CN103710301A - 小鼠胚胎肝基质细胞km3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途。具体是KM3细胞经过10μg/ml的丝裂霉素C处理2h后，在液氮中冻存60d，复苏后细胞可作为人胚胎干细胞传代培养的饲养层细胞，支持人胚胎干细胞稳定传代。

Description

小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途

技术领域

本发明涉及小鼠胚胎肝基质细胞KM3的新用途，是经处理后直接可用作人胚胎干细胞稳定传代培养的饲养层细胞。

背景技术

人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）培养体系依据是否使用饲养层可分为两种，一种是饲养层培养体系，另一种是无饲养层培养体系。无饲养层培养体系中需添加各种细胞因子，试剂价格相对昂贵，稳定传代还有待观察，所以在大规模培养hESCs性价比并不高。饲养层培养体系是普遍采用的方法，小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonic fibroblasts，MEF）是最经典和最常用的饲养层细胞，但其制备过程繁琐，细胞增殖有限，5-6代后就不宜再作为饲养层。我们从小鼠胚胎肝中得到了一株永生化小鼠胚胎肝基质细胞系（命名为KM3），其可以支持hESCs的稳定生长和传代【Jiabo Hu,Sanqiang Hu,Quanhui Ma,Xiaohui Wang,Zhongwei Zhou,Wei Zhang,Xiaochun Sun,Wei Zhu,HuiQian,WenrongXu.Immortalized mousefetal liver stromal cells supportgrowth and maintenance of human embryonic stem cells,Oncology Reports,2012,28(5):1385-1391.】，但在人胚胎干细胞培养过程中，需要不断传代维持新鲜KM3，费时，费力，影响因素多。我们的目的就是制备一种可以保存并且可以即时利用的hESCs饲养层细胞。

发明内容

为了保证人胚胎干细胞的稳定连续培养，本发明提供一种可用于人胚胎干细胞传代培养的饲养层细胞，使人胚胎干细胞的培养更高效、简便和经济。

本发明选择适合的丝裂霉素C浓度，在适合的丝裂霉素C浓度下，处理KM3细胞，将处理后的细胞在液氮中冻存60d之后对其进行复苏。复苏后的细胞形态学与新鲜处理的细胞未见明显的差别，可以支持人胚胎干细胞的稳定传代。

本发明公开了小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途。

具体地，KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞可直接作为人胚胎干细胞的饲养层使用。

本发明还提供了一种人胚胎干细胞饲养层的制备方法，是将KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞作为人胚胎干细胞的饲养层。

具体地，当KM3细胞融合度达到80%-90%时，细胞经过10μg/ml的丝裂霉素C处

理后，在液氮中冻存60d，在60d内任意时间复苏，即得到人胚胎干细胞的饲养层。

本发明有益效果是：丝裂霉素C处理的KM3细胞冻存60d后可以直接作为饲养层细胞支持人胚胎干细胞稳定传代。

附图说明

下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。

图1是KM3饲养层细胞经过10μg/ml丝裂霉素C处理。

图2是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层细胞HE染色。

图3是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层细胞培养7天之后生长状态。

图4是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层支持人胚胎干细胞生长情况。

具体实施方式

实施例：

实验方法

1.KM3细胞冻存25cm²培养瓶内KM3细胞培养至80%-90%融合时，弃掉营养液，加入2ml浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理，置37℃培养箱2h。弃丝裂霉素C，用PBS洗5次,每次2min。0.25％胰酶消化1min,800rpm离心5min，弃上清，收集KM3细胞，将预先配好的冻存液（FBS：DMSO=9:1）7.5ml加入收集的KM3细胞管中，混匀，冻存管分装（分装5管,毎管1.5ml），程序降温，4℃30min,-20℃2h，-70℃过夜，然后于液氮中冻存60d。

2.KM3细胞复苏以及台盼蓝染色60d之后，从液氮中取出冻存管，立即将其置于37℃水浴中，不断摇匀，待融化后，将其吸入到预先加入2ml的离心管中，混匀，继续加6.5ml10%NBS DMEM，补足至10ml,混匀，800rpm离心5min，弃上清，加1ml10%NBS DMEM重悬，取90ul细胞悬液与10ul0.4%台盼蓝溶液充分混匀，充入计数板，在三分钟内计数蓝色和未染蓝色的细胞，共计数500个细胞，重复三次，拒染率（%）=拒染细胞数/细胞总数x100%，以拒染的4.0x10⁵个/孔KM3细胞种入6孔板中，置37℃,5%CO₂培养箱过夜。

3.HE染色复苏后的细胞培养至第四天的时候进行HE染色：取出细胞爬片，细胞面朝上，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定20min，蒸馏水洗3次，每次5min,苏木素染色6min,用自来水洗去多余染料，1%盐酸酒精分色2s，自来水洗30s，蒸馏水过洗2s，0.5%伊红染液染色2min，自来水冲洗多余染料，室温干燥，油镜拍照。

4.人胚胎干细胞传代以及碱磷酶染色取出温箱中的hESCs，慢慢吸掉培养瓶中的营养液，加1mg/mlⅣ胶原酶2ml，以覆盖细胞为宜，置37℃培养箱消化。待40min时镜下观察，见hESC团块边缘卷起时（可有部分团块脱落，同时也可见部分细胞团未卷边）将Ⅳ型胶原酶吸出，加2ml hESCs培养液[20%Knockout SR,78%Knockout DMEM,1%非必需氨基酸，1%L-谷氨酰胺+β-巯基乙醇(称取0.073g L-谷氨酰胺用PBS完全溶解至5ml，再加入3.5ulβ-巯基乙醇混匀后用0.22μm无菌小滤器过滤备用),b-FGF4ng/ml]于培养瓶中，用滴管轻轻吹打，将hESCs细胞团吹打起，将细胞悬液吸入另一离心管中，重复2次，镜下观察有无hESCs细胞团，若hESCs细胞团多，则可用Ⅳ型胶原酶按上述方法再消化1次。hESCs细胞悬液静置5min后，用滴管将上清尽量吸出弃掉，再加2ml hESCs培养液后重悬，自然沉降5min，弃上清。加2ml hESCs培养液后重悬，用滴管吹打，将hESCs细胞团吹打成小细胞团（切勿将细胞团吹太小，否则细胞团不易长大成团）。在hESCs传代前，吸掉6孔板中的培养液，加入hESCs培养液2ml，将hESCs以1:8的比例种入6孔板中，镜下观察hESCs细胞团大小，混匀，让细胞团分布均匀。37℃，5%CO₂培养箱中培养48h后换液，以后每天换液1次，4d传代1次。共连续传代5次，每次传代方法相同，以丝裂霉素C处理但未冻存的KM3为对照。第5代时进行碱性磷酸酶染色，按照试剂盒操作（试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司）。

实验结果：

1、KM3饲养层细胞经10μg/ml丝裂霉素C处理2h时后，1d的形态见图1A，2d的形态见图1B，3d的形态见图1C，7d的形态见图1D，可稳定维持7天。

2、KM3经丝裂霉素C处理，直接作为人胚胎干细胞饲养层细胞的HE染色（油镜），见图2A；KM3饲养层细胞经丝裂霉素C处理，液氮冻存60d后，饲养层细胞的HE染色（油镜），见图2B。两种饲养层细胞形态未见明显区别，细胞胞体呈长梭形，胞浆呈红色，胞质颗粒较少，核呈蓝色，椭圆形，核膜清晰。

3、KM3经丝裂霉素C处理，直接作为人胚胎干细胞饲养层细胞连续培养7d的细胞形态，见图3A。KM3经丝裂霉素C处理，液氮冻存60d后，作为人胚胎干细胞饲养层细胞连续培养7d的细胞形态，见图3B。两种饲养层细胞形态变化不明显，呈长梭形，略有不规则。

4、KM3经丝裂霉素C处理，直接作为人胚胎干细胞饲养层细胞，人胚胎干细胞在饲养层的形态，见图4A，碱磷酶染色见图4C。KM3经丝裂霉素C处理，液氮冻存60d后，人胚胎干细胞在饲养层的形态，见图4B,磷酶染色见图4D。饲养层上面的团块生长状态良好，呈鸟巢状，排列紧密，与饲养层细胞界限明显，单个细胞体积较小，核大，胞质少，核质比高，核仁明显，碱磷酶染色呈阳性，两者未见明显差异。

Claims (5)

1.小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞可直接作为人胚胎干细胞的饲养层使用。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，当KM3细胞融合度达到80%-90%时，细胞经过10μg/ml的丝裂霉素C处理后，在液氮中冻存60d，在60d内任意时间复苏，均可支持人胚胎干细胞的生长。

4.一种人胚胎干细胞饲养层的制备方法，其特征在于，将KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞作为人胚胎干细胞的饲养层。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当KM3细胞融合度达到80%-90%时，细胞经过10μg/ml的丝裂霉素C处理后，在液氮中冻存60d，在60d内任意时间复苏，即得到人胚胎干细胞的饲养层。

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