CN103725776A - 一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法 - Google Patents
一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法属于一种基因突变的实时荧光定量检测方法。该方法将real-time PCR技术与ARMS技术结合，通过特殊的引物设计，大大降低了引物二聚体对检测过程的干扰，提高了检测的灵敏度和准确率。同时，采用SYBR GreenⅠ染料法可以降低检测的成本。
Description
技术领域
本发明设计分子生物学领域，具体涉及一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法。
背景技术
灰霉病是露地、保护地作物常见且比较难防治的一种真菌性病害，属低温高湿型病害。灰霉病由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染所致，属真菌，半知菌亚门葡萄孢属。该病菌的寄主多达230余种，除侵染番茄的果实外，还可侵染番茄的茎、叶、花，造成严重减产，甚至绝收。该病发生早、蔓延快、危害重、损失大，严重影响蔬菜生产。目前，对于农作物的灰霉病，生产上以化学防治为主。传统的杀菌剂主要有苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N-苯氨基甲酸酯类、苯胺基嘧啶类等，但国内外报道灰霉病菌对常用化学杀菌剂已经产生不同程度的抗药性。啶酰菌胺是德国巴斯夫公司开发的新型烟酰胺类内吸性杀菌剂，是线粒体呼吸链中琥珀酸辅酶Q还原酶抑制剂，投入使用时间相对较短，对灰葡萄孢菌的杀灭效果比较好。但是仍然有少数地区产生了啶酰菌胺抗性突变菌株，其突变主要为细胞色素b的272位密码子突变，影响了铁硫蛋白第三个Fe-S簇，即H272Y，密码子由CAC突变为TAC。
目前在检测植物真菌抗药性突变时，采用的主要方法有菌株培养法、直接测序法、传统扩增耐突变系统即ARMS法、Taqman-ARMS法等。其中，菌株培养法和直接测序法费时费力，周期很长，而传统ARMS法、Taqman-ARMS法等相对有时间短、效率高等特点，但是又有非闭管式反应、只能定性检测、成本高等方面的缺点。目前很少有人将SYBR Green ⅠReal-Time PCR技术应用于点突变检测。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR相对于其他检测方法有一个明显的优势就是检测的灵敏度高，样本中只有几个拷贝的模板时仍然可以检测到，比Taqman实时荧光定量PCR还要高一个数量级，同时SYBR GreenⅠ法的成本与Taqman法相比也大大降低。但是，正是由于其检测灵敏度非常高，PCR过程中产生的引物二聚体会对检测结果产生很大影响，假阳性结果非常严重。这使得该方法检测低拷贝数模板时的灵敏度不高。
对于田间菌株，在ARMS技术的基础上，结合SYBR Green real-time PCR技术，能够实现对SdhB不同基因型的快速鉴定，大大降低检测的成本，提高检测的灵敏度。同时，由于本方法为闭管式反应，提取DNA后的步骤均在PCR管中进行，不需将PCR管打开，减少了污染的可能性。本方法可以为田间用药提供技术指导。
发明内容
本发明是在已知灰葡萄孢菌对啶酰菌胺抗药性突变的基础上，发明的一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法。本发明无需将菌株进行特殊处理，直接将样本提取DNA后即可用于检测，根据检测的结果即可得知样本的基因型，检测的准确率可达到95%以上。同时由于本发明相对于其它点突变检测方法能够大大降低成本，因此对于及时采取科学有效的措施控制灰霉病的发展流行，具有一定的实用价值。
本发明采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术由于引物二聚体的大量扩增，导致非特异性特别强，从而对低拷贝数的模板定量非常不准或者完全无法定量。本发明中设计的引物在扩增中产生的引物二聚体少，使得本方法最低能够检测到几十个拷贝数的模板分子。
本发明依据传统ARMS-PCR技术原理，野生型ARMS引物的3’末端碱基只与野生型模板匹配，在扩增突变型模板时的扩增效率会大大降低；突变型ARMS引物的3’末端碱基只与突变型模板匹配，在扩增野生型模板时的扩增效率会大大降低。在引物3’末端倒数第二、三、四位引入的额外错配碱基能够进一步降低扩增非特异性模板时的效率，对于特异性模板的扩增效率基本保持不变，从而使得ARMS引物在扩增模板时能够将两种模板区分开来。
本发明突出的优点是：⑴准确率高。通过独特的引物设计，能够将准确率提高到95%以上。⑵减少了检测的工作量，降低检测所需的成本，适合高通量检测。⑶检测所需时间短，仅需6小时。⑷闭管检测，能够减少污染的可能性。
本发明的目的是这样实现的：
一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法，其体系包括PCR缓冲液、Taq DNA扩增酶、SYBR GreenⅠ荧光染料、dNTP、用于检测模板中所有SdhB基因的通用引物对、用于检测模板是否为野生型基因的ARMS引物对、用于检测模板是否为突 变型基因的ARMS引物对。采用UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司，提取待测样品的基因组DNA。
所述三对引物的上游引物序列一致，均为：SEQ ID NO:15’CAG AAG GAA GAG AAT ACT TG3’；优选的，所述通用引物的下游引物序列为：SEQ ID NO:25’TCGAGCAGTTGAGAATAGTG3’；优选的，所述扩增野生型基因ARMS引物的下游序列为:SEQ ID NO:45’GAG CAG TTG AGA ATA GTG CG3’；优选的，所述扩增突变型基因ARMS引物的下游序列为:SEQ ID NO:125’GAGCAGTTGAGAATAGAG TA3’。
进行三组PCR反应，其中第一组用通用引物对来扩增全部SdhB基因，作为检测的阳性对照，反应的混合液用如下方式配制：
将通用引物上游引物，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环。
第二组用扩增野生型基因ARMS下游引物对来扩增模板，反应的混合液用如下方式配制：
将第一对ARMS引物上游引物，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环。
第三组用扩增突变型基因ARMS下游引物对来扩增模板，反应的混合液用如下方式配制：
将第二对ARMS引物上游引物，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环。
根据PCR反应的Ct值即可确定样本中是否为H272Y突变基因型。如果通用引物扩增与野生型ARMS引物扩增的Ct值接近，而突变型ARMS引物扩增的Ct值比较大或者无，则样本为野生型；如果如果通用引物扩增与突变型ARMS引物扩增的Ct值接近，而野生型ARMS引物扩增的Ct值比较大或者无，则样本为突变型。
附图说明：
图1通用引物扩增SdhB基因野生型不同浓度梯度(106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、103copy/μL、102copy/μL)的扩增曲线
图2通用引物扩增SdhB基因H272Y突变型不同浓度梯度(106copy/μL、105copy /μL、104copy/μL、103copy/μL、102copy/μL)的扩增曲线
图3野生型ARMS引物扩增SdhB基因野生型不同浓度梯度(106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、103copy/μL)的扩增曲线
图4野生型ARMS引物扩增SdhB基因H272Y突变不同浓度梯度(106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、103copy/μL)的扩增曲线。其中，106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、103copy/μL的扩增曲线已经和阴性对照的扩增曲线重叠，说明野生型ARMS引物对于SdhB基因H272Y突变型模板不扩增
图5突变型ARMS引物扩增SdhB基因野生型不同浓度梯度(106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、103copy/μL、102copy/μL)的扩增曲线。其中106copy/μL、105copy/μL的扩增曲线还可以区分，104copy/μL、103copy/μL、102copy/μL的扩增曲线与阴性对照的扩增曲线重叠，说明突变型ARMS引物对于SdhB基因野生型模板不扩增
图6突变型ARMS引物扩增SdhB基因H272Y突变不同浓度梯度(106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、103copy/μL、102copy/μL)的扩增曲线
图7实施案例1中Ct值对照图
图8实施案例2中Ct值对照图
具体实施方式
实施案例1、检测SdhB基因未发生突变的野生型菌株
采用UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司，提取待测样品的基因组DNA。进行三组PCR反应，其中第一组用通用引物对来扩增全部SdhB基因。反应的混合液用如下方式配制：
将反应的上游引物SEQ ID NO:1，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环。
第二组用扩增野生型基因ARMS下游引物对来扩增全部SdhB基因。反应的混合液用如下方式配制：
将反应的上游引物SEQ ID NO:1，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环。
第三组用扩增突变型基因ARMS下游引物对来扩增全部SdhB基因。反应的混合液用如下方式配制：
将反应的上游引物SEQ ID NO:1，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共 40个循环。
检测结果与预期一致，通用引物扩增的Ct值为23，野生型ARMS引物扩增的Ct值为25，突变型ARMS引物扩增和阴性对照的无Ct值（图7）。野生型ARMS引物扩增的Ct值与通用引物扩增的Ct值接近，据此可以确定模板为野生型菌株。
实施案例2、检测SdhB基因发生突变的菌株
采用UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司，提取待测样品的基因组DNA。进行三组PCR反应，其中第一组用通用引物对来扩增全部SdhB基因。反应的混合液用如下方式配制：
将反应的上游引物SEQ ID NO:1，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环。
第二组用扩增野生型基因ARMS下游引物对来扩增全部SdhB基因。反应的混合液用如下方式配制：
将反应的上游引物SEQ ID NO:1，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数 为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环。
第三组用扩增突变型基因ARMS下游引物对来扩增全部SdhB基因。反应的混合液用如下方式配制：
将反应的上游引物SEQ ID NO:1，浓度为5mM，0.5μL与蔗糖溶液，质量分数为20%，0.5μL、SYBR GreenⅠ，浓度为25×，1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭。此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层。
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环。
[0049] 检测结果与预期一致，通用引物扩增的Ct值为19，野生型ARMS引物扩增的Ct值为31，突变型ARMS引物扩增的Ct值为21，阴性对照的扩增都无Ct值（图8）。突变型ARMS引物扩增的Ct值与通用引物扩增的Ct值接近，据此可以确定模板为发生突变的菌株。
灰葡萄孢菌SdhB基因（GenBank: AY726619.1）
Claims (3)
1.一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法，其特征在于共分两步：
第一步：提取待测样品的基因组DNA；
第二步：运用三对引物，包括一对通用引物、两对ARMS引物，进行三组实时荧光定量PCR反应；
所述通用引物的序列为：
上游引物：SEQ ID NO:15’CAG AAG GAA GAG AAT ACT TG3’
下游引物：SEQ ID NO:25’TCG AGC AGT TGA GAA TAG TG3’
所述第一对ARMS引物的上游引物与通用引物的上游引物相同，为SEQ IDNO:1，下游引物为下列引物之一：
SEQ ID NO:35’GAG CAG TTG AGA ATA GTG CG3’
SEQ ID NO:45’GAG CAG TTG AGA ATA GTG AG3’
SEQ ID NO:55’GAG CAG TTG AGA ATA GTC AG3’
SEQ ID NO:65’GAG CAG TTG AGA ATA GTT AG3’
SEQ ID NO:75’GAG CAG TTG AGA ATA GCG AG3’
SEQ ID NO:85’GAG CAG TTG AGA ATA GAC TG3’
所述第二对ARMS引物的上游引物与通用引物的上游引物相同，为SEQ IDNO:1，下游引物为下列引物之一：
SEQ ID NO:95’GAG CAG TTG AGA ATA GTG CA3’
SEQ ID NO:105’GAG CAG TTG AGAATA GTGGA3’
SEQ ID NO:115’GAG CAG TTG AGA ATA GTCTA3’
SEQ ID NO:125’GAG CAG TTG AGA ATA GAG TA3’
SEQ ID NO:135’GAG CAG TTG AGA ATA GACTA3’
PCR反应体系的配制及扩增程序：
⑴通用引物的扩增：
反应混合液的配制：
将浓度为5mM的通用引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入上述PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；
⑵第一对ARMS引物的扩增
反应混合液的配制：
将浓度为5mM的第一对ARMS引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；
⑶第二对ARMS引物的扩增
反应混合液的配制：
将浓度为5mM的第二对ARMS引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；
PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；
根据三组反应的循环阈值即Ct值，即可准确鉴定待测菌株是野生型还是H272Y突变型；
上述PCR反应体系的配制及扩增程序中采用的dNTP均包括A,T,C,G四种核苷酸，四种核苷酸的浓度分别为6mM。
2.根据权利要求1所述的一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法，其特征在于：
在第二步中所述第一对ARMS引物的下游引物为SEQ ID NO:4。
3.根据权利要求1所述的一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法，其特征在于：
在第二步中所述第二对ARMS引物的下游引物为SEQ ID NO:12。
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