脂粉的固体培养基进行植物组织培养。具体方法是：在配制好的营养液中添加适量的琼脂粉，加热混合均匀后定容分装到培养瓶中，经高温高压灭菌冷却后形成固体状（类似果冻）培养基，然后将蝴蝶兰继代材料接种于固体培养基上进行增殖培养，当培养到一定时间（一般为30-35天）营养液基本耗尽或褐化较严重时，将材料夹出分切成单芽重新转接到新鲜的固体培养基中继续培养，此后不断重复以上步骤进行增殖培养，当增殖材料达到所需的量时即可将材料转接到生根培养基中培养成完整的植株。

上述方法的缺点是：添加琼脂粉作为培养物的支撑体进行固体培养，由于固体培养基中分子或离子运动较慢，培养物释放出来的醌类物质扩散较慢，大部分都积累在材料基部，褐化严重，影响培养物对养分的吸收，因此降低了材料的增殖率（一般一个周期30-35天的增值率仅为2-3倍）；且固体培养基分装配制、洗瓶等工序也比较繁杂，从而增加了生产成本（据估算每株蝴蝶兰生根瓶苗的生产成本约为1.2元）。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种蝴蝶兰组织培育快速繁殖用液体培养基及相应培养方法，能有效降低褐化的产生，利于培养物对营养成份的吸收；一个周期30-35天可使蝴蝶兰继代材料的增殖率达到5-6倍，同时，降低生产成本。

本发明提供一种蝴蝶兰组织培养快速繁殖用液体培养基，是将不含有琼脂粉的培养基放入耐高温的过滤海绵中得到的。

优选地，所述耐高温的过滤海绵上开有孔，孔的数量为每600ml的透气螺旋盖组培瓶底面积上有14-16个孔，优选为15个孔。

开孔数量少则浪费培养空间，开孔数量多则不利于植株生长，根据实验，14-16个孔都能很好的进行培养，15个孔为最佳培养密度。

优选地，所述耐高温的过滤海绵厚度为0.8-1.5cm；优选1cm。

过滤海绵过厚会造成材料的浪费，过滤海绵过薄培养基的营养不足够，影响蝴蝶兰的生长。

优选地，所述耐高温的过滤海绵上开有口径为0.5-1.0cm，深度为0.5-1.0cm的孔；优选口径为0.8cm，深度为0.8cm。

口径和深度在此范围使最有利于蝴蝶兰的生长。

本发明的第二个目的是提供一种蝴蝶兰组织培育快速繁殖方法，步骤如下：

1) 将不含有琼脂粉的培养基放入耐高温的过滤海绵中，得到液体培养基；

2) 将液体培养基灭菌、冷却；

3) 将蝴蝶兰分切成单芽插种到耐高温的过滤海绵中进行初代培养；

4) 初代材料的增殖培养；

5) 当蝴蝶兰增殖材料培养一段时间后，转接入新的液体培养基中继续培养，培养方法与步骤（4）中相同，直到生产所需数量；

6) 将蝴蝶兰分切成单株转接到添加有琼脂粉的固体培养基中进行生根培养。

优选地，步骤（1）中将耐高温的过滤海绵放入透气螺旋盖组培瓶中，将不含琼脂粉的培养基放入透气螺旋盖组培瓶，得到液体培养基。

优选地，步骤（3）中所述培养的前期进行暗培养7-10天，之后光照强度从1000LX慢慢加强到3000LX，光照时间为每天8-10小时。

优选地，步骤（4）和（5）所述培养的前期进行暗培养5-7天，后期光照强度为2000-3000LX，光照时间为每天8-10小时。

优选地，步骤（6）中所述培养的前期进行暗培养5-7天，后期慢慢加强光度到3000-5000LX，光照时间为每天10-12小时。

本发明通过用耐高温的过滤海绵作为培养物的支撑体进行液体培养，由于液体培养基中分子或离子运动较快，蝴蝶兰培养物培养过程中所释放的醌类物质能够较快扩散到液体培养基中，从而有效降低褐化的产生，利于培养物对营养成份的吸收；一个周期30-35天可使蝴蝶兰继代材料的增殖率达到5-6倍；同时液体培养基分装配制、洗瓶等工序也比较方便；又因为培养基中不添加琼脂粉，从而省去购买琼脂粉的费用，且耐高温的过滤海绵可以重复利用，从而降低了生产成本（据估算每株蝴蝶兰生根瓶苗的成本约为0.7元）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。如无特别说明，“%”指质量百分比。

本发明的一种蝴蝶兰组织培育快速繁殖方法步骤如下：

（一）海绵液体培养基的制作

选择圆柱形的耐高温过滤海绵，直径与螺旋盖透气组培瓶底部大小一致，螺旋盖透气组培瓶选择通用规格为600ml的透气螺旋盖组培瓶，海绵厚度为1cm即可，在海绵上面均匀开有15个口径为0.8cm，深度为0.5cm大小的V形孔，开孔数量少则浪费培养空间，开孔数量多则不利于植株生长，根据实验，15个孔为最佳培养密度；将海绵块平放在培养瓶底部，开孔的一面朝上。

本发明的液体培养基对培养基的具体组分没有具体要求，与现有技术中相应的配方的不同点仅在于不加入琼脂粉，其余组分均相同。如加入琼脂粉，则需要加热琼脂粉才能溶解完全，不加琼脂粉则不需加热可直接搅拌均匀即可分装到组培瓶；且因为不加入琼脂粉，培养基不会凝固，由此制成液体培养基。因不加琼脂粉，本发明可直接用自来水溶解培养基的各组分，并经定容调好pH值即成培养基，一般培养基的pH值为5.6-5.8，最后将培养基适量分装到上述制备的放有海绵的螺旋盖透气组培瓶中，使培养基刚刚浸泡完海绵块即得到本发明所述的液体培养基。

（二）培养基的灭菌、冷却

由于选用的海绵为耐高温材料，主要成分为聚氨酯，具有抗腐蚀、无毒副作用、耐高温（可达200℃）、强度高（回弹性好）、吸水性极强，可回收利用等优点，经过多次高压灭菌后不变形仍可重复使用。将分装好的培养基经高压灭菌（灭菌温度为121-123℃，压力为0.11-0.13MPa，时间为22-25分钟），冷却至室温，最后将灭菌好的液体培养基放到培养基储藏室备用。

（三）培养材料的选择

经试验本发明的液体培养基及应用其培养蝴蝶兰的方法均适用于所有品种的蝴蝶兰的组织扩繁，本申请以蝴蝶兰两个红花品种（超群火鸟和火凤凰）为试材，取上述两个品种的花梗腋芽作为外植体的取材部位进行试验。

（四）培养材料的消毒

将剪下来的花梗，用沾有75%酒精的棉花球将花梗外表的灰尘等擦拭干净，然后以节为单位将花梗切成段（芽节的上段留0.5CM，下段留长点1.0CM，并将老梗和嫩梗分好等级，以便消毒时好把握消毒的时间），最后将腋芽上的苞叶去除，并用解剖刀把节与芽相连处的污物清除干净，置于超净工作台上准备进行消毒。将处理好的花梗材料放入无菌广口瓶中，加入0.1%HgCl-吐温80溶液中消毒10-15分钟（一般老梗须消毒15分钟，较嫩的为10分钟），扭紧瓶盖并不断的摇动瓶子，使消毒液能充分接触外植体，提高消毒效果。消毒时间到时，将材料取出，置于无菌水中冲洗3-5次即可准备接种。

（五）接种及初代培养：

在无菌工作台上，将消毒好的蝴蝶兰诱导材料两头再分别切去部分旧的切口，然后插种到海绵液体培养基的V形孔中，由于刚诱导的材料较少，每瓶培养基中接种最多不要超过两个，避免材料消毒不彻底造成污染浪费，且要使外植体的芽眼向上露出，利于养分和光源的吸收；由于海绵有很好的回弹性和吸水性，对插在V形孔中的培养材料有一定的固定作用和保湿功能，利于培养物的生长和养分的吸收。花梗腋芽的最佳诱导培养基为1/2MS+BA5 mg/L+NAA0.2 mg/L+10%椰水+0.1%活性炭+2.5%白糖，pH值为5.6-5.8，培养温度为25-28℃，前期进行暗培养7-10天（可适当减少褐化的产生），等腋芽萌动后可慢慢加强光照，一般从1000LX慢慢加强到3000LX，光照时间为每天8-10小时。

（六）初代材料的增殖培养

当初代材料培养30-35天后，腋芽已经萌动并分化出丛生芽，此时即可将丛生芽从花梗上切下接种到新鲜的液体增殖培养基中进行增殖培养；最佳增殖培养基为1/2MS+BA4 mg/L+NAA0.4 mg/L+10%椰水+0.1%活性炭+2.5%白糖，pH值为5.6-5.8，培养温度为25-28℃，前期也进行暗培养5-7天（可适当减少褐化的产生），后期光照强度为2000-3000LX，光照时间为每天8-10小时。培养在海绵液体培养基上的蝴蝶兰材料，由于液体培养基中分子或离子运动较快，其基部能够充分接触到营养液并能较好的吸收养分，同时也将自身切口分泌出来的醌类有害物质稀释到液体培养基中，大大地减少了褐化的产生，从而达到快速增殖的效果，一般培养30-35天后增殖率可达到5-6倍。经观察对比发现，在液体培养基中培养物的基部基本看不到褐化的产生，证明培养物分泌的醌类物质已经扩散到液体培养基中；而在固体培养基中培养物的周围基本变成了褐色，且越接近培养物基部褐化就越严重。

(七) 增殖材料的转接

当蝴蝶兰增殖材料在液体培养基中培养30-35天后，培养材料不断地增殖生长，已经吸收了大部分的营养成份和水分，同时液体培养基中也积累了一定的醌类等有害成分；此时应将增殖后的蝴蝶兰材料挟出分切再接种到新鲜的液体增殖培养基中继续进行增殖培养，培养方法与上述增殖培养相同。此后当培养到30-35天时，不断地将蝴蝶兰材料进行分切更换到新鲜的液体增殖培养基中进行增殖培养，即可使生产达到一定数量和规模。

（八）生根培养

当蝴蝶兰增殖材料转接到生产所需的数量后，将其分切成单株转接到添加有琼脂粉的固体培养基中进行生根培养，生根培养基为1/3MS+IBA0.2 mg/L+NAA0.5 mg/L+0.2%活性炭+4.5%香蕉汁+2.0%土豆汁+2.0%白糖+0.5%琼脂粉，pH值为5.6-5.8，培养温度为26-30℃，前期进行暗培养5-7天（可适当减少褐化的产生），后期慢慢加强光度到3000-5000LX，光照时间为每天10-12小时。经过2～3个月培养炼苗后即可出瓶移植。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蝴蝶兰组织培养快速繁殖用液体培养基，是将不含有琼脂粉的培养基放入耐高温的过滤海绵中得到的。

2.根据权利要求1所述的蝴蝶兰组织培养快速繁殖用液体培养基，其特征在于：所述耐高温的过滤海绵上开有孔，孔的数量为每600ml的透气螺旋盖组培瓶底面积上有14-16个孔，优选为15个孔。

3.根据权利要求1或2所述的蝴蝶兰组织培养快速繁殖用液体培养基，其特征在于：所述耐高温的过滤海绵厚度为0.8-1.5cm；优选1cm。

4.根据权利要求1或2所述的蝴蝶兰组织培养快速繁殖用液体培养基，其特征在于：所述耐高温的过滤海绵上开有口径为0.5-1.0cm，深度为0.5-1.0cm的孔；优选口径为0.8cm，深度为0.8cm。

5.一种蝴蝶兰组织培育快速繁殖方法，步骤如下：

（1）将不含有琼脂粉的培养基放入耐高温的过滤海绵中，得到液体培养基；

（2）将液体培养基灭菌、冷却；

（3）将蝴蝶兰分切成单芽插种到耐高温的过滤海绵中进行初代培养；

（4）初代材料的增殖培养；

（5）当蝴蝶兰增殖材料培养一段时间后，转接入新的液体培养基中继续培养，培养方法与步骤（4）中相同，直到生产出所需数量；

（6）将蝴蝶兰分切成单株转接到添加有琼脂粉的固体培养基中进行生根培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（1）中将耐高温的过滤海绵放入透气螺旋盖组培瓶中，将不含琼脂粉的培养基放入透气螺旋盖组培瓶，得到液体培养基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述耐高温的过滤海绵上开有孔，孔的数量为每600ml的透气螺旋盖组培瓶底面积上有14-16个孔，优选为15个孔。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述培养的前期进行暗培养7-10天，之后光照强度从1000LX慢慢加强到3000LX，光照时间为每天8-10小时。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（4）和（5）中所述培养的前期进行暗培养5-7天，后期光照强度为2000-3000LX，光照时间为每天8-10小时。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（6）中所述培养的前期进行暗培养5-7天，后期慢慢加强光度到3000-5000LX，光照时间为每天10-12小时。